7第七章高效液相色谱分析课件

学习目标1、掌握HPLC的分离原理、高效液相色谱分析的样品处理方法、分离方式的选择和定量分析方法及HPLC实验技术。2、了解高效液相色谱仪的构造、仪器各部分的功用及仪器的维护和保养，熟悉其工作过程及常用固定相及流动相的特性及选用原则。HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱分析法闽北职业技术学院食品与生物工程系学习目标HighPerformanceLiquid一、液相色谱分离原理

特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。液体待检测物被注入色谱柱，通过流动相推动，在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质以不同的顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。第一节高效液相色谱分离的原理1、液相色谱分析法闽北职业技术学院食品与生物工程系一、液相色谱分离原理特指一种用液体为流动相的2、液相色谱法分类1）液-液分配色谱法（LLC）2）液-固吸附色谱法（LSC）3）离子交换色谱法（IC）4）空间排阻（凝胶）色谱法闽北职业技术学院食品与生物工程系2、液相色谱法分类1）液-液分配色谱法（LLC）闽北职业技术1）液-液分配色谱法（LLC）分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异实现分离。固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）。缺点：系统内部压力大，易流失，不实用。

极性固定液→NLLC，非极性固定液→RLLC正相色谱——固定液极性>流动相极性（NLLC），极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分。反相色谱——固定液极性<流动相极性（RLLC），极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱，适于分离非极性组分。闽北职业技术学院食品与生物工程系1）液-液分配色谱法（LLC）闽北职业技术学院食品与生物工程2）液-固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂。分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异实现分离。3）离子交换色谱法（IC）分离机制：离子交换树脂上可交换的离子基团与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据其对离子交换树脂上的固定离子基团亲和力的不同而将溶质分子分离。离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱；四丁基季胺盐→分析酸4）空间排阻（凝胶）色谱法以凝胶为固定相的色谱法。分离机制：溶质自身体积大小不同，透过凝胶的速率不等。闽北职业技术学院食品与生物工程系2）液-固吸附色谱法（LSC）闽北职业技术学院食品与生物工程高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。

高效液相色谱也叫高压液相色谱（highpressureliquidchromatography）、高速液相色谱（highspeedliquidchromatography）、高分离度液相色谱（highresolutionliquidchromatography）等。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。二、高效液相色谱分析法的特点闽北职业技术学院食品与生物工程系高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质1、高效液相色谱的特点高压——压力可达150～300kg/cm2。色谱柱每米降压为75kg/cm2以上。高速——流速为0.1～10.0mL/min。高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。

闽北职业技术学院食品与生物工程系1、高效液相色谱的特点闽北职业技术学院食品与生物工程系2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点速度快——通常分析一个样品在15～30min，有些样品甚至在5min内即可完成。分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。闽北职业技术学院食品与生物工程系2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点闽北职业技术学院食品三、HPLC的实际应用未知物质的鉴定与确认多成分的同时定量混合物的精制和分离测定物理化学常数HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。闽北职业技术学院食品与生物工程系三、HPLC的实际应用未知物质的鉴定与确认HPLC应用非常广第二节高效液相色谱仪的基本构造闽北职业技术学院食品与生物工程系第二节高效液相色谱仪的基本构造闽北职业技术学院高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。闽北职业技术学院食品与生物工程系高压输液系统高效液相色谱系统由流动相储液体瓶一、高压输液系统1、贮液装置2、高压泵（输液泵）3、过滤器4、洗脱装置5、阻尼器闽北职业技术学院食品与生物工程系一、高压输液系统1、贮液装置闽北职业技术学院食品与生物工程系马达往复式拉动密封溶剂球阀脉动阻尼器到色谱柱机械往复柱塞泵示意图闽北职业技术学院食品与生物工程系马达往复式拉动密封溶剂球阀脉动阻到色谱柱机械往复柱塞泵示意图1、贮液装置----提供足够数量、符合要求的流动相，以完成分离分析任务。流动相须经过脱气处理（加热、减压、超声波、惰性气体置换）。脱气指驱除溶解在溶剂当中的气体。（1）脱气是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡。这些气泡进入检测器后会使噪声剧增，甚至不能正常检测。（2）溶解氧会与某些流动相与固定相作用，破坏它们的正常功能。对水及极性溶剂的脱气尤为重要，因为氧在其中的溶解度较大。2、高压泵----输出流动相要求较高的输出压力且压力平稳、流速恒定、流量可调。当高压流动相通过分离柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用闽北职业技术学院食品与生物工程系1、贮液装置----提供足够数量、符合要求的流动相，以完成分3、过滤器----对流动相进行过滤，以消除微小的机械杂质。4、洗脱装置梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。低压梯度洗脱高压梯度洗脱5、阻尼器----减少流动相流量的波动，亦称缓冲器。闽北职业技术学院食品与生物工程系3、过滤器----对流动相进行过滤，以消除微小的机械杂质。二、进样系统1、注射器（隔膜）进样微量注射器刺穿高分子有机硅胶垫→进样室由于GC系统压力较小，可以直接使用；HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）。2、六通阀进样进样准确、方便，进样过程不必停泵。3、自动进样器智能软件控制，自动操作。闽北职业技术学院食品与生物工程系二、进样系统1、注射器（隔膜）进样闽北职业技术学院食品与生物该系统包括色谱柱（柱管、固定相填料、密封垫）、连接管和恒温器等。1、色谱柱一般长度为15～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为5～10μm粒度的固定相柱效的理论值达5000-16000/m。2、色谱柱恒温装置水浴式、电热式、恒温箱式三、分离系统闽北职业技术学院食品与生物工程系该系统包括色谱柱（柱管、固定相填料、密封垫高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。1、紫外检测器（UVD）该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。

其特点：1）使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；2）灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；3）线性范围宽；4）对温度和流速变化不敏感；5）可检测梯度溶液洗脱的样品。四、检测系统闽北职业技术学院食品与生物工程系高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折2、示差折光检测器（RID）凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。糖类化合物的检测常使用此检测系统。

特点：通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g／mL），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。3、荧光检测器（FD）凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。

特点：其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／mL），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。闽北职业技术学院食品与生物工程系2、示差折光检测器（RID）闽北职业技术学院食品与生物工程五、数据处理系统又称工作站（专家系统），该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。闽北职业技术学院食品与生物工程系五、数据处理系统又称工作站（专家系统），该系一、溶剂萃取第三节高效液相色谱分析的样品处理方法二、微波溶剂萃取三、衍生化技术闽北职业技术学院食品与生物工程系一、溶剂萃取第三节高效液相色谱分析的样品处理方法二、微第四节固定相和流动相及分离方法的选择极性固定相------硅胶、氧化铝等非极性固定相-----活性炭、分子筛等固定相粒径<10μm。2、液-液分配色谱固定相将固定液涂渍在（担体）表面，形成液-液色谱的固定相。固定液与流动相不能互溶，一般是有机液体，如聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇4000等。1、液-固吸附色谱固定相一、液相色谱固定相闽北职业技术学院食品与生物工程系第四节固定相和流动相及分离方法的选择极性固定相-3、离子交换色谱固定相4、凝胶色谱固定相（1）薄膜型离子交换树脂（2）离子交换键合固定相具有立体多孔网状结构的多聚体。分为软质、半硬质、硬质三种。软质---葡聚糖凝胶、琼脂凝胶；半硬质---交联聚苯乙烯凝胶；硬质---多孔硅胶、多孔玻璃球等。闽北职业技术学院食品与生物工程系3、离子交换色谱固定相4、凝胶色谱固定相（1）薄膜型离子交换二、液相色谱流动相（洗脱剂）液相色谱流动相（洗脱剂）是指各种极性、非极性液态溶剂。理想的溶剂应有下列特性：1、所选用的流动相溶剂要有一定的化学稳定性，不与固定相和样品组分起反应，其纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求。2、溶剂应当不干扰检测器的工作，溶剂应与检测器匹配，选择不影响检测器正常工作应选择在测定波长范围内无吸收的流动相。3、在制备分离中,溶剂应当易于除去,不干扰对分离组分的回收。4、溶剂的粘度要小，保证合适的柱压降。闽北职业技术学院食品与生物工程系二、液相色谱流动相（洗脱剂）液相色谱流动相（5、从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯度要高。

气相色谱的流动相不参加色谱分离过程，而液相色谱的流动相不仅参加分离过程，而且起着重要的调节作用，是分离分析的一个极为重要的因素。流动相极性大小顺序如下：水、甲酰胺、乙腈、乙醇、丙醇……烷烃闽北职业技术学院食品与生物工程系5、从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯二、HPLC分离方法的选择闽北职业技术学院食品与生物工程系二、HPLC分离方法的选择闽北职业技术学院食品与生物工程系第六节高效液相色谱仪的维护与保养一、高效液相色谱仪的日常维护日常工作中，液相色谱仪的保养非常重要1、注意不要让空气进入输液系统和高压泵中；2、储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液，每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净，防止无机盐析出或沉积；3、样品的前处理也很重要，任何样品都要尽可能地去除杂质，完全溶解，尽量减少对色谱柱的污染，以延长色谱柱的使用寿命；4、同时避免注射过浓的样品溶液，以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞；色谱柱作好标记，用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。闽北职业技术学院食品与生物工程系第六节高效液相色谱仪的维护与保养一、高效液相色三、常见故障判断与排除方法故障1流动相内有气泡无法清除原因-----过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内，过滤器内部由于霉菌的生长繁殖，形成菌团，阻塞了过滤器，缓冲液难以流畅地通过过滤器，空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。处理过滤器的方法：将其浸泡于5%硝酸溶液中，超声清洗几分钟即可；亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小时,轻轻震荡几次，再将过滤器用纯水清洗几次，即可将过滤器清洗干净。二、色谱柱的日常维护与保养闽北职业技术学院食品与生物工程系三、常见故障判断与排除方法故障1流动相内有气泡无法清除二、故障2柱压高原因（1）缓冲液盐分如(乙酸铵等)沉积于柱内;（2）样品污染沉积。处理对于第一种情况先用40～50℃的纯水，低速正向冲洗柱子，待柱压逐渐下降后，相应提高流速冲洗，柱压大幅度下降后，用常温纯水冲洗，之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟;对于第二种情况，用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再用换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇正向冲洗柱子30分钟以上。闽北职业技术学院食品与生物工程系故障2柱压高闽北职业技术学院食品与生物工程系故障3既无压力指示，又无液体流过。

原因（1）泵密封垫圈磨损（2）大量气泡进入泵体。

处理对于第一种情况，更换密封垫圈；对于第二种情况，在泵作用的同时，用一个50mL的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。闽北职业技术学院食品与生物工程系故障3既无压力指示，又无液体流过。

闽北职业技术学院食品与故障4压力波动大，流量不稳定。原因----系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物，使得两者不能密封。

处理工作中注意观察流动相的量，保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底，避免吸入空气，流动相要充分。如为单向阀和阀座之间夹有异物，拆下单向阀，放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。闽北职业技术学院食品与生物工程系故障4压力波动大，流量不稳定。闽北职业技术学院食品与生物工故障5出峰不佳，峰分叉。原因（1）色谱柱被污染;（2）柱头填料塌陷。

处理对于第一种情况，先用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳，则考虑第二种情况。对于第二种情况，拧开柱头，检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料)，装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧，再填平，滴甲醇，再压紧反复几次，直至装满填平。柱头用甲醇冲洗干净，擦净柱外壁的填料，拧紧柱头，用纯甲醇冲洗30分钟以上。闽北职业技术学院食品与生物工程系故障5出峰不佳，峰分叉。闽北职业技术学院食品与生物工程系故障6峰面积重复性不佳。原因（1）进样阀漏液（2）加样针不到位。处理对于第一种情况更换进样阀垫圈；对于第二种情况保证加样针插到底，注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态，以保证进样量的准确。闽北职业技术学院食品与生物工程系故障6峰面积重复性不佳。闽北职业技术学院食品与生物工程系第七节液相色谱法的发展史1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。闽北职业技术学院食品与生物工程系第七节液相色谱法的发展史1960年代1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。

闽北职业技术学院食品与生物工程系1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面临着困境，后来的研究人员便采用微粒固定相来突破着一瓶颈。科克兰、荷瓦斯制备成功薄壳型固定相，这种在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄壳，实现了高速传质，为高效液相色谱技术的发展奠定了稳固的基础。随着填料粒径的降低，更高的柱效也得以实现。1960年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式柱塞泵，但后者的脉冲信号很大，难以满足高效液相色谱的要求。闽北职业技术学院食品与生物工程系1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面临着困1970年代，往复式双柱塞恒流泵，解决了这一问题。1970年代后科克兰制备出全多孔球形硅胶，平均粒径只有7μm，具有极好的柱效，并逐渐取代了无定形微粒硅胶。之后又制造出的键合固定相使柱的稳定性大为提高，多次使用成为可能。1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为色谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动相的组成事提高选择性的关键。

闽北职业技术学院食品与生物工程系1970年代，往复式双柱塞恒流泵，解决了这一问题。1970年学习目标1、掌握HPLC的分离原理、高效液相色谱分析的样品处理方法、分离方式的选择和定量分析方法及HPLC实验技术。2、了解高效液相色谱仪的构造、仪器各部分的功用及仪器的维护和保养，熟悉其工作过程及常用固定相及流动相的特性及选用原则。HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱分析法闽北职业技术学院食品与生物工程系学习目标HighPerformanceLiquid一、液相色谱分离原理

特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。液体待检测物被注入色谱柱，通过流动相推动，在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质以不同的顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。第一节高效液相色谱分离的原理1、液相色谱分析法闽北职业技术学院食品与生物工程系一、液相色谱分离原理特指一种用液体为流动相的2、液相色谱法分类1）液-液分配色谱法（LLC）2）液-固吸附色谱法（LSC）3）离子交换色谱法（IC）4）空间排阻（凝胶）色谱法闽北职业技术学院食品与生物工程系2、液相色谱法分类1）液-液分配色谱法（LLC）闽北职业技术1）液-液分配色谱法（LLC）分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异实现分离。固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）。缺点：系统内部压力大，易流失，不实用。

极性固定液→NLLC，非极性固定液→RLLC正相色谱——固定液极性>流动相极性（NLLC），极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分。反相色谱——固定液极性<流动相极性（RLLC），极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱，适于分离非极性组分。闽北职业技术学院食品与生物工程系1）液-液分配色谱法（LLC）闽北职业技术学院食品与生物工程2）液-固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂。分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异实现分离。3）离子交换色谱法（IC）分离机制：离子交换树脂上可交换的离子基团与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据其对离子交换树脂上的固定离子基团亲和力的不同而将溶质分子分离。离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱；四丁基季胺盐→分析酸4）空间排阻（凝胶）色谱法以凝胶为固定相的色谱法。分离机制：溶质自身体积大小不同，透过凝胶的速率不等。闽北职业技术学院食品与生物工程系2）液-固吸附色谱法（LSC）闽北职业技术学院食品与生物工程高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。

高效液相色谱也叫高压液相色谱（highpressureliquidchromatography）、高速液相色谱（highspeedliquidchromatography）、高分离度液相色谱（highresolutionliquidchromatography）等。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。二、高效液相色谱分析法的特点闽北职业技术学院食品与生物工程系高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质1、高效液相色谱的特点高压——压力可达150～300kg/cm2。色谱柱每米降压为75kg/cm2以上。高速——流速为0.1～10.0mL/min。高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。

闽北职业技术学院食品与生物工程系1、高效液相色谱的特点闽北职业技术学院食品与生物工程系2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点速度快——通常分析一个样品在15～30min，有些样品甚至在5min内即可完成。分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。闽北职业技术学院食品与生物工程系2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点闽北职业技术学院食品三、HPLC的实际应用未知物质的鉴定与确认多成分的同时定量混合物的精制和分离测定物理化学常数HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。闽北职业技术学院食品与生物工程系三、HPLC的实际应用未知物质的鉴定与确认HPLC应用非常广第二节高效液相色谱仪的基本构造闽北职业技术学院食品与生物工程系第二节高效液相色谱仪的基本构造闽北职业技术学院高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。闽北职业技术学院食品与生物工程系高压输液系统高效液相色谱系统由流动相储液体瓶一、高压输液系统1、贮液装置2、高压泵（输液泵）3、过滤器4、洗脱装置5、阻尼器闽北职业技术学院食品与生物工程系一、高压输液系统1、贮液装置闽北职业技术学院食品与生物工程系马达往复式拉动密封溶剂球阀脉动阻尼器到色谱柱机械往复柱塞泵示意图闽北职业技术学院食品与生物工程系马达往复式拉动密封溶剂球阀脉动阻到色谱柱机械往复柱塞泵示意图1、贮液装置----提供足够数量、符合要求的流动相，以完成分离分析任务。流动相须经过脱气处理（加热、减压、超声波、惰性气体置换）。脱气指驱除溶解在溶剂当中的气体。（1）脱气是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡。这些气泡进入检测器后会使噪声剧增，甚至不能正常检测。（2）溶解氧会与某些流动相与固定相作用，破坏它们的正常功能。对水及极性溶剂的脱气尤为重要，因为氧在其中的溶解度较大。2、高压泵----输出流动相要求较高的输出压力且压力平稳、流速恒定、流量可调。当高压流动相通过分离柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用闽北职业技术学院食品与生物工程系1、贮液装置----提供足够数量、符合要求的流动相，以完成分3、过滤器----对流动相进行过滤，以消除微小的机械杂质。4、洗脱装置梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。低压梯度洗脱高压梯度洗脱5、阻尼器----减少流动相流量的波动，亦称缓冲器。闽北职业技术学院食品与生物工程系3、过滤器----对流动相进行过滤，以消除微小的机械杂质。二、进样系统1、注射器（隔膜）进样微量注射器刺穿高分子有机硅胶垫→进样室由于GC系统压力较小，可以直接使用；HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）。2、六通阀进样进样准确、方便，进样过程不必停泵。3、自动进样器智能软件控制，自动操作。闽北职业技术学院食品与生物工程系二、进样系统1、注射器（隔膜）进样闽北职业技术学院食品与生物该系统包括色谱柱（柱管、固定相填料、密封垫）、连接管和恒温器等。1、色谱柱一般长度为15～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为5～10μm粒度的固定相柱效的理论值达5000-16000/m。2、色谱柱恒温装置水浴式、电热式、恒温箱式三、分离系统闽北职业技术学院食品与生物工程系该系统包括色谱柱（柱管、固定相填料、密封垫高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。1、紫外检测器（UVD）该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。

其特点：1）使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；2）灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；3）线性范围宽；4）对温度和流速变化不敏感；5）可检测梯度溶液洗脱的样品。四、检测系统闽北职业技术学院食品与生物工程系高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折2、示差折光检测器（RID）凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。糖类化合物的检测常使用此检测系统。

特点：通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g／mL），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。3、荧光检测器（FD）凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。

特点：其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／mL），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。闽北职业技术学院食品与生物工程系2、示差折光检测器（RID）闽北职业技术学院食品与生物工程五、数据处理系统又称工作站（专家系统），该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。闽北职业技术学院食品与生物工程系五、数据处理系统又称工作站（专家系统），该系一、溶剂萃取第三节高效液相色谱分析的样品处理方法二、微波溶剂萃取三、衍生化技术闽北职业技术学院食品与生物工程系一、溶剂萃取第三节高效液相色谱分析的样品处理方法二、微第四节固定相和流动相及分离方法的选择极性固定相------硅胶、氧化铝等非极性固定相-----活性炭、分子筛等固定相粒径<10μm。2、液-液分配色谱固定相将固定液涂渍在（担体）表面，形成液-液色谱的固定相。固定液与流动相不能互溶，一般是有机液体，如聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇4000等。1、液-固吸附色谱固定相一、液相色谱固定相闽北职业技术学院食品与生物工程系第四节固定相和流动相及分离方法的选择极性固定相-3、离子交换色谱固定相4、凝胶色谱固定相（1）薄膜型离子交换树脂（2）离子交换键合固定相具有立体多孔网状结构的多聚体。分为软质、半硬质、硬质三种。软质---葡聚糖凝胶、琼脂凝胶；半硬质---交联聚苯乙烯凝胶；硬质---多孔硅胶、多孔玻璃球等。闽北职业技术学院食品与生物工程系3、离子交换色谱固定相4、凝胶色谱固定相（1）薄膜型离子交换二、液相色谱流动相（洗脱剂）液相色谱流动相（洗脱剂）是指各种极性、非极性液态溶剂。理想的溶剂应有下列特性：1、所选用的流动相溶剂要有一定的化学稳定性，不与固定相和样品组分起反应，其纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求。2、溶剂应当不干扰检测器的工作，溶剂应与检测器匹配，选择不影响检测器正常工作应选择在测定波长范围内无吸收的流动相。3、在制备分离中,溶剂应当易于除去,不干扰对分离组分的回收。4、溶剂的粘度要小，保证合适的柱压降。闽北职业技术学院食品与生物工程系二、液相色谱流动相（洗脱剂）液相色谱流动相（5、从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯度要高。

气相色谱的流动相不参加色谱分离过程，而液相色谱的流动相不仅参加分离过程，而且起着重要的调节作用，是分离分析的一个极为重要的因素。流动相极性大小顺序如下：水、甲酰胺、乙腈、乙醇、丙醇……烷烃闽北职业技术学院食品与生物工程系5、从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯二、HPLC分离方法的选择闽北职业技术学院食品与生物工程系二、HPLC分离方法的选择闽北职业技术学院食品与生物工程系第六节高效液相色谱仪的维护与保养一、高效液相色谱仪的日常维护日常工作中，液相色谱仪的保养非常重要1、注意不要让空气进入输液系统和高压泵中；2、储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液，每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净，防止无机盐析出或沉积；3、样品的前处理也很重要，任何样品都要尽可能地去除杂质，完全溶解，尽量减少对色谱柱的污染，以延长色谱柱的使用寿命；4、同时避免注射过浓的样品溶液，以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞；色谱柱作好标记，用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。闽北职业技术学院食品与生物工程系第六节高效液相色谱仪的维护与保养一、高效液相色三、常见故障判断与排除方法故障1流动相内有气泡无法清除原因-----过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内，过滤器内部由于霉菌的生长繁殖，形成菌团，阻塞了过滤器，缓冲液难以流畅地通过过滤器，空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。处理过滤器的方法：将其浸泡于5%硝酸溶液中，超声清洗几分钟即可；亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小时,轻轻震荡几次，再将过滤器用纯水清洗几次，即可将过滤器清洗干净。二、色谱柱的日常维护与保养闽北职业技术学院食品与生物工程系三、常见故障判断与排除方法故障1流动相内有气泡无法清除二、故障2柱压高原因（1）缓冲液盐分如(乙酸铵等)沉积于柱内;（2）样品污染沉积。处理对于第一种情况先用40～50℃的纯水，低速正向冲洗柱子，待柱压逐渐下降后，相应提高流速冲洗，柱压大幅度下降后，用常温纯水冲洗，之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟;对于第二种情况，用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再用换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇正向冲洗柱子30分钟以上。闽北职业技术学院食品与生物工程系故障2柱压高闽北职业技术学院食品与生物工程系故障3既无压力指示，又无液体流过。

原因（1）泵密封垫圈磨损（2）大量气泡进入泵体。

处理对于第一种情况，更换密封垫圈；对于第二种情况，在泵作用的同时，用一个50mL的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。闽北职业技术学院食品与生物工程系故障3既无压力指示，又无液体流过。

闽北职业技术学院食品与故障4压力波动大，流量不稳定。原因----系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物，使得两者不能密封。

处理工作中注意观察流动相