生物化学与分子生物学进展-血管新生平衡调控

血管新生的平衡调控：87332128gaogq

问题的提出和思考☆机体在什么情况下需要长出新的血管？☆机体哪些部位没有血管，为什么？☆肿瘤生长的必要条件是什么？☆肿瘤转移的必要条件是什么？☆肿瘤治疗有哪些基本策略？☆的主要 原因是什么？第一节血管新生和血管增生性疾病一、血管新生的概念：☆

从已存在的毛细血

上大量生成新生血管的过程☆可来源于局部内皮细胞、造血干细胞/内皮祖细胞、肿瘤干细胞☆血管新生的过程：多步骤复杂的过程，包括选择性降解血管基膜和周围的细胞外基质、内皮细胞增殖和迁移、最后形成毛细血管芽。和促☆

在

和外周循环闭塞情况下具有恢复进伤口愈合的积极作用☆肿瘤等血管增生性疾病的主要病理特征之一和其他血☆以血管增生为靶点正成为治疗管增生性疾病的研究热点肿瘤血管增生与肿瘤生长☆实体性肿瘤的生长依赖于血管增生☆新生血管长入前呈线性增长（血管前期或浸润前期）☆新生血管长入肿瘤即呈指数生长（肿瘤血管期）☆新生血管长入不仅提供肿瘤生长需要的营养物质和氧气以及带走代谢废物，还为肿瘤细胞提供生长因子如FGF-1和FGF-2等☆机械性阻断或应用血管增生抑制剂 肿瘤的显著抑制甚至完全

肿瘤的生长血管增生与肿瘤转移☆血管生成不仅是肿瘤生长所必需，而且还是肿瘤细胞发生转移所需要☆新生毛细血管的内皮细胞能胶原酶和组织纤溶酶原激活物，促进基质降解，便于肿瘤细胞脱落进入血管和向邻近基质扩散☆血管前期，循环中极少有肿瘤细胞，但在肿瘤血管化后，肿瘤细胞才持续出现在循环中史超过十新生血管性眼病☆

眼表新生血管

变全球1000万，中国100万☆

性视网膜病变有

患者近两千万人，年者约50%并发视网膜病☆新生血管性眼病是西方国家致盲的首位因素第二节血管增生的分子机制一、新生血管形成的平衡失调假说☆性视网膜病变一、新生血管形成的平衡失调假说※根据这一理论，抑制新生血管的策略有：

拮抗血管生成刺激因子

应用血管生成抑制因子以纠正病理性平衡失调※拮抗血管生成刺激因子拮抗血管增生刺激因子主要围绕对VEGF的阻断

中和VEGF的单克隆抗体已进入临床使用☆Bevacizumab

（商品名:Avastin）☆Genentech公司开发的人源VEGF单克隆抗体☆FDA

批准上市☆用于一线治疗晚期结直肠癌☆是世界上首个批准上市的VEGF抑制剂獒合VEGF受体2的单克隆抗体进入临床III期试验VEGF抗体、VEGF受体的螯合蛋白及反义寡核苷酸显著抑制视网膜和虹膜血管增生拮抗血管增生刺激因子主要围绕对VEGF的阻断可溶性VEGF-R

½酪氨酸激酶抑制剂（RTKs）☆广谱的抗肿瘤效果☆SU5416

，VEGFR-2（KDR/Flk-1）的RTKs☆对VEGFR-2、FGFR-1和PDGFR-β均有抑制作用☆SU5416显示了广泛的抗肿瘤活性，但毒副作用严重存在问题：只阻断VEGF的作用仅能部分抑制肿瘤和血管增生性眼病的血管新生；阻断VEGF的正常生理作用；肺栓塞、心肌梗死和脑血管意外等严重毒副反应※应用血管生成抑制因子目前国外有300多种抑制血管增生的药物处于临床试验的不同阶段，这类药物大致可以分为5大类：抑制基底膜降解的药物；直接抑制内皮细胞的药物；抑制血管生长因子活化的药物；抑制内皮细胞整合素/生存信号的药物；其他机理不明但有抗血管增生作用的药物※作用于血管内皮细胞的内源性抑制因子是研发焦点：作用于血管内皮细胞，副作用小，不易产生抗药性仅作用于增殖的血管内皮细胞，抑制新生血管，对已有正常血管无影响研究最早的两个内源性血管增生抑制因子：☆Angiostatin、Endostatin的发现☆抑制肿瘤生长☆1999年批准治疗实体瘤I期临床试验（EntraMed

公司）☆2002年终止James

Watson

：人类将在两年内治愈血管增生抑制因子的发现（angiostatin

&endostatin)angiostatin—

Lewis

lungcarcinoma（小鼠Lewis

肺癌）endostatin—hemangioendothelioma(小鼠血管内皮细胞瘤)机体可以产生内源性抑制因子——endostatin,

angiostatin,

K5,

PEDF…内源性抑制因子的地位和作用机制尚不明确Judah

Folkman.

Nature

review,6:273-286,

2007.基础研究成果转化为临床应用nch

to

Bedside)※Endostatin作用受到质疑：

两个独立的课题组将Endostatin

导入小鼠体内，在体内得到了高表达，但高表达的Endostatin既未能阻断血管增生也未能抑制肿瘤生长

在 已进行的不到200例

中至今无一例治愈或效果显著的报告，临床试验结果不理想FDA取消了扩大Endostatin临床试验例数的计划2002年3月Science

评论“setbacks

for

endostatin”，认为Endostatin的作用仍具有不确定性，尚需

的研究来明确Endostatin自身及其作用机制2006年sFDA批准恩度（Eｎｄｏｓｔａｒ）上市※现有内源性抑制因子存在问题：

分子量大，性质不稳定；原核表达体系多为无活性、不溶性蛋白沉淀治疗较直接应用活性多肽的途径效果差分子机制不明确：结构和功能关系尚需深入研究；特异性受体尚未分离出来；胞内信号转导通路不清临床应用抗血管治疗的耐药性靶向性较差、血管拟态、肿瘤微环境的改变、多种刺激因子等抗血管治疗的副作用阻断VEGF的正常生理作用；肺栓塞、心肌梗死和脑血管意外等严重毒副反应血管抑制因子临床疗效不明显临床应用的新问题和对策（

Bedside

to

Bench)的新问题：二、血管新生刺激因子☆血管新生刺激因子包括表皮生长因子（EGF），碱性成纤维生长因子（bFGF），转化生长因子（TGF），血小板源生长因子（PDGF），胰岛素样生长因子（IGF）和血管内皮生长因子（VEGF）等☆

VEGF作为最强的内皮细胞特异性刺激因子，在多种血管增生性眼病中起 作用☆以VEGF作为刺激因子的代表，介绍其在血管生成中的作用和分子机制1.

VEGF结构特征，长度为☆VEGF在

上定位于6p，为单一14kb，含8个外显子和7个内含子☆VEGF通过两对链间二硫键形成反平行同型二聚体☆转录时mRNA可剪接成5种异构体，分别为VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206☆异构体之间功能上的差异表现为它们与细胞表面和细胞外基质中肝素结合活性不同☆VEGF165具有肝素结合活性，约50%以可溶性形式分泌至细胞外，其余的部分和细胞膜或基底膜上含有肝素或硫酸乙酰肝素的蛋白多糖紧密结合☆VEGF165这种可溶与不溶的形式符合机体对血管形式应答调节机制，当机体需要时，即以较大限度的可溶性形式存在；一旦血管形成应答过度，又以不溶形式结合到基膜上，减少其危害；☆VEGF165体内表达丰度最高，也是体外研究中主要的生物学活性形式蛋白，不与肝素结合，易☆VEGF121为可溶性扩散☆VEGF189和VEGF206活性相同，与肝素结合活性很高，几乎完全与细胞和细胞外基质结合，在细胞外液

中测不到溶解游离形式☆虽然5种异构体均能诱导体内的血管生成，但不同情况下每种异构体发挥不同的优势，何种类型的细胞产生何种VEGF异构体尚待研究2.VEGF受体结构特征☆VEGF受体主要有两种：VEGF受体1（fms-liketyrosine

kinase,

Flt-1）和VEGF受体2（fetalliver

kinase

1/kinase

insert

-containing

receptor，Flk-1/KDR）☆表达基本局限于血管内皮细胞上，都为穿膜蛋白，含有7个细胞外免疫球蛋白样功能区，一个跨膜区和一个细胞内酪氨酸激酶功能区☆VEGF与其受体结合，通过VEGFRs二聚化，受体酪氨酸激酶激活，促使底物磷酸化而产生化学趋化性、促进细胞有丝、肌动蛋白重组、促进内皮细胞增殖、提高血管通透性、改变细胞外基质的作用☆VEGF与受体的结合力与受体是否是聚合形式密切相关，聚合是强大亲和力产生的重要因素☆KDR是VEGF发挥主要功能的受体。VEGF与其受体结合的能力依赖于细胞表面肝素或肝素样分子的存在☆KDR在与VEGF的亲和力、结合VEGF后所引起的受体磷酸化作用、结合后所引起的细胞反应、与肝素的结合力等许多方面作用都强于F1t-13.低氧对VEGF表达的影响及低氧诱导因子1（HIF-1）的调控作用☆低氧主要通过活化VEGFmRNA稳定性，上调VEGF的转录和增加VEGF表达从而促进血管新生☆低氧或缺血条件下，HIF-1能增加一些

如红细胞生成素(EPO)和VEGF 的转录，增加氧输送能力；葡萄糖转运体和糖酵解酶 的转录；胰岛素生长因子

的转录，促进细胞的生存☆HIF-1是由α和β亚单位组成的异源二聚体，其中

HIF-1α是专一调节O2的HIF-1亚单位，决定了HIF-1的活性调控VEGF表达的信号通路4.VEGF在细胞内信号传导通路5.VEGF及其受体在血管新生中的作用和机制☆通过增强血管的渗透性,引起血浆蛋白(主要是纤维蛋白原)的外渗,为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供了最佳的基质☆与受体结合,发挥其特异性的内皮细胞原的活性，诱导血管内皮细胞的增殖☆VEGF提高血浆活化因子和尿激酶类纤维蛋白原活化因子表达，促进蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子的活化，具有促进血管构建作用,诱导血管形成☆肿瘤细胞 的VEGF以旁 的形式作用于血管内皮上的特异受体,诱导血管新生促进肿瘤的生长和转移☆VEGF可能通过自促进肿瘤细胞自身的生长：某些肿瘤细胞自身确有一定量的VEGF表达；在Kaposi肉瘤细胞中检测到高水平的flt-1和KDR；抑制VEGF的表达能显著抑制瘤细胞的生长三、血管新生抑制因子内源性血管生成抑制因子：☆

蛋白质 中的一些成员丝氨酸蛋白酶抑制剂 （serine

proteinaseinhibitor，serpin

super

family）中的PEDF，KBP，antithrombin，maspin等。重点介绍PEDF☆蛋白质大分子前体的水解产物

angiostatin，K5，endostatin，tumstatin等重点介绍K5PEDF（pigment

epithelium-derived

factor）☆

由Tombran-Tink从 视网膜色素上皮细胞培养液中分离出来，视网膜基质中以较高浓度存在17p13,但不具备抗蛋☆分子量

50KD，

位于☆属于丝氨酸蛋白酶抑制剂白酶活性☆神经亲和保护作用；抑制血管增生；代谢调节……1.PEDF的抑制血管增生活性☆Dawson于1999年首次发现PEDF具有很强的抑制血管增生的作用,是维持角膜，玻璃体等眼内组织无血管形成的主要原因☆是血管生成最有效的天然抑制剂，比血管抑素、内皮抑素活性更高☆Gao等在视网膜新生血管大鼠模型中检测到视网膜组织VEGF的含量较正常对照组升高5倍，PEDF的

含量下降了2倍，显示出在视网膜病理新生血管形成中，血管抑制剂与血管刺激剂之间的平衡被打破2.PEDF抗血管增生机制☆PEDF促进血管内皮细胞凋亡☆体外实验,人血管内皮细胞培养液中凋亡阳性细胞数随PEDF剂量的增加而增加☆体内实验,PEDF处理的高氧动物的视网膜凋亡内皮细胞与未处理相比高8倍，对已存在的正常血管内皮细胞无反应，说明PEDF仅对活化的血管内皮细胞起作用☆PEDF与胶原蛋白－І和肝素有高度亲和性，提示PEDF可能作用于细胞粘附分子，即靶向细胞外基质来调节其抑制血管内皮细胞增生的活性☆与其他血管因子的相互作用：PEDF下调VEGF表达；K5上调PEDF、下调VEGF表达☆机制尚有许多疑问：是否存在PEDF特异性受体；PEDF抑制内皮细胞的信号转导通路等3.PEDF与肿瘤的关系☆PEDF抗肿瘤活性：诱导肿瘤细胞分化；抑制血管生成；促进Schwann

细胞及神经节细胞产生

的PEDF，可能是神经母细胞瘤自然好转的缘故☆

癌组织中PEDF含量显著下降或缺如☆在黑色素瘤细胞系中首次检测到PEDF

的缺失17p13.1,肿瘤可能是抑癌☆PEDF

均位于发生与该区域关系密切,提示PEDF或是肿瘤相关4.PEDF治疗血管增生性眼病☆

lmach等腹腔内注射重组PEDF显著抑制了早产

性视网膜病（ROP）小鼠模型的视网膜血管增生☆Mori等在三种不同的眼血管增生模型中眼内输送

AdPEDF取得显著疗效：激光诱导的色素膜损伤所致脉络膜新生血管(CNV)鼠模型；rhodopsin/VEGF转鼠；ROP小鼠模型☆AdPEDF眼内输送不仅抑制视网膜和脉络膜新生血管形成，还可逆转已形成的新生血管☆FDA批准PEDF

治疗进入Ⅰ期临床试验（2003年）K5（plasminogen

kringle

5）1.K5结构特点：☆人纤溶酶原是分子量为92

kD的糖蛋白，由5个通过二硫键连接的联环结构域（kringle）构成，每个联环结构域由80个氨基酸组成，含3个二硫键，形成双环状构象☆纤溶酶原水解片段K1、K2、K3、K5、K1-3、K1-4、K2-3等均能抑制内皮细胞增生，K4不具有抗增殖活性，却有明显抑制内皮细胞迁移的作用☆K1-4即血管抑制素，angiostatin☆K5是抑制内皮细胞增殖和迁移最有效的纤溶酶原片断☆K5是血纤溶酶原中与血管抑素相连的联环结构域，由80个氨基酸残基组成，包含3个二硫键，分子量为16kD☆在结构上与其它4个联环区相似，具有较高的同源性，其中与K1同源性最高，为57.5％。K5与K1结构上的相似性可能与它们都有较强的抑制内皮细胞增殖活性相关☆完整的kringle结构是保证血管抑素抗内皮细胞增殖所必需☆kringle结构对K5活性的影响则有不同的看法2.K5作用的分子机制☆kringle5抗血管增生的研究是建立在血管抑素基础之上，二者可能有相似的抗血管增生的分子机制☆K5能特异性地作用于血管内皮细胞，使细胞周期停滞，并能诱导内皮细胞凋亡☆K5选择性抑制内皮细胞迁移是其抗血管增生的重要环节☆K5能通过抑制HIF-1和p42/p44MAPK的活性下调内源性血管刺激因子VEGF的表达☆提高内源性血管增生抑制因子PEDF的表达，有利于已打破的血管增生平衡恢复正常，K5对正负血管因子的调节是其抗血管增生的主要机制☆内皮细胞上是否存在K5的特异性受体目前看法不一：有研究表明在培养内皮细胞上没有检测到K5特异性受体，同时K5也不能

与VEGF受体的相互作用；最近有 认为人内皮细胞上电压依赖性阴

离子通道VDAC和HSP

成员GRP78是K5结合的受体☆K5和血管抑素抑制内皮细胞增殖机制可能通过细胞外基质中某些多糖分子如整合素来发挥作用，因为整合素是维持MAPK活性所必需的☆K5抑制炎症细胞 细胞因子，如血管内皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子及白细胞介素-2等☆K5降低血管通透性研究工作介绍

建立了人和牛原代培养的视网膜血管内皮细胞和外膜细胞（pericytes）的培养方法。HRCECPericyte. J

Biol

Chem,

277(11),

9492-9497,

2002.

首次建立了固定氧浓度诱导的大鼠视网膜血管增生模型，该模型可用于所有以血管增生为治疗靶点的药物活性的筛选并进行定性定量分析。NormalRetinopathy. FEBS

Lett,

489,270-276,2001.NormalRetinopathyGao

et

al.FEBSLett,489,270-276,2001.. FEBS

Lett,

489,270-276,2001.. FEBS

Lett,

489,270-276,2001.

首次发现大鼠对氧诱导的视网膜血管增生存在种系（strain）差异并阐明了这种差异形成的分子机制。P12P14P18SDBN. Diabetes,51(4),

1218-1225,2002.600400200080010001200VEGF/PEDF

Ratio(%

of

Control)P12P14Postnatal

DaysP16BN

ratsSD

rats. Diabetes,51(4),

1218-1225,2002.Strain

Difference

in

VEGF:PEDF

Ratio

证明K5在体外实验中具有特异性抑制血管内皮细胞增生的作用并能在视网膜血管增生大鼠模型中预防和阻断新生血管的形成0204080160806040200100NormoxiaHypoxiaK5(nM)Viable

Cells

(x10,000)Zhang

et

al.

Diabetologia,

44,757-765,

2001.K5

on

HRCEC120PBS

InjectionK5

InjectionGaoet

al.

J

Biol

Chem,

277(11),9492-9497,

2002.

发现K5具有上调PEDF并同时下调VEGF的作用，纠正了病理性低氧状态下内源性血管增生抑制因子和刺激因子之间的平衡失调。同时明确了K5下调

VEGF的信号传导通路通过抑制MAPkinase的活性和HIF－1α的核转位-actinVEGFN

H

40

80

160

320

640300250200150100500VEGF

(%

of

Control)K5

on

VEGF

and

PEDF

Expression

under

HypoxiaH

+

K5

(nM)N

H

40

80

160H+

K5

(nM)6005004003002001000PEDF-actinN

H

40

80

160K5

(nM)N

H

40

80

160

320

640K5

(nM)PEDF

(%

of

Control)28204933kDaN

N+K5H

H+K5-actinVEGF6050403020100N+K5H+K5VEGF

(%

of

Control)78464933kDaN

N+K5H

H+K5PEDF-actin350300250200150100500PEDF

(%

of

Control)N+K5H+K5K5

Regulates

VEGF

and

PEDF

in

the

Retina2.37kb4.418s

RNA140120100806040200VEGF

mRNA(

%

of

Control)kb2.371.3518s

RNA200180160140120100806040200PEDF

mRNA(%

of

Control)PEDFVEGFNormalP<0.01P<0.05PBS K5

PBS

K5RetinopathyNormal

RetinopathyPBS K5

PBS

K5Gaoet

al.

J

Biol

Chem,

277(11),

9492-9497,

2002.Regulation

of

VEGF

and

PEDF

mRNA

Levels

by

K5Normal

Retinopathy Normal

RetinopathyA

positive

feedback

loop

of“VDAC1-AKT-GSK3β-VDAC1”Gu

etal.

Apoptosis,

2012; Li

et

al.

J

Biol

Chem,

2014.※

K5突变体具有更强的抑制视网膜和肿瘤血管新生的作用Structure

of

K5

andits

mutantsK5K5

mut

1K5

mut

2M12

3M12

33

M1

2208001440066200430003100097400M:

protein

marker；1:

the

purified binant

proteins；2:

samples

after

IPTG

induction；3:

samples

before

IPTG

induction.SDS-PAGEysis

of

threebinant

proteinsK5K5

mut1K5

mut2M123144002080097400662004300031000M:

protein

marker；1:purified binant

proteins

of

K5；2:

purifiedbinant

proteins

of

K5

mut1；3:

purified binant

proteins

of

K5

mut2.SDS-PAGE

and

western-blotysisSDS-PAGEysisWestern-blotysisMALDI-TOF

mass

spectraK5K5

mut1K5

mut2Cells

were

treated

with

the binant

K5

and

K5

mut1

at

concentrations

asindicated

for

72

h.

The

viable

cells

were fied

using

the

MTT

assay

(n

=5,*P<0.05,

**P<0.01

vs

control).*********

**Inhibition

of

endothelial

cell

proliferationAnti-migratory

effect

ofK5 and

mut1

on

HRCEC

cells110100908070605040302010controlK5K5

mut1control

K5

K5

mut1Cell

migration

was

examined

in

a

modified

Boyden

Chamber

assay

with

1280

nmol/LK5

or

K5

mut1

treatment.

(

n

=

3.

*

P

<

0.05

vs

control.

as

a

percentage

ofinhibition)Cell

number(%

of

control)**A:

left

retina

from

OIR

ratafter

PBS

injection

as

the

control

ofthe

K5

-treatedgroup.

B:

right

retina

from

OIR

rat

after

the

K5

injection.

C:

leftretina

from

OIR

rat

after

PBS

injection

as

the

controlofthe

K5

mutant-treated

group.

D:

right

retina

from

normal

rat

after

K5-mutant

injection.Inhibition

of

ischemia-induced

retinalneovascularizationABCDPBSK5(100μg)K5mut1(100μg)K5mut2(100μg)60402000viablecells(%

oABCDThe

production

and

anti-angiogenic

activity

assay

of

K5mut3binant

protein.Circular

Dichroism

Spectra

of

K5

and

its

mutants.Li

C,

et

al.

Cornea,

2012.Li

C,

et

al.

Cornea,

2012.以血管生成为靶点治疗肝癌的新型工程候选药物（科技部新药创制重大专项：候选药物研究，150万元，

：2009ZX09103-642）：以血管生成为靶点治疗肝癌的新型工程候选药物临床前研究（科技部新药创制重大专项滚动项目，450万元，

2013ZX09102-053）

发现一种新的血管增生抑制因子-Kallikrein-binding

protein（KBP）

KBP抑制视网膜血管增生、降低血管通透性

KBP抑制胃癌、肝癌生长转移的作用

机制：KBP诱导内皮细胞凋亡；下调内皮细胞和肿瘤细胞表达VEGF；抑制VEGF与受体结合Gao

etal.

Diabetologia,

46,

689-698,

2003Gao

etal.

Diabetologia,

46,

689-698,

2003Gao

etal.

Diabetologia,

46,

689-698,

2003KBP

inhibits

growth

of

transplanted

human

gastric

carcinomaC.

A age

of

61.4%

suppression

of

primary

tumor

growthD.

Tumor

growth

curvesKBP

inhibits

growth

and

metastasis

of

orthotopic

humangastric

carcinomaB.

A age

of

52.3%suppression

of

primary

tumorgrowth

after

6

weeks

treatmentC.

Representative

macroscopicaland

microscopical

pictures

formetastases

of

liver

(1

and

4),

lymphnode

(2

and

5)

and

perito

(3and

6).KBP

reduces

angiogenesis

of

heterotopic

and

orthotopic

gastric

tumor

tissuesKBP

inhibits

tumor

growth

in

grafted

hepatocarcinomamice(A)

Tumor

tissues

treated

with

PBS

(Up)

and

KBP

(Bottom)

at

day

15

fromthe