齐鲁医学流式细胞仪原理及应用(HIV)VIP

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流式细胞仪

原理及仪器维护保养

流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第1页!白细胞的组成

白细胞的组成及其分化抗原

白细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或消失的表面标记，这是区分白细胞的重要标志。1986年世界卫生组织命名委员会建议应用CD系列来统一命名白细胞分化抗原流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第2页!SHA-LF4N13EforJerel细胞毒性T淋巴细胞;分泌穿孔素、IFN、、TNF等。特点：MHC-1类分子限制、直接接触、反复杀伤自然杀伤细胞（NK)：抗体依赖细胞介导的细胞毒作用、淋巴因子介导细胞毒作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用补体系统的活化（经典、凝集素、替代途径）。作用（溶胞作用、吞噬条理作用、趋化性、炎症反应等）中和抗原：形成免疫复合物，被吞噬细胞清除（条理作用）、毒素中和作用、感染中和作用体液免疫和细胞免疫的作用淋巴因子依赖的细胞毒作用流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第3页!流式细胞仪原理流式细胞术(Flowcytometry)对于处在流动状态的细胞或生物颗粒同时进行多参数的快速的分析和定量的技术流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第4页!TTCHCD3CD3CD8CD4流式细胞仪检测原理及在T细胞分析中应用流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第5页!激发光源与荧光标记物流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第6页!液流系统-鞘液流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第7页!光学系统激光(Laser,lightamplificationbystimulatedemissionofradiation)是一种相干光源，它能提供单一波长、高强度及稳定性高的光照激光波长:488nm,635nm流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第8页!检测信号流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第9页!前向角散射光信号流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第10页!FALSSensor90LSSensorLaser侧向角散射光信号流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第11页!

侧向角散射光信号(SSC)SSC-Side

(AngelLight)Scatter

与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也称为90度散射光检测器

SSC的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及opticalhomogeneity有关SSC用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少,核质比流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第12页!荧光信号每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.

利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第13页!光路-滤片特性

长通滤片

–

允许长于设定波长的光通过

短通滤片–

允许短于设定波长的光通过

带通滤片–

允许一定带宽的波长通过流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第14页!荧光信号流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第15页!

光路-滤片特性

当以45o

角放置长通滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光

这种方式的滤片称为二向色性长通滤片(dichroicfilter)

流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第16页!光学系统流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第17页!发射波长Wavelength(nm)40045050055060065070010008006004002000PEFITCPerCP750流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第18页!检测器Photomultipliertube(PMT)

将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号

流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第19页!单平台绝对计数使用TriTEST或MultiTEST试剂，在TruCOUNT管中完成全血的淋巴细胞绝对计数TruCOUNT管中预先加有准确定量的Beads，每批TruCOUNT管的Beads含量一致由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量使用直接荧光标记抗体组合，一步处理外周血使用免洗技术，溶血后直接上机检测标本操作简便，省时省力，计数结果重复性好流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第20页!TriTESTCD4/CD8/CD3TLymphEventsCD3+CD4+%TLymphCD3+CD8+%TLymphCD3+CD4+CD8+%TLymphTH/SRatioBeadEventsCD3+AbsCntCD3+CD4+AbsCntCD3+CD8+AbsCntCD3+CD4+CD8+AbsCnt流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第21页!MultiTESTCD3/CD8/CD45/CD4MultiTESTCD3/CD15+56/CD45/CD19流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第22页!FACSComp没有通过怎么办？FSC或SSC没有通过：原因：1.由于仪器的管路没有清洗干净2.使用的鞘液杂质太多(换鞘液）BD公司专用鞘液3.校准品失效4.仪器故障措施：1.用蒸馏水高速运行仪器10分钟－30分钟2.过滤鞘液3.使用新的校准品4.致电BD工程师流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第23页!FACSCount流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第24页!FacsCount样本处理FacsCount质控：正常血，样本用前颠倒混匀（避免混匀器上混匀）。反向加样法，枪头贴管壁,分离最后一滴。试剂在开盖前可以在混匀器上颠倒混匀每次更换枪头，样本多时，每次更换试剂对管管盖加入固定液后30分钟以后再操作更安全流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第25页!FacsCount仪器FacsCount的每日维护；1.运行CLEAN程序，2.上样管放置稀释的FacsClean（稀释10倍次氯酸钠）3分钟3.再放置装有FacsRinse（Tween稀释10倍1/00%)上样管清洗3分钟4.重新执行CLEAN程序，FacsRinse（Tween稀释10倍1/00%)再洗3分钟5.放置装有蒸馏水的上样管清洗3分钟6.试验结束后，放置装有蒸馏水的上样管浸泡上样针，避免管道结晶6.仪器无用时建议取出废液桶流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第26页!联系方式技术支持：赵阳阳邮箱：sunny_zhao@bd.电话件工程师：李晨电话国技术维修服务电话：4008199900--2流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第27页!免疫应答的过程及Th细胞的作用

免疫应答：细胞免疫体液免疫Th细胞作用：Th1分泌IL-2、INF等，前者可诱导Th、Tc分裂增值；Th2分泌IL-4、IL-5,可使B细胞活化，产生抗体B细胞完全活化需要Th帮助

流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第28页!BD公司HIV领域流式细胞仪产品FACSCount流式细胞仪FACSCalibur流式细胞仪流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第29页!AnalyzeIncubate流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第30页!FACSCalibur流式细胞仪仪器结构液流系统光学系统激光光源光收集系统电子系统光电转换数据处理系统软件系统流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第31页!流式细胞仪原理

InjectorTip荧光信号及前向角、侧向角散射光聚焦的激光光束鞘液流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第32页!检测信号

散射光信号

FSC:前向角散射光

SSC:侧向角散射光(90度散射光)

荧光信号 荧光染料 光学滤片流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第33页!FALSSensorLaser前向角散射光信号

流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第34页!

散射光信号—前向角散射光信号(FSC)FSC----Forward

(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测器

FSC的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及opticalhomogeneity有关FSC用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第35页!侧向角散射光信号流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第36页!流式细胞仪的检测信号：散射光FSC，前向角散射光，代表细胞大小SSC，侧向角散射光，代表细胞粒度RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第37页!光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜,滤波片,小孔组成流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第38页!460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50

长通短通 带通光学滤片流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第39页!荧光信号流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第40页!流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第41页!电子系统当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射区时,受激激发,产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号,这些信号经A/D转换成数字信号,送计算机进行储存、作图、统计分析流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第42页!流式细胞仪原理荧光信号650nm700nmFL3650andAbove500nm600nmFL1530/30FL2585/42RelativeIntensityFITCPEPerCPWavelength(nm)550nm流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第43页!单平台绝对计数管中预先加有准确定量的Beads流式细胞仪获取数据后，由各目标群的含量，可以计算出相对含量%由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量计算公式：

细胞获取数 Beads总量 细胞/L= Beads获取数 样本量

注： Beads总量见TruCOUNT管外包装

MultiSET系统中，样本量为50L流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第44页!淋巴细胞分析使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析淋巴细胞分析TriTEST：三色试剂CD4/CD8/CD3，CD3/CD4/CD45MultiTEST：四色试剂CD3/CD8/CD45/CD4TruCOUNT：单平台绝对计数管报告Th,Ts,Th/Ts百分含量%与绝对含量cells/uL流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第45页!淋巴细胞四色分析LymphAbsCntCD3+%Lymph CD3+AbsCntCD3+CD4+%LymphCD3+CD4+AbsCntCD3+CD8+%LymphCD3+CD8+AbsCntCD3+CD4+CD8+%LymphCD3+CD4+CD8+AbsCntTH/SRatio流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第46页!FacsCalibur仪器样本操作仪器校正：加入校正试剂内的液体必须和鞘液桶的一样。样本操作：溶血、有凝块的血不要做加样前，抗凝血颠倒混匀8－10次（避免混匀器混匀）使用反向加样法，枪头贴壁。加样枪在试管内不要放松流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第47页!FacsCalibur仪器BD原装鞘液：过滤、消毒。0.22um滤膜过滤鞘液桶放入3升鞘液（不要放满），清除废液桶废液，装200毫升漂白剂先开仪器再开电脑在按Prime按钮去除流动池气泡时，上样架处在偏离位置做好每日维护，建议每次关机时做FacsClean和FacsRinse清洗。（1）FacsClean，RunHi支架旁位2分钟；支架正位3分钟（2）FacsRinse，步骤同上（3）蒸馏水，RunHi2分钟旁位，5分钟正位（4）去除鞘液压力（5）选择Standby模式10分钟后关机月维护中鞘液桶装入FacsClean(0.5％－1％的漂白剂)，旁路鞘液过滤器。每3个月－6个月清洗空气过滤网（用水冲洗再晾干）。过滤器6个月更换流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第48页!仪器性能样本稳定性制备后室温(20—250C)储存48小时全血稳定性采集后室温(20—250C)储存48小时流式细胞仪原理及应用(HIV)共52页，您现在浏览的是第49页!FacsCount仪器用水冲洗开盖