免疫学检验-9-酶免疫技术课件

第九章酶免疫技术

第九章酶免疫技术1概述酶免疫技术:用酶标记的抗原或抗体作为诊断试剂检测标本中相应的抗体或抗原。

抗原抗体反应＋酶催化反应（特异性）（很少量的酶即可导致大量的催化过程，所以极为敏感）概述酶免疫技术:用酶标记的抗原或抗体作为诊断试剂检测标本2概述该方法将抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用原理有机地结合，通过酶催化底物进而发生一系列的化学反应，使溶液呈现出颜色反应（使底物基质水解而呈色，使供氢体由无色还原型变为有色氧化型，可用呈色反应显示酶的存在），从而显示抗原抗体特异性反应的存在。概述该方法将抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用原理有机3概述检测方法：肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计、酶标仪等。可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在μg、甚至ng水平上对其进行定量。特点：灵敏度高、特异性强、准确性好、适用范围广。酶标记试剂能够较长时间保持稳定，操作简便、对环境没有污染，易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。

概述检测方法：肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计、4

第一节酶免疫技术的分类

酶免疫组化用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体，定位

酶免疫技术均相酶免疫测定

酶免疫测定

液相酶免疫测定异相酶免疫测定固相酶免疫测定ELISA高敏感、高特异，几乎所有可溶性抗原抗体系统均可用该法检测用于检测液体样品中微量可溶性抗原或抗体，定性或定量。第一节酶免疫技术的分类高敏感、高特异，几乎所有可溶性抗5根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标记物分离，分为均相和异相。均相：酶标抗原+非标记抗原+限量抗体，酶标记物发生抗原抗体反应后，酶活性减弱或增强。异相：反应后，分离形成复合物的酶标记物并检测。根据是否采用固相材料以吸附抗原或抗体分为液相和固相。液相：待测抗原+酶标抗原+抗体，一次性温育待测抗原+抗体，温育，加酶标抗原，温育固相：固相载体预先吸附抗原或抗体，在其表面反应根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标记物分离，分为均相6第二节酶联免疫吸附试验enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验。简便、快速、敏感、特异、实验设备简单、应用范围广、无同位素污染。第二节酶联免疫吸附试验enzymelinkedimm7一、基本原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面（固相化抗原或抗体,免疫吸附剂），并保持其免疫活性。使抗原或抗体结合到某种酶（酶结合物：酶标抗原或抗体），并保持其免疫活性和酶催化活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相化Ag或Ab起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。一、基本原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面（固相化抗原或8二、ELISA方法类型

可用于测定抗原，也可用于测定抗体。常用方法：

1.抗原测定方法：

双抗体夹心法、双位点一步法、竞争法

2.抗体测定方法：

间接法、双抗原夹心法、捕获法测IgM抗体、中和法、

竞争法二、ELISA方法类型可用于测定抗原，也可用于测定抗体。9（一）双抗体夹心法：测抗原最常用EEEE固相抗体待测抗原显色酶标抗体阴性标本阳性结果：（一）双抗体夹心法：测抗原最常用EEEE固相抗体待测抗原显10

特点：非竞争结合反应。常用于抗原的检测。适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。如：乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等。所用两种抗体针对同一个抗原分子的相同抗原决定簇。特点：11（二）双位点一步法

应用两个针对不同表位的单克隆抗体作双抗夹心法测定，两步抗原抗体反应同时进行且不互相干扰。结果判断同双抗体夹心法。（二）双位点一步法12特点：非竞争结合反应。常用于抗原的检测。仅适用于具有两个或两个以上不同表位的抗原检测。当待测抗原相当高时，出现“钩状现象”（hookeffect)，导致结果偏低。特点：13（三）间接法：测抗体最常用的方法原理：为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定。固相抗原待测抗体酶标抗抗体底物显色阳性结果：（三）间接法：测抗体最常用的方法固相抗原待测抗体酶标抗抗体底14（四）竞争法：用于测定抗原及测定抗体。待测抗原或抗体量与颜色反应呈负相关。测定抗原：测定抗体：固相抗体固相抗原酶标抗原＋待测抗原底物酶标抗体＋待测抗体底物阴性标本显色淡或不显色阳性结果：（四）竞争法：用于测定抗原及测定抗体。固相抗体固相抗原酶标15特点：用于抗原/半抗原(药物、激素等)、抗体的检测。竞争结合反应。酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）竞争结合固相Ab(Ag)。反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比。特点：16（五）捕获法（反向间接法）测IgM抗体：应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体、甲型肝炎HAV-IgM抗体、乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体（五）捕获法（反向间接法）测IgM抗体：应用：病原体急性感染17（六）双抗原夹心法：测抗体EEE固相抗原待测抗体酶标抗原显色阳性结果：（六）双抗原夹心法：测抗体EEE固相抗原待测抗体酶标抗原显色18（七）中和抑制法：常用已知中和抗原测定未知抗体。原理：同竟争法的原理相类似。受检抗体与固相抗体（抗HBe）竞争与中和试剂（HBeAg）结合，因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗体的量成反比。中和试剂固相抗体酶标抗体底物显色淡或不显色（七）中和抑制法：常用已知中和抗原测定未知抗体。中和试剂固相19第三节固相酶免疫测定的技术要点技术要点：试剂的准备在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。反应条件的选择：温度、时间、pH值操作的标准化第三节固相酶免疫测定的技术要点技术要点：20一、试剂的制备主要试剂为：

固相载体抗原或抗体

酶和酶作用底物免疫吸附剂(固相抗原或抗体)

酶标记抗原或抗体(核心)－酶结合物或酶标记物

其他试剂一、试剂的制备21（一）固相载体

要求:

具有较强的吸附蛋白质性能；吸附力强。Ag或Ab吸附其上后保留原来的免疫活性；不影响免疫反应性。固相载体在酶免疫测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。固化方法简便易行、快捷经济。（一）固相载体要求:22（一）固相载体载体种类：塑料制品：材料经济，操作简便，易于自动化，最常用。如：聚苯乙烯、聚氯乙烯。非共价或物理吸附。小试管、小珠、板条。微颗粒：化学耦联，结合容量大，均匀分散在液体中，反应迅速，逐渐普遍用于自动化分析。可磁化，方便分离。如：用于荧光酶免疫测定。膜载体：硝酸纤维素膜（NC）、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微孔滤膜。非共价结合，吸附力强广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA。（一）固相载体载体种类：23载体的形状：小试管小珠微量反应板：最常用。专用于ELISA测定（酶免疫测定的一种）的产品也称为ELISA板。ELISA板要求：吸附性能好；空白值低；孔底透明度高；均一性好。各板之间和同一板各孔之间性能相近。检查法：10μg/LIgG包被，加酶标抗IgG，显色后，测20孔的吸光度值（A），要求CV<10%。载体的形状：24（二）抗体或抗原抗原和抗体的要求：抗原需纯度高;抗原性完整。抗体需效价高、亲和力强、特异性好以及比活性较高，能批量生产，易纯化。（二）抗体或抗原抗原和抗体的要求：25（三）酶和酶作用底物

1.所用酶的要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强。来源丰富、价格不贵、性质稳定。制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。受检标本中不存在与标记酶相同的酶。相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。（三）酶和酶作用底物1.所用酶的要求262.常用酶及其底物最常用的酶为：

辣根过氧化酶（HRP）:最常用

碱性磷酸酶（AP）：菌源性AP、肠粘膜AP

β-D-半乳糖苷酶：用于均相酶免疫测定。葡萄糖氧化酶脲酶2.常用酶及其底物27HRP的性质:主酶（糖蛋白，与酶活性无关）+辅基（亚铁血红素，酶的活性中心）在蔬菜作物辣根中含量很高。主酶在275nm波长处有最高吸收峰；辅基在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度：用RZ(纯度数)表示,是403nm的吸光度与280nm吸光度之比。用于标记的HRP，RZ≥3.1。酶活力：以单位表示。1min将1μmol的底物转化为产物的酶量为1个单位。HRP的性质:28HRP的常用底物：催化的反应式：

DH2(供氢体)+H2O2(受氢体)

D+2H2O供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种

H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高

HRPHRP的常用底物：供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种29常用的供氢体(底物）：邻苯二胺（OPD）：目前少用。灵敏度高，但不稳定，应避光，致癌性。反应显橙红色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。反应可逆，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则反应显色迅速消退。HRP催化OPD：无色橙红色加终止液(H2SO4)

棕黄色常用的供氢体(底物）：30常用的供氢体(底物）：四甲基联苯胺（TMB）：ELISA中应用最广泛的底物。

高检测敏感性，无需避光，无致癌性，但水溶性差。反应后呈蓝色，加酸终止反应后呈黄色，测定波长450nm。HRP催化TMB:无色蓝色加终止液(H2SO4)

黄色常用的供氢体(底物）：31常用的供氢体(底物）：ABTS：2,2’-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐高灵敏底物，显色不稳定，10mmol/L叠氮钠是较为理想的终止剂。ABTS在目前国内的ELISA试剂盒中基本上没有应用。反应后呈绿色，测定波长414nm。5-氨基水杨酸：5-ASA。反应后呈棕色，测定波长550nm。常用的供氢体(底物）：32HRP催化OPDHRP催化TMBHRP催化OPDHRP催化TMB33AP的底物：对硝基苯磷酸酯(p-NPP)。反应后呈黄色，测定波长405nm。

AP催化对硝基苯磷酸酯的反应如下：AP有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定。AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。AP的底物：对硝基苯磷酸酯(p-NPP)。34β-半乳糖苷酶的底物：其常用底物为：4-甲伞酮基-β-D半乳糖苷（4MUG）反应后生成4-甲基伞形酮（高强度荧光物质），可作荧光测定（用荧光计测量）。β-半乳糖苷酶的底物：35（四）酶标记抗体或抗原酶结合物(EnzymeConjugate)结合物即酶标记的抗体（或抗原），是酶免疫技术中最关键的试剂。结合物要求：技术方法简单、产率高，重复性好。标记反应不影响酶的催化活性，和抗体（或抗原）的免疫活性。酶结合物尚要有良好的稳定性，较少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原的聚合物。（四）酶标记抗体或抗原酶结合物(EnzymeConjuga36制备抗体酶结合物的方法通常有：戊二醛交联法：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。过碘酸盐氧化法：HIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合。本法只用于HRP的交联。制备抗体酶结合物的方法通常有：37纯化的目的：标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度。常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化，50%饱和硫酸铵沉淀提纯。常用的鉴定方法：免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA酶标记率测定：分光光度法酶标记抗体或抗原的纯化及鉴定纯化的目的：标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原38（四）免疫吸附剂（immunosorbent）免疫吸附剂：固相的抗原或抗体。采用非共价键吸附或共价键化学偶联。包被(coating)：将抗原或抗体固相化的过程。一般采用偏碱性（pH9.6）的碳酸盐溶液。4℃过夜或37℃2-6h。封闭(blocking):是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，最常用的封闭剂是1％～5％牛血清白蛋白或5％～20％小牛血清。目的：可防止非特异性地吸附测定时加入的标本和酶标记物中的蛋白质，避免本底偏高。（四）免疫吸附剂（immunosorbent）免疫吸附剂：固39最适工作浓度的选择（反应条件的选择）酶标抗抗体工作浓度：100ng/mlIgG包被，加入稀释的酶标抗抗体，显色后测A值，取A=1.0者。包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法不同稀释度的Ag或Ab包被，做强阳性、弱阳性、阴性对照血清及空白对照。加入工作浓度的酶标抗抗体，显色后测A值，选择强阳性A值为0.8左右，阴性A值小于0.1者的稀释度作为工作浓度。最适工作浓度的选择（反应条件的选择）酶标抗抗体工作浓度：40其他试剂：1、对照品和参考品

阳性对照品（positivecontrol，PC）阴性对照品（negtivecontrol，NC）参考标准品：定量测定时制作标准曲线用2、洗涤液：常用PBS3、终止液：强酸或强碱其他试剂：41二、操作的标准化试剂及标本的准备加样保温（孵育）洗涤显色比色二、操作的标准化试剂及标本的准备42（一）样品的收集和保存1.溶血标本可增加非特异性显色(Hb血红蛋白作用于HRP的辅基)。2.细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-”(破坏Ag或Ab)或假“+”(非特异蛋白)。3.反复冻融可使抗体效价下降而假“-”。4.陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本底增加。5.标本用NaN3防腐，可出现假“-”。（一）样品的收集和保存43（二）试剂的准备

注意不同地区冬、夏温差，可造成达到37℃的时间差异，对弱阳性结果有很大影响。（二）试剂的准备44（三）加样加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

（三）加样45

(四)保温－孵育、温育(incubation)4℃过夜最佳，37℃2h较好，43℃20min可造成弱“+”假“-”。一般均采用水浴箱，较温箱等空气浴均匀，温度迅速平衡。为避免蒸发板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。若用恒温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。(四)保温－孵育、温育(incubation)46（五）洗涤：决定着实验的成败。目的：洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。以达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。洗涤的方式：自动洗涤仪：自动洗板要注意残留液量。手工操作：浸泡式和流水冲洗式。手洗效果最佳。洗涤液：PBS（五）洗涤：决定着实验的成败。47（六）显色对HRP，显色完全需30min,15min只达80%,易造成弱“+”假“-”。比色：单波长比色需设空白孔：OD=OD样品-OD空白双波长比色不需设空白：OD=OD450nm-OD630nm（六）显色对HRP，显色完全需30min,15min只达848（七）结果判定目测法：定性。比色法：定性、定量。比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。用特定的波长测读吸光度值（A）。比色结果：

光密度(opticaldensity，OD):过去常用。吸光度（absorbence，A）:现在通用。结果表示方法：将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。（七）结果判定49固相酶免疫测定仪（酶标仪）测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软件，自动洗板、温育、加样。450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm固相酶免疫测定仪（酶标仪）测定波长、吸光度范围、光学系统、检50免疫学检验-9-酶免疫技术课件51免疫学检验-9-酶免疫技术课件52免疫学检验-9-酶免疫技术课件53比色法：定量（定性）吸光光度法：定性。又称作阴、阳性判断值(COV)法。选择一个A值作为界值（cutoffvalue，COV），用于区别阳性和阴性。如：S/CO≥1判为阳性，S/CO<1判为阴性。

比例法：定性。目前最常用。又称P/N比值法。以A/A0≥2.1表示。（A：样品A值；A0阴性对照A值）阴性对照A值若<0.05，按0.05＋A0计算，如P/N≥2.1为阳性。滴度法：半定量。以出现阳性反应A值大于阴性对照的最高稀释度为该样品的滴度，用稀释度的倒数表示。吸光度值直接表示阳性程度：定性。标准曲线法：定量。结果以绝对量或单位数表示，每次测定都应做标准曲线。比色法：定量（定性）54三、影响ELISA测定的因素

试剂盒因素实验操作中的影响三、影响ELISA测定的因素55

试剂盒因素：A固相材料：孔间不均B抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成(多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗原(与片段的选择和制备水平有关)C酶结合物D色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光)TMB：水溶性差(商品：配好)E运输储存试剂盒因素：56ELISA出现“一片黄”的原因：⑴酶结合物浓度过高⑵底物不新鲜⑶洗涤不干净ELISA出现“一片黄”的原因：57

ELISA出现“一片白”的原因：⑴载体吸附性能差⑵底物错⑶稀释液作包被液⑷加错试剂⑸包被时间过短⑹酶活力低或下降⑺样品含有NaN3。ELISA出现“一片白”的原因：58第四节其他酶免疫技术第四节其他酶免疫技术59一、均相酶免疫测定定义：抗原抗体反应后无需分离结合的和游离的酶标记物而直接测定反应体系中酶活性的方法即为均相酶免疫测定。应用：

主要用于小分子抗原或半抗原的检测。一、均相酶免疫测定定义：60（一）酶扩大免疫测定技术（EMIT）:原理：是半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受影响而活性被抑制。

（一）酶扩大免疫测定技术（EMIT）:61（二）克隆酶供体免疫测定（clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA）

（二）克隆酶供体免疫测定62二、异相酶免疫测定定义：

抗原抗体反应后需分离结合的和游离的酶标记物，而后测定反应体系中酶活性的方法。分类：异相液相酶免疫测定：方法同RIA，但更稳定，无放射性污染。用竞争法，采用酶标抗原、特异性抗体测定抗原的含量。固相酶免疫测定：以

ELISA

法最为常用。二、异相酶免疫测定定义：63

三、膜载体的酶免疫测定＊斑点-ELISA＊免疫渗滤试验＊免疫印迹法三、膜载体的酶免疫测定641.斑点ELISA(dot-elisa)1.斑点ELISA(dot-elisa)652.免疫渗滤试验2.免疫渗滤试验663.免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT）亦被称为Westernblot分三个阶段进行:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）电转移酶免疫定位3.免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT67染色后显出电泳区带染色后显出电泳区带68免疫印迹法免疫印迹法69免疫学检验-9-酶免疫技术课件70免疫学检验-9-酶免疫技术课件71四、BAS-ELISA

--应用亲和素和生物素的ELISA比普通ELISA敏感4-16倍。四、BAS-ELISA72（一）BAS（生物素和亲和素系统）1.生物素（Biotin,B）：又称辅酶R、VitH。主要存在于蛋黄、肝、肾中。活化生物素：生物素经化学修饰后，可成为带有多种活性基团的衍生物。

意义：用以标记蛋白质或核酸。（一）BAS（生物素和亲和素系统）1.生物素（Biotin,732.亲和素（Avidin，AV)：亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白。主要存在于禽蛋、输卵管、青蛙的卵胶中。链霉亲和素（streptavidin,SA)：是由链霉菌分泌的一种酸性蛋白。每分子（链霉亲和素）能结合4个分子的生物素。最常用的标记是酶、FITC、和胶体金。2.亲和素（Avidin，AV)：743.生物素-亲和素系统的特点生物素和亲和素具有独特的结合特性，结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。二者可偶联抗原、抗体、酶等大分子生物活性物质。可极大提高检测方法的灵敏度。适用范围广，实验成本低。3.生物素-亲和素系统的特点75（二）BAS－ELISA的类型A-ELISA固相抗体＋待测抗原＋生物素化抗体＋酶标亲和素＋底物AB-ELISA固相抗体＋待测抗原＋生物素化抗体＋亲和素＋生物素化酶＋底物ABC-ELISA固相抗体＋待测抗原＋生物素化抗体＋亲和素-生物素化酶复合物＋底物（二）BAS－ELISA的类型A-ELISA76桥联法ABC-ELISA（avidinbiotincomplex-ELISA）夹心法测抗原的过程桥联法ABC-ELISA（avidinbiotincompl77（三）BAS－ELISA的应用广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。（三）BAS－ELISA的应用78第五节酶免疫测定的应用

病原体及其抗体检测，广泛应用于传染病的诊断。蛋白质检测：各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物（例如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）、各种血浆蛋白质、同工酶（如肌酸激酸MB）;激素（如HCG、FSH、TSH）的检测。非肽类激素检测：如T3、T4、雌激素、皮质醇等。药物和毒品检测：如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等检测。第五节酶免疫测定的应用79ELISA在食品检测中的应用：食品中微生物的检测食品毒素的检测食品中残留农药的检测食品中残留抗生素的检测转基因食品的检测ELISA在食品检测中的应用：801．酶免疫技术的要点？2．酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？3．竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？4．常用的底物有哪几类？特点？5．常用的酶有哪几类？特点？6．何谓包被与封闭？其作用？7．常用固相载体的种类和特点？8．举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。9．ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？10．对酶免疫技术的应用评价如何？思考题1．酶免疫技术的要点？思考题81

第九章酶免疫技术

第九章酶免疫技术82概述酶免疫技术:用酶标记的抗原或抗体作为诊断试剂检测标本中相应的抗体或抗原。

抗原抗体反应＋酶催化反应（特异性）（很少量的酶即可导致大量的催化过程，所以极为敏感）概述酶免疫技术:用酶标记的抗原或抗体作为诊断试剂检测标本83概述该方法将抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用原理有机地结合，通过酶催化底物进而发生一系列的化学反应，使溶液呈现出颜色反应（使底物基质水解而呈色，使供氢体由无色还原型变为有色氧化型，可用呈色反应显示酶的存在），从而显示抗原抗体特异性反应的存在。概述该方法将抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用原理有机84概述检测方法：肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计、酶标仪等。可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在μg、甚至ng水平上对其进行定量。特点：灵敏度高、特异性强、准确性好、适用范围广。酶标记试剂能够较长时间保持稳定，操作简便、对环境没有污染，易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。

概述检测方法：肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计、85

第一节酶免疫技术的分类

酶免疫组化用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体，定位

酶免疫技术均相酶免疫测定

酶免疫测定

液相酶免疫测定异相酶免疫测定固相酶免疫测定ELISA高敏感、高特异，几乎所有可溶性抗原抗体系统均可用该法检测用于检测液体样品中微量可溶性抗原或抗体，定性或定量。第一节酶免疫技术的分类高敏感、高特异，几乎所有可溶性抗86根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标记物分离，分为均相和异相。均相：酶标抗原+非标记抗原+限量抗体，酶标记物发生抗原抗体反应后，酶活性减弱或增强。异相：反应后，分离形成复合物的酶标记物并检测。根据是否采用固相材料以吸附抗原或抗体分为液相和固相。液相：待测抗原+酶标抗原+抗体，一次性温育待测抗原+抗体，温育，加酶标抗原，温育固相：固相载体预先吸附抗原或抗体，在其表面反应根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标记物分离，分为均相87第二节酶联免疫吸附试验enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验。简便、快速、敏感、特异、实验设备简单、应用范围广、无同位素污染。第二节酶联免疫吸附试验enzymelinkedimm88一、基本原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面（固相化抗原或抗体,免疫吸附剂），并保持其免疫活性。使抗原或抗体结合到某种酶（酶结合物：酶标抗原或抗体），并保持其免疫活性和酶催化活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相化Ag或Ab起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。一、基本原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面（固相化抗原或89二、ELISA方法类型

可用于测定抗原，也可用于测定抗体。常用方法：

1.抗原测定方法：

双抗体夹心法、双位点一步法、竞争法

2.抗体测定方法：

间接法、双抗原夹心法、捕获法测IgM抗体、中和法、

竞争法二、ELISA方法类型可用于测定抗原，也可用于测定抗体。90（一）双抗体夹心法：测抗原最常用EEEE固相抗体待测抗原显色酶标抗体阴性标本阳性结果：（一）双抗体夹心法：测抗原最常用EEEE固相抗体待测抗原显91

特点：非竞争结合反应。常用于抗原的检测。适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。如：乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等。所用两种抗体针对同一个抗原分子的相同抗原决定簇。特点：92（二）双位点一步法

应用两个针对不同表位的单克隆抗体作双抗夹心法测定，两步抗原抗体反应同时进行且不互相干扰。结果判断同双抗体夹心法。（二）双位点一步法93特点：非竞争结合反应。常用于抗原的检测。仅适用于具有两个或两个以上不同表位的抗原检测。当待测抗原相当高时，出现“钩状现象”（hookeffect)，导致结果偏低。特点：94（三）间接法：测抗体最常用的方法原理：为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定。固相抗原待测抗体酶标抗抗体底物显色阳性结果：（三）间接法：测抗体最常用的方法固相抗原待测抗体酶标抗抗体底95（四）竞争法：用于测定抗原及测定抗体。待测抗原或抗体量与颜色反应呈负相关。测定抗原：测定抗体：固相抗体固相抗原酶标抗原＋待测抗原底物酶标抗体＋待测抗体底物阴性标本显色淡或不显色阳性结果：（四）竞争法：用于测定抗原及测定抗体。固相抗体固相抗原酶标96特点：用于抗原/半抗原(药物、激素等)、抗体的检测。竞争结合反应。酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）竞争结合固相Ab(Ag)。反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比。特点：97（五）捕获法（反向间接法）测IgM抗体：应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体、甲型肝炎HAV-IgM抗体、乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体（五）捕获法（反向间接法）测IgM抗体：应用：病原体急性感染98（六）双抗原夹心法：测抗体EEE固相抗原待测抗体酶标抗原显色阳性结果：（六）双抗原夹心法：测抗体EEE固相抗原待测抗体酶标抗原显色99（七）中和抑制法：常用已知中和抗原测定未知抗体。原理：同竟争法的原理相类似。受检抗体与固相抗体（抗HBe）竞争与中和试剂（HBeAg）结合，因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗体的量成反比。中和试剂固相抗体酶标抗体底物显色淡或不显色（七）中和抑制法：常用已知中和抗原测定未知抗体。中和试剂固相100第三节固相酶免疫测定的技术要点技术要点：试剂的准备在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。反应条件的选择：温度、时间、pH值操作的标准化第三节固相酶免疫测定的技术要点技术要点：101一、试剂的制备主要试剂为：

固相载体抗原或抗体

酶和酶作用底物免疫吸附剂(固相抗原或抗体)

酶标记抗原或抗体(核心)－酶结合物或酶标记物

其他试剂一、试剂的制备102（一）固相载体

要求:

具有较强的吸附蛋白质性能；吸附力强。Ag或Ab吸附其上后保留原来的免疫活性；不影响免疫反应性。固相载体在酶免疫测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。固化方法简便易行、快捷经济。（一）固相载体要求:103（一）固相载体载体种类：塑料制品：材料经济，操作简便，易于自动化，最常用。如：聚苯乙烯、聚氯乙烯。非共价或物理吸附。小试管、小珠、板条。微颗粒：化学耦联，结合容量大，均匀分散在液体中，反应迅速，逐渐普遍用于自动化分析。可磁化，方便分离。如：用于荧光酶免疫测定。膜载体：硝酸纤维素膜（NC）、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微孔滤膜。非共价结合，吸附力强广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA。（一）固相载体载体种类：104载体的形状：小试管小珠微量反应板：最常用。专用于ELISA测定（酶免疫测定的一种）的产品也称为ELISA板。ELISA板要求：吸附性能好；空白值低；孔底透明度高；均一性好。各板之间和同一板各孔之间性能相近。检查法：10μg/LIgG包被，加酶标抗IgG，显色后，测20孔的吸光度值（A），要求CV<10%。载体的形状：105（二）抗体或抗原抗原和抗体的要求：抗原需纯度高;抗原性完整。抗体需效价高、亲和力强、特异性好以及比活性较高，能批量生产，易纯化。（二）抗体或抗原抗原和抗体的要求：106（三）酶和酶作用底物

1.所用酶的要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强。来源丰富、价格不贵、性质稳定。制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。受检标本中不存在与标记酶相同的酶。相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。（三）酶和酶作用底物1.所用酶的要求1072.常用酶及其底物最常用的酶为：

辣根过氧化酶（HRP）:最常用

碱性磷酸酶（AP）：菌源性AP、肠粘膜AP

β-D-半乳糖苷酶：用于均相酶免疫测定。葡萄糖氧化酶脲酶2.常用酶及其底物108HRP的性质:主酶（糖蛋白，与酶活性无关）+辅基（亚铁血红素，酶的活性中心）在蔬菜作物辣根中含量很高。主酶在275nm波长处有最高吸收峰；辅基在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度：用RZ(纯度数)表示,是403nm的吸光度与280nm吸光度之比。用于标记的HRP，RZ≥3.1。酶活力：以单位表示。1min将1μmol的底物转化为产物的酶量为1个单位。HRP的性质:109HRP的常用底物：催化的反应式：

DH2(供氢体)+H2O2(受氢体)

D+2H2O供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种

H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高

HRPHRP的常用底物：供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种110常用的供氢体(底物）：邻苯二胺（OPD）：目前少用。灵敏度高，但不稳定，应避光，致癌性。反应显橙红色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。反应可逆，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则反应显色迅速消退。HRP催化OPD：无色橙红色加终止液(H2SO4)

棕黄色常用的供氢体(底物）：111常用的供氢体(底物）：四甲基联苯胺（TMB）：ELISA中应用最广泛的底物。

高检测敏感性，无需避光，无致癌性，但水溶性差。反应后呈蓝色，加酸终止反应后呈黄色，测定波长450nm。HRP催化TMB:无色蓝色加终止液(H2SO4)

黄色常用的供氢体(底物）：112常用的供氢体(底物）：ABTS：2,2’-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐高灵敏底物，显色不稳定，10mmol/L叠氮钠是较为理想的终止剂。ABTS在目前国内的ELISA试剂盒中基本上没有应用。反应后呈绿色，测定波长414nm。5-氨基水杨酸：5-ASA。反应后呈棕色，测定波长550nm。常用的供氢体(底物）：113HRP催化OPDHRP催化TMBHRP催化OPDHRP催化TMB114AP的底物：对硝基苯磷酸酯(p-NPP)。反应后呈黄色，测定波长405nm。

AP催化对硝基苯磷酸酯的反应如下：AP有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定。AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。AP的底物：对硝基苯磷酸酯(p-NPP)。115β-半乳糖苷酶的底物：其常用底物为：4-甲伞酮基-β-D半乳糖苷（4MUG）反应后生成4-甲基伞形酮（高强度荧光物质），可作荧光测定（用荧光计测量）。β-半乳糖苷酶的底物：116（四）酶标记抗体或抗原酶结合物(EnzymeConjugate)结合物即酶标记的抗体（或抗原），是酶免疫技术中最关键的试剂。结合物要求：技术方法简单、产率高，重复性好。标记反应不影响酶的催化活性，和抗体（或抗原）的免疫活性。酶结合物尚要有良好的稳定性，较少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原的聚合物。（四）酶标记抗体或抗原酶结合物(EnzymeConjuga117制备抗体酶结合物的方法通常有：戊二醛交联法：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。过碘酸盐氧化法：HIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合。本法只用于HRP的交联。制备抗体酶结合物的方法通常有：118纯化的目的：标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度。常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化，50%饱和硫酸铵沉淀提纯。常用的鉴定方法：免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA酶标记率测定：分光光度法酶标记抗体或抗原的纯化及鉴定纯化的目的：标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原119（四）免疫吸附剂（immunosorbent）免疫吸附剂：固相的抗原或抗体。采用非共价键吸附或共价键化学偶联。包被(coating)：将抗原或抗体固相化的过程。一般采用偏碱性（pH9.6）的碳酸盐溶液。4℃过夜或37℃2-6h。封闭(blocking):是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，最常用的封闭剂是1％～5％牛血清白蛋白或5％～20％小牛血清。目的：可防止非特异性地吸附测定时加入的标本和酶标记物中的蛋白质，避免本底偏高。（四）免疫吸附剂（immunosorbent）免疫吸附剂：固120最适工作浓度的选择（反应条件的选择）酶标抗抗体工作浓度：100ng/mlIgG包被，加入稀释的酶标抗抗体，显色后测A值，取A=1.0者。包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法不同稀释度的Ag或Ab包被，做强阳性、弱阳性、阴性对照血清及空白对照。加入工作浓度的酶标抗抗体，显色后测A值，选择强阳性A值为0.8左右，阴性A值小于0.1者的稀释度作为工作浓度。最适工作浓度的选择（反应条件的选择）酶标抗抗体工作浓度：121其他试剂：1、对照品和参考品

阳性对照品（positivecontrol，PC）阴性对照品（negtivecontrol，NC）参考标准品：定量测定时制作标准曲线用2、洗涤液：常用PBS3、终止液：强酸或强碱其他试剂：122二、操作的标准化试剂及标本的准备加样保温（孵育）洗涤显色比色二、操作的标准化试剂及标本的准备123（一）样品的收集和保存1.溶血标本可增加非特异性显色(Hb血红蛋白作用于HRP的辅基)。2.细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-”(破坏Ag或Ab)或假“+”(非特异蛋白)。3.反复冻融可使抗体效价下降而假“-”。4.陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本底增加。5.标本用NaN3防腐，可出现假“-”。（一）样品的收集和保存124（二）试剂的准备

注意不同地区冬、夏温差，可造成达到37℃的时间差异，对弱阳性结果有很大影响。（二）试剂的准备125（三）加样加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

（三）加样126

(四)保温－孵育、温育(incubation)4℃过夜最佳，37℃2h较好，43℃20min可造成弱“+”假“-”。一般均采用水浴箱，较温箱等空气浴均匀，温度迅速平衡。为避免蒸发板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。若用恒温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。(四)保温－孵育、温育(incubation)127（五）洗涤：决定着实验的成败。目的：洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。以达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。洗涤的方式：自动洗涤仪：自动洗板要注意残留液量。手工操作：浸泡式和流水冲洗式。手洗效果最佳。洗涤液：PBS（五）洗涤：决定着实验的成败。128（六）显色对HRP，显色完全需30min,15min只达80%,易造成弱“+”假“-”。比色：单波长比色需设空白孔：OD=OD样品-OD空白双波长比色不需设空白：OD=OD450nm-OD630nm（六）显色对HRP，显色完全需30min,15min只达8129（七）结果判定目测法：定性。比色法：定性、定量。比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。用特定的波长测读吸光度值（A）。比色结果：

光密度(opticaldensity，OD):过去常用。吸光度（absorbence，A）:现在通用。结果表示方法：将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。（七）结果判定130固相酶免疫测定仪（酶标仪）测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软件，自动洗板、温育、加样。450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm固相酶免疫测定仪（酶标仪）测定波长、吸光度范围、光学系统、检131免疫学检验-9-酶免疫技术课件132免疫学检验-9-酶免疫技术课件133免疫学检验-9-酶免疫技术课件134比色法：定量（定性）吸光光度法：定性。又称作阴、阳性判断值(COV)法。选择一个A值作为界值（cutoffvalue，COV），用于区别阳性和阴性。如：S/CO≥1判为阳性，S/CO<1判为阴性。

比例法：定性。目前最常用。又称P/N比值法。以A/A0≥2.1表示。（A：样品A值；A0阴性对照A值）阴性对照A值若<0.05，按0.05＋A0计算，如P/N≥2.1为阳性。滴度法：半定量。以出现阳性反应A值大于阴性对照的最高稀释度为该样品的滴度，用稀释度的倒数表示。吸光度值直接表示阳性程度：定性。标准曲线法：定量。结果以绝对量或单位数表示，每次测定都应做标准曲线。比色法：定量（定性）135三、影响ELISA测定的因素

试剂盒因素实验操作中的影响三、影响ELISA测定的因素136

试剂盒因素：A固相材料：孔间不均B抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成(多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗原(与片段的选择和制备水平有关)C酶结合物D色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光)TMB：水溶性差(商品：配好)E运输储存试剂盒因素：137ELISA出现“一片黄”的原因：⑴酶结合物浓度过高⑵底物不新鲜⑶洗涤不干净ELISA出现“一片黄”的原因：138

ELISA出现“一片白”的原因：⑴载体吸附性能差⑵底物错⑶稀释液作包被液⑷加错试剂⑸包被时间过短⑹酶活力低或下降⑺样品含有NaN3。ELISA出现“一片白”的原因：139第四节其他酶免疫技术第四节其他酶免疫技术140一、