生物技术药物质量控制

概述利用人体内的天然物质治疗人类的疾病或达到某种医学效果一直是医学上的一个重要研究领域。20世纪70年代以来产生了DNA重组技术，这种新技术是现代生物技术的主体，近年来首先在医药领域获得了飞速发展。生物技术的应用2/3用于医药，生物技术新型药物和疫苗已有50多种产品投放市场，400多种正在进行临床试验，2000多种在临床前研究。据报道，国外6500万人接受重组乙肝疫苗、100万人接受t-PA治疗，超过50万人使用EPO，每天约有1000万人接受重组人胰岛素的治疗。生物技术产品的生产和管理按生物制品的要求进行，不仅对最终产品的质量实施有效控制，而且特别重视对生产工艺的全过程进行质量控制,其中包括对每个生产步骤的验证、质量检定（QC）、质量保证部（QA）对生产和质量检定的全过程进行严格的管理。1、概念：2、分类｛生物技术药物重组DNA药物重组蛋白质药物采用DNA重组技术或其他新生物技术生产的治疗和预防药物。

1、重组蛋白质或重组多肽药物包括：

细胞因子类：rIFN、IL-2、EPO等；抗细胞素治疗：CD4可溶性受体等；重组溶血栓类：rSK、rSAK等；人源化单克隆抗体制剂；重组疫苗和菌苗制剂。2、重组DNA药物包括：寡核苷酸药物：反义核酸等；基因药物：腺病毒-IL-2、腺相关病毒-凝血Ⅸ因子；腺病毒-P53细胞治疗制剂：抗原致敏的人树突状细胞DNA疫苗：治疗乙型肝炎、爱滋病的核酸疫苗等。我国生物技术药物质量标准研究现状现代医药生物技术的发展以及人类基因组计划的完成和遗传病基因的不断发现，对医药领域产生了巨大影响。自1982年第一个基因重组药物—重组胰岛素上市以来，全世界约有60余种重组产品开发成功，包括基因工程药物、基因工程抗体，重组疫苗、反义核苷酸药物、基因治疗药物、DNA疫苗。我国在“七五”、“八五”、“九五”期间国家“863”高技术项目支持下，先后建立一系列基因重组制品质量标准和质控方法，共完成国家一类、二类新药20余种产品的质量标准研究。生物技术药物质量标准研究的依据一、主要依照《重组DNA产品质量控制要点》、《中国生物制品规程》、《中国药典》等要求进行。二、参考世界卫生组织（WHO）和美国FDA颁布的指南、ICH文件和《欧洲药典》。检定标准、检定方法：准确可靠、切实可行；保证产品安全、有效。生物技术药物质量标准研究的内容1、目标产品的均一性2、建立目标产品生物学活性或免疫学效价测定方法3、研究建立目标产品的免疫学活性的测定方法及质控标准4、研究建立国家标准品或参考品5、建立目标产品生产相关杂质的限量分析方法和标准6、制定出保证上述生物技术产品临床安全、有效、与WHO标准相一致的质量控制标准和规范化的检定方法

研究建立灵敏、稳定的理化性质、纯度、含量的测定方法及质控标准。

研究建立目标产品的生物学功效的测定方法及质控标准；建立用于药物生物学功效检定用的细胞系和动物模型。

运用生化标准化原则，以WHO国际标准品为对照，研制出国家标准品或参考对照品。在效价定义上要求与国际单位一致；没有国际标准品的新药，则根据标准品要求自行研制国家参比品。

外源DNA、菌体蛋白质、细菌内毒素以及病毒、支原体、细菌等在工艺中加入有害物质的检测。重组产品质量控制上存在的难点建立重组药物的生物学活性测定方法；理化测定标准品的稳定性；人源化单抗中的人源化程度检测方法及标准研究；重组人白蛋白等大剂量重组产品安全性评价问题；反义核酸药物理化特性测定和效力测定，即如何评价反义核酸的体内及体外活力；基因治疗药物的安全性评价包括反转录病毒、生物分布和效力测定；DNA疫苗的安全性和效力检测方法研究；干细胞治疗产品的质量标准的建立（干细胞鉴定及活力测定）。我国基因工程产品安全管理

法规和技术指南《传代细胞系生产生物制品的规程》《人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点》《预防用新生物制品临床研究的技术要求》《人用重组DNA制品质量控制要点》《人的体细胞治疗申报临床试验指导原则》《人基因治疗申报临床试验指导原则》《药理毒理检查指导原则》《药品生产质量管理办法》《药品注册管理办法》生物技术药物的质量控制生物技术药物的特点：1、来源：活的生物体（细菌或细胞）；2、结构：复杂（包括组成、空间结构）；3、生产：涉及生物材料和生物学过程（发酵、细胞培养，分离纯化等），有其固有的易变性。生物技术药物的质量控制质量控制包括两个方面：1、生产过程中质量控制GMP（硬件、软件）2、最终目标产品的质量控制（方法学研究）质量控制方法学研究具体内容一、生物学活性测定和比活性二、蛋白质纯度检查三、蛋白质含量测定四、蛋白质药物理化性质的鉴定五、蛋白质的二硫键分析六、对糖蛋白的特殊要求七、残余杂质检查八、安全性及其他检测项目九、生物技术药物待测样品保存一、生物学活性测定和比活性

1、意义：1）基因工程产品的化学本质为蛋白质、多肽，其活性由产品的氨基酸序列或其空间结构所形成的活性中心所决定的，与其绝对质量不一致。2）基因工程产品的生物学活性与药效学基本相一致。3）利用生物学活性建立的测定效价体系，是给药品定量的依据，保证产品药效的重要手段。效价测定一般原则1、国际通用方法；2、测定结果须用国际或国家标准品校正，以国际单位表示。生物学活性测定方法分类1）体外细胞培养测定法

a、促进细胞生长作用（G-CSF:NFS-60）

b、抑制细胞生长作用(TNF:L929)

c、间接保护细胞作用(IFN:VISH;VSV)2）离体动物器官测定法

采用家兔主动脉条测定重组脑利钠肽生物活性。3）体内测定法4）生化酶促反应测定法5）免疫学活性测定法取兔离体动脉条剪成约1.5cm长、2～3mm宽的螺旋环，悬挂于含10mL通氧的37℃台氏液(取NaC18.0g、KC10.2g、CaCl20.2g、NaH2PO40.05g、MgSO4·7H2O0.1g、NaHCO31.0g、Glucose1.0g用蒸馏水配成1000mL的溶液，置于玻璃或塑料瓶中，用1mol·L-1NaOH溶液调pH至7.4)的麦氏浴槽中，加负荷1g，稳定1h，期间每20min换1次台氏液：连接多导记录仪，调节灵敏度，记录血管的张力变化。待张力曲线基线稳定后，加入1.25mg·mL-1盐酸去氧肾上腺素溶液0.05mL于麦氏浴槽中使其终浓度为6.25×10-5mg·mL-1

，曲线升高至最高并稳定后，开始按累计浓度给药法(曲线稳定后对倍增加样品浓度为：6.25×10-5～8.0×10-2RU·mL)加入重组人脑利钠肽对照品，记录血管的张力变化。完成上述给药后，洗脱并稳定1h，期问每20min换1次台氏液。待基线稳定后，按测定对照品的方法测定待测样品，记录测定结果。计算对照品和各实验样品的半效稀释倍数，按下式计算样品效价：样品效价=对照品效价×样品半效稀释倍数／对照品半效稀释倍数

利用动物体内某些指标变化，定出产品的单位，如EPO活性测定，体内注射EPO后，计算小鼠网织红细胞增加的数量与标准品比较，确定其活性单位。

基于产品与某种物质的结合或产品本身的化学反应为原理设计，具有简便、精确、稳定等特点，如重组链激酶、葡激酶生物活性测定，链激酶、葡激酶和纤溶酶原（h-plg）结合形成复合物激活游离h-plg原为有活性的纤溶酶。

利用制品免疫原性，制备相应单克隆抗体或多克隆抗体，采取ELISA法测定其含量。生物学活性测定方法选择体内测定和体外测定方法

a、体内测定：即整体动物测定，能为较大范围的重组产品的效价提供有用信息，但费时、昂贵、难操作及同时存在伦理问题，大多数情况下倾向于选择体外测定方法。

b、体外测定：可使用分离的器官或组织、原代细胞或传代细胞系，目前最常用方法是连续生长、因子依赖的、克隆化的细胞系的方法，其测定结果比较准确、重现性好、经济、容易使用和便于统计分析。生物学活性测定方法选择2、定量、半定量、定性方法

a、通过研究首先选择能够定量评价的方法，最好的选择是背景较低的反应，并且对相关产品有陡峭的、可重复的剂量-反应曲线；其次考虑半定量方法（如NGF），最后考虑定性（如BMP）方法。

b、对生产工艺稳定，生物学活性测定方法复杂，可采用其他替代方法（如重组人生长激素用HPLC定量方法代替复杂生物活性测定方法）。细胞培养法中细胞染色标记方法

3H-thymidine、BrdU是反映DNA合成、增殖细胞数的比例的。BrdU：首先用BrdU做标记，固定细胞，用核苷酸酶处理后使过氧化物酶结合抗BrdU抗体发生反应。

MTT（四氮唑盐）：其在活细胞的线粒体中可以定量地被琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物MTTformazan,二甲基亚砜（DMSO）和酸化的异丙醇或酸化的SDS均能溶解紫色结晶物，通过比色法测定MTTformazan的量可以反映线粒体电子传递系统机能，间接表示细胞的生长状态。

AlamarBlue：氧化型AlamarBlue（600nm）可被活细胞中的线粒体酶还原，还原后染料（570nm）发生颜色和荧光改变，颜色和荧光的深浅与活细胞数成正比，可用分光光度计或荧光检测仪检测。

Crystalviolet：染活细胞后，在比色计中测定光吸收值（A），A值与着染色细胞数成正比。

几种细胞培养测定方法比较

3H-thymidineBrdUMTT AlamarBlue 靶向物DNA合成系统 线粒体电子传递系统

检出细胞的状态增殖 增殖、生存检出法 放射活性 色素、荧光 色素 色素、荧光抽出的必要性 + ++- 其他试剂的必要性+ ++ +- 成本（以MTT为1时） 6080-100（试剂盒）1 2缺点 使用同位素 不适合检出大量未增殖检出未增浮游细胞细胞，处理时费力殖活细胞

生物学活性测定分析方法

1、用能诱导50%最大反应的待测样品最高稀释度作为参考效价（或滴度），或以此稀释度中所含样品的量为1单位，即以此稀释度的倒数为待测样品所含的单位数。

2、比较已知浓度或活性单位样品标准品和待测样品的实验结果。活性标准品待测样品稀释度abA值生物学测定基本模式图蛋白质药物的比活性测定的意义1、比活性：每毫克蛋白质的生物学活性单位。2、蛋白质的空间结构不能常规测定，而它的改变（如二硫键的错误配对）可影响蛋白质的生物学活性，从而影响药效，比活性可以反映此种情况。3、比活性可反映产品生产工艺的稳定情况，可比较不同表达体系、不同生产厂家生产同一产品时的质量情况。4、比活性是重组蛋白质药物不同于化学药的一项重要指标，也是进行成品分装的重要定量依据。生物活性测定标准范围确定1、使用验证过的测定和分析方法，并提供用此方法的效价测定平均值和单测定一批误差的可信限范围。2、对于成品的生物活性测定标准，要根据不同方法的特点规定相当标示量的范围，目前，生物活性的测定方法有四类：动物基础、细胞基础、生化（酶）法、特异（免疫、受体）结合法。

不同生物活性测定方法的规定标准表测定方法规定标准动物基础的生物活性测定70%～130%标示量细胞基础的生物活性测定80%～120%标示量体外酶法的生物活性测定85%～115%标示量受体结合的生物活性测定85%～115%标示量生物学活性效价测定过程中

标准品的作用1、生物学活性测定变异范围大，同样制品在不同实验室测定结果差异很大，必须有一个统一的标准。2、标准品的使用，最大限度地减少实验室之间和各种影响测定因素地干扰。二、蛋白质纯度检查1、蛋白质纯度检查是重组蛋白质药物地重要指标之一。2、按WHO规定必须用HPLC和非还原SDS两种方法测定，其纯度都应达到95%以上，有的甚至要求达到99%以上。3、纯度的检查通常是在原液中进行。4、方法：非还原SDS电泳法、HPLC法、毛细管电泳。非还原SDS电泳法：

1、银染加样量≥5ug（1～10ng）

2、考马斯亮蓝R-250

加样量≥10ug（100ng）结果：无明显杂蛋白带出现；目标蛋白量应不低于总蛋白量的95%或98%。蛋白质样品在荷质比均一。

HPLC法：分子筛、反相层析，离子交换层析，尽量采用与SDS原理不同的反相或离子交换层析，不主张用分子筛分析。毛细管电泳：简便、快速、灵敏度和分辨率高；价格高、重现性差。

几种检定重组蛋白纯度方法的比较特性HPLCSDS、IEFCE分离机制极性、非极性分配，电荷、等电点电荷等分子大小、离子交换分析所需时间10～120min几小时10～30min

分辨力好好好样品体积10～50ul1～50ul1～50nl灵敏度范围ng～ugng～ugpg定量准确性+±+分析方式紫外、荧光、折射紫外（可见、荧光）同HPLC

电化学、放射性银染、放射自显影仪器价格中～高低中～高日常消耗低高低自动化中～高低中～高人力操作低高低制备级中中微量级制备收集样品可以可以较困难

用于研究蛋白质纯度的方法和机制

方法分析机制反相HPLC疏水性疏水性相互作用HPLC疏水性毛细管电泳荷质比离子交换HPLC电荷等电聚焦电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳电荷比

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳电荷，分子大小分子排阻HPLC分子大小质谱测量法分子大小三、蛋白质含量测定1、此项目主要用于原液比活性计算和成品规格的控制。2、可根据物理化学性质采用Folin-酚试剂法（Lowry法）、染色法（Bradford法）、双缩脲法、紫外吸收法、HPLC法和凯氏定氮等方法。灵敏范围：5～100ug/ml；优点：简便、灵敏度较高；不同蛋白质间的变异少；缺点：受多种物质干扰，反应速度慢，某些试剂不稳定。

Bradford法是采用考马斯亮蓝-G250与蛋白质结合的原理，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法；灵敏范围：25～200ug/ul，需要时间：10min。灵敏范围：0.2～2mg/ml简单、省时受光吸收物质影响蛋白浓度（mg/ml）﹦1.55A280-0.76A260

蛋白质常用的定量方法的比较方法所需蛋白质破坏蛋白质/蛋白技术方法的变异的量（mg/ml）与否质变化情况复杂性系数（%）双缩脲0.5～5是少简单、快速5Lowry0.05～5是中等显色慢、试剂多5凯氏定氮0.05～3是少干扰、复杂、慢0.154紫外吸收法0.05～2否大简单、快速、0.439（280nm）干扰物质多染料结合法0.01～0.05是中等简单、快速3.75荧光法0.001～0.01否中等较易3.75四、蛋白质药物理化性质的鉴定特异性鉴别试验相对分子质量测定等电点测定肽图分析吸收光谱氨基酸组成分析N末端和C末端氨基酸测序特异性鉴别试验主要确定蛋白质的抗原性免疫学方法（免疫印迹、斑点免疫、免疫电泳、免疫扩散）：根据抗原抗体特异性反应建立的方法。抗体中和活性抑制法：此法可用于原液和成品的鉴别试验，该方法简便易行、要求抗体必须为中和抗体。相对分子质量测定还原型SDS：蛋白质在SDS和β-巯基乙醇存在下沸水浴5min，形成表面带大量负电荷的杆状分子，降低了分子形态和电荷的影响，在电泳过程中蛋白迁移率基本只与其相对分子质量相关。凝胶过滤（分子筛）法：根据蛋白分子大小和性状进行测定。等电点测定重组蛋白质药物的等电点往往是不均一的，但在生产过程中批与批之间的电泳结果应一致，以说明其生产工艺的稳定性。方法：等电聚焦电泳法(IEF)

毛细管电泳法。肽图分析肽图分析可作为与天然产品或参考品的蛋白质一级结构做精密比较的手段。蛋白质一般经化学裂解法及蛋白酶裂解后用HPLC、SDS电泳法、质谱法测定。同种产品不同批次的肽图的一致性是工艺稳定性的验证指标。吸收光谱对某一重组蛋白质来说，其最大吸收波长是固定的。在生产工程中每批产品的紫外吸收光谱应当一致。重组产品一级结构不含芳香族氨基酸，可不做紫外吸收光谱测定。氨基酸组成分析采用微量氨基酸自动分析仪测定，包括蛋白质水解，自动进样、氨基酸分析、定量分析报告等。有柱前衍生法和柱后反应法，前者是氨基酸先和荧光试剂作用生成衍生物，然后用色谱柱进行分离，检测氨基酸衍生物的荧光；后者是氨基酸先用色谱柱分离，再与茚三酮、荧胺等试剂显色后进行分析检测。N-末端和C-末端氨基酸测序作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标，一般要求至少测定N-末端15个氨基酸、C-末端1～3氨基酸。五、蛋白质的二硫键分析二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关，发生错误配对，不但活性降低而且会引起抗原性增加。六、对糖蛋白的特殊要求评价用生物技术方法生产的糖蛋白时，应考虑糖基化位点的上调或下调及其对生物活性、代谢、稳定性、溶解性的影响。每一种真核细胞具有其独特的糖基化能力称为它的糖类型，通过基因工程方法将一种糖蛋白在不同细胞中表达，可以导致生产不同类型的糖蛋白，即使在相同的细胞类型中，也可能会出现糖形成时由于一些寡糖的精细结构不同等而产生截然不同的糖蛋白。七、残余杂质检测

1、对残余杂质进行限制的意义

a、残余杂质可能具有毒性，引起安全性问题；

b、可能影响产品的生物学活性和药理作用，或使产品变质；

c、反映产品生产工艺的稳定性。残余杂质检测

2、残余杂质分类

a、外来污染物：微生物、热原、细胞成分（蛋白质、DNA等）、培养基成分、纯化步骤引入的成分（亲和柱中的抗体、增溶用的SDS）等；

b、与产品相关的杂质：突变物、错误裂解物，二硫化物异构体、二聚体和多聚体；化学修饰形态（脱酰氨基或氧化形式、其他降解产物）残余杂质检测内容宿主细胞蛋白含量宿主细胞DNA鼠源型IgG含量（10ng/剂量）蛋白A含量小牛血清残留量残余抗生素（氨苄西林）内毒素含量（LAL）产品相关物质其他杂质（加入的离子、SDS、甲醛等）宿主细胞蛋白含量以双抗体夹心ELISA为宜，尽量不用斑点免疫。常采用5种最常用的E.coli菌株混和作为ELISA测菌体蛋白含量的通用标准。不同表达体系对菌体蛋白含量标准不同。来自E.coli菌株的产品为不大于0.1%；来自CHO细胞的产品为不大于0.05%。宿主细胞DNA测定方法：采用DNA杂交实验，用固相斑点杂交法，以地高辛标记检测试剂盒或者用同位素标记DNA探针进行测定，必须提供相应宿主细胞DNA标准品。现行生物制品规程对宿主细胞DNA残留量标准作了相应调整：由小于100pg/剂量调整为小于10ng/剂量。宿主细胞DNA只作为一种细胞污染因素不作为一种危险因素。

安全性及其他检测项目无菌试验热源试验异常毒性试验免疫原性检查水分、装量、pH检测生物技术药物待测样品保存

生物技术药物大多为具有生物活性的蛋白质、多肽，易受环境条件的影响。根据不同产品原液与成品、冻干与液体制剂的不同要求，可选择在－20℃、－80℃、4℃和常温条件下保存。冷冻保存的原液样品最好分成小包装保存，避免反复冻溶。检定方法的验证检定方法的验证就是根据方法的需要测定该方法的专属性、准确性、精密性、直线性、测定范围、测定限度、测量限度、特异性和耐用性（或可靠性）等几个指标中的一个或几个。对于理化测定方法已有了确定的要求和判定标准，而生物学测定的结果具有更大的可变性，一般要使用动物或细胞，这些有机体本身就具有较大的可变性，因此生物学测定的要求和合格标准要松一些。验证时应考虑的问题首先要确定方法的适用性，该方法首先可以得到可重复的、可信的实验结果，要考虑在以下几个参数：准确性、精确性、灵敏性、特异性和耐用性（可靠性）。第二，要与已知的方法进行对比试验，以考查二者间的相互关系。如果在该实验室内无可对比的老方法，则首先建立标准的方法，用含一定范围浓度的样品进行测定，以标准方法所得结果作为标准，用统计学的方法进行对比处理，得出二种方法间的相关系数。对于一个新建立的方法则需要进行协作研究对其适用性进行验证。

验证中需测定的参数1、专属性/特异性（selectivity/specificity）是指当检测方法对测试样品中含有制品中应有的其他化合物时，测定待测物的能力。本参数用于鉴别试验、浓度或效力试验和纯度试验的测定，以确定使用该检测方法所测定的结果是否准确地反映了制品的鉴别、效价或纯度。特异性就象准确性一样，一般用偏差或测定值与已知值之间的错误率（%）来表示。

2、直线性（linearity）是测定结果与样品中测试物浓度的线性关系，该参数的测定将确定检测方法的测量范围，它可以表示为回归直线的斜率和离散性，或者相关系数R和测定系数R2

。

3、测量范围（Range）

是指当准确性和精密性都能达到要求时所能测得的样品中待检物的最高和最低浓度范围，它就是测定直线性的上下限，如果剂量和反应间的关系不成直线，测量范围可以通过校正曲线来测得。在《中华人民共和国药典》中规定测量范围是指能达到一定精密度、准确性和直线性，测定方法适用的高低限度或量的区间。4、准确性（accuracy）表示测定值与真实值之间的一致性或接近的程度。一般采用填加和回收试验来测定准确性，即将已知量的样品加到空白中进行测定，比较测定值与真实值之比。准确性一般表示为偏差或测定值与真值之间的错误率（回收率）（即测定值/真实值×100%）。一般对于生物制品而言，因为没有纯的标准品，所以准确性不太实用。生物制品测定时一般与同时进行的参考品进行比较而得，此时的合格标准一般是测定出的参考品值的合格范围或样品与参考品之间的比值。5、精密性（precision）表示测定值之间的一致性或接近的程度，一般表示为变异系数(CV%)，变异系数即是测定值的标准差与测定值的比值。精密性分几种：一种是实验内的精密性（即重复性），它是在同一次试验内同一个样品多次测定结果间的变异系数。另一种是试验间的精密性，它是在同一实验室内不同次试验间对同一样品多次测定结果间的变异系数。实验室之间的精密性即重现性一般可通过协作研究得到，此参数不适合生产设施的验证。6、测定限度（LimitofDetection）是指能够测定出的样品中测试物的最低量。该量并不一定要定量测出其准确的含量或浓度，LOD是检查限度实验中最重要的一个参数。

7、测量限度（LimitofQuantitation）

是指在准确性和精密性都能达到要求时能够定量测定出的样品中测试物的最低量。LOQ是检查测定药品中不纯物方法的一个参数。8、耐用性（robustness/ruggedness）是通过有效地改变实验方法的参数，来测定此改变对试验结果的影响，即实验结果不受影响的承受程度。参数的改变可以是室温或培养温度，或湿度、或改变培养时间，或对试剂的pH进行较小范围的调整等。在每种试验条件下，对准确性、精密性、或其他参数进行测定，以确定试验方法的耐受或承受能力。不同测定方法应进行的验证的参数参数鉴别试验杂质检查效价测定组成测定定量限度准确性

+

++精确性

+

++耐用性+++++直线性和测定范围

+

++选择性或特异性+++++测定限度+

+

测量限度

+

生物测定的特殊性

由于生物测定的持续性、复杂性、以及参考品和样品贮存时间较长的特性，除了上述验证参数外，对于生物测定有另外几个参数也非常重要，包括：

1、试验顺序（front-t