植物组织培养技术简介及其应用课件

植物组织培养技术简介及其应用主要内容植物组织培养技术简介组织培养技术的应用植物组织培养基本操作植物组织培养技术简介

►

组织培养的概念

♦

植物组织培养是指在无菌条件下,将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体),培养在人工配制的培养基上,给予适宜的培养条件,诱发产生愈伤组织,或潜伏芽等,或长成完整的植株,统称为植物组织培养。由于是在试管内培养,而且培养的是脱离植株母体的培养物,因此也称离体培养或试管培养。►

根据外植体来源和培养对象的不同,又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体培养等。

植物组织培养技术简介♦

(1)植株培养(plantculture)对完整植株材料的培养，如幼苗及较大植株的培养。

♦(2)器官培养(organculture)离体器官的培养，可以包括分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养。

♦(3)组织或愈伤组织培养(tissurecallusculture)对植物体的各部分组织进行培养或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株。

♦(4)细胞培养(cellculture)对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养。

♦(5)原生质体培养(proplastculture)用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。植物组织培养技术简介

♦外植体（器官、组织、细胞）完整植物

♦

植物细胞全能性：植物的单个细胞所具有的产生完整植物个体的潜在能力。细胞的脱分化和再分化是离体培养过程中细胞全能性表现的基本过程。组织培养技术的应用♦在植物脱毒和快速繁殖上的应用♦♦在植物育种上的应用

(1)单倍体育种

单倍体植株往往不能结实,在培养中用秋水仙素处理,可使染色体加倍,成为纯合二倍体植株,这种培养技术在育种上的应用称为单倍体育种。单倍体育种具有高速、高效率、基因型一次纯合等优点,因此,通过花药或花粉培养的单倍体育种,已经作为一种崭新的育种手段,并已开始育成大面积种植的作物新品种。组织培养技术的应用

(2)胚胎培养在植物种间杂交或远缘杂交中,杂交不孕给远缘杂交带来了许多困难。而采用胚的早期离体培养可以使胚正常发育并成功地培养出杂交后代。远缘杂交中,可把未受精的胚珠分离出来,在试管内用异种花粉在胚珠上萌发受精,产生的杂种胚在试管中发育成完整植株,此法称为“试管受精”。用胚乳培养可以获得三倍体植株,为诱导形成三倍体植物开辟了一条新途径。三倍体加倍后可得到六倍体,可育成多倍体新品种。

组织培养技术的应用

(3)细胞融合植物体细胞杂交在植物远源杂交育种中,除了应用离体胚培养或离体受精和授粉培养技术之外,还可采用植物体细胞杂交技术——原生质体融合。由于不同来源的原生质体都有彼此融合的能力,在远源杂交中,通过细胞融合可获得种间、属间、科间、甚至界间的细胞融合体系，因此，细胞融合打破了种属间的界限，克服远缘杂交不亲和性障碍，在植物新品种的培育和种性改良中有着巨大的潜力。目前，采用原生质体融合技术已经能从不杂交的植物中如番茄和马铃薯、烟草和龙葵、芥菜和油菜等获得属间杂种。组织培养技术的应用

(4)基因工程基因转化是有目的地将外源基因或DNA导入植物细胞内,使之整合、表达并遗传，通过外源基因的导入，并植物体内表达，有目的地改变植物性状，以提高作物的抗逆性，改良作物品质。植物组织培养是外源基因导入植物细胞的关键技术，通过组织培养技术可以建立一个良好的植物转化系统，目前通常使用的再生系统有愈伤组织再生系统、直接分化再生系统、原生质体再生系统、胚状体再生系统和生殖细胞受体系统等。组织培养技术的应用

(5)培养细胞突变体无论是愈伤组织培养，还是细胞培养，培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件和外界压力(如射线、化学物质等)的影响而产生诱变，从中可以筛选出对人们有用的突变体，从而育成新品种。目前，用这种方法已筛选出抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的突变体，有些已用于生产。组织培养技术的应用

♦

在提取植物次生产物生产上的应用

♦

在人工种子和种质保存方面的应用

♦

在植物检疫方面的作用植物组织培养基本操作♦洗涤(略）♦培养基配制♦离体培养体系的建立培养基的配制

►培养基的种类和成分♦

目前国际上流行的培养基有几十种，如：MS培养基、B5培养基、

WPM培养基、White培养基、N6培养基等。♦培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。1、水大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水；

2、无机元素大量元素：有N，P，K，Ca，Mg，S等；微量元素：Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。Fe盐：FeSO4·7H2O和Na2-EDTA结合成螯合物使用。

培养基的配制3、有机化合物

(1)碳水化合物最常用的碳源是蔗糖，蔗糖使用浓度在2％-3％，常用3％；

(2)维生素(vitamin)主要有VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、VC(抗坏血酸)、有时还使用生物素、叶酸、VB2等。一般用量为0.1-1.0mg/L。

(3)肌醇又叫环己六醇。使用浓度一般为100mg/L。

(4)氨基酸是有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用甘氨酸。培养基的配制4．植物激素(hormone)

在培养基的各成分中植物激素是培养基的关键物质,对植物组织培养起着决定性作用。(1)生长素类(auxin)，如NAA、IAA、IBA、2,4-D等主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长；(2)细胞分裂素类(cytokinin)，如BA、TDZ、KT、ZT等多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用；(3)GA(赤霉素)用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发；(4)ABA（脱落酸）促进细胞成熟老化等。

培养基的配制

5.琼脂(agar)

在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。琼脂溶解于90℃以上的热水。琼脂的用量在6-10g／L之间。培养基的配制►配制培养基的方法和步骤

1、MS培养基及激素母液的配制培养基配方中各种成分的用量从每升几毫克到几千毫克不等，为了配制培养基的方便，通常将培养基的不同成分先配制成高浓度的母液。无机盐按大量元素、微量元素和Fe盐3部分分别配制。一般将大量元素配制成20×母液，微量元素、Fe盐和有机成分配制成200×母液。激素的使用浓度很低，一般分别配制成0.1～1mg/ml浓度的溶液。配好的母液贮存于2～4℃的冰箱中备用。

培养基的配制2、MS培养基的配制及分装按照各种母液顺序和规定量，用移液管或量筒取母液，放在烧杯或三角瓶中。称取蔗糖（30g/L）、琼脂（7.5g/L），倒入约占配制培养基总量1/2以上的蒸馏水中，然后边搅拌边加入各种母液混合，最后定容，用1mol/L的NaOH或HCl溶液调节PH值至5.8～6.0。加热混合均匀后，趁热将配制好的培养基分装入培养容器中，封口。

培养基的配制（以MS为例）：母液的配制和保存，称量，溶解，定容，分装，标签，灭菌保存。

母液种类成分规定用量扩大称取量母液定容配1LMS培养基吸取量(ml)(mg/L)倍数(mg)体积(ml)

KNO31900

38000

NH4NO31650

33000

大量元素MgSO4.7H2O370207400100050

KH2PO4170

3400

CaCI.2H2O440

8800

微量元素MnSO4.4H2O22.3

4460

ZnSO47H2O8.6

1720

H3BO36.2200124010005KI0.83

166

Na2MoO4.2H2O0.25

50

CuSO4.5H2O0.025

5

CoCI2.6H2O0.025

5

铁盐Na2-EDTA37.3200746010005FeSO4.7H2O27.85560有机物烟酸0.5

100

甘氨酸2

400

VB0.12002010005VB0.5

100

肌醇100

20000

培养基的配制►配制培养基时应注意的问题

1、在配制培养基母液或者培养基时，各种成分要严格按照添加方式和添加顺序加入，以免培养基产生沉淀现象。如：⑴、配制大量元素母液时，各种无机盐单独溶解后，必须按照硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾和氯化钙的次序混合定容，因为氯化钙与磷酸二氢钾、硫酸镁极易形成磷酸三钙、硫酸钙之类不溶于水的沉淀。⑵、配制微量元素母液时，应按硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、硼酸、钼酸钠、碘化钾和氯化钴的顺序混合定容。⑶、配制Fe盐时，分别溶解FeSO4·7H2O和Na2EDTA·2H2O在适当体积的蒸馏水中，适当加热并不停搅拌，待完全溶解后将二者混合在一起，调整pH至5.5，最后定容到所需体积。培养基的配制2、配制培养基母液时，应当按照培养基配方清单逐一添加成分，以免出现错误。此时如发生错误，将会导致以后用此母液配制的所有培养基都出现问题而不能及时发现。3、配好的铁盐应装入棕色瓶。铁盐和有机化合物应放入冰箱保存。4、培养基的pH值会显著影响培养物的生长状态，因此要注意培养基在经过高压蒸汽灭菌后pH会降低0.2～0.5个单位。5、新的玻璃器皿在第一次使用之前应当彻底清洗干净。6、要添加的过滤灭菌成分，应当在经过高压灭菌的培养基温度降到凝固温度之上的10℃左右时加入，添加后充分混匀，尽快分装。7、灭菌后的培养基一般在2周内使用，贮存时间过长会造成潜在的污染。培养基的配制

►灭菌

培养基配置好后，在高压灭菌锅中121℃灭菌20min。瓶装的培养基在灭菌前分装，而要用培养皿的培养基在灭菌后分装。♦

注意：对于不能高压灭菌的成分，如IAA、ZT、GA3、ABA、AgNO3、谷氨酰胺、抗生素等，需先过滤灭菌，待高压灭菌的培养基冷至50℃左右时，再加入这些成分分装。离体培养体系的建立——初代培养植物外植体都是带菌的，在进行离体培养之前，必须先对外植体进行消毒灭菌处理，以获得无菌植物材料。常用的方法是用消毒剂进行表面灭菌。消毒剂对植物细胞有杀伤作用，因此，要根据外植体对消毒剂的敏感性和其受污染程度来确定消毒剂种类、浓度及处理时间。常用的消毒剂有酒精、次氯酸钠、过氧化氢、升汞、硝酸银和溴水等。用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌。离体培养体系的建立——初代培养接种是严格的无菌操作。外植体经过灭菌后，立即在无菌操作台上进行无菌操作。接种过程应尽可能快，以避免染菌。操作要谨慎，操作不当极易引起污染。接种后的材料尽快放置于适当的培养条件下培养。适宜的培养条件主要包括光照、温度、培养基pH和培养环境的空气流通程度等。初代培养

1、外植体的选择（1）、外植体的部位在组织培养中，如何选择合适的，最能表达全能性的部位，是决定组织培养体系成功建立的前提之一。（2）、取材季节取材季节也是重要因素之一，对大多数植物，应在其生长开始的季节。（3）、器官的生理特点和发育幼年组织比老年组织具有较高的行态发生能力。（4）、外植体的大小茎段长0.5cm，叶片面积5mm2。

初代培养

2、外植体的消毒外植体的消毒步骤

首先，把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，洗时可加入洗衣粉清洗；第二步要在超净台用70％酒精消毒10-30s；第三步是用杀菌剂0.1%升汞处理5-20min；第四步用无菌水涮洗4-6次，每次不少于3min，以尽量去除残毒。

初代培养

3、无菌操作

⑴超净工作台灭菌开始无菌操作前半小时，打开超净工作台上的紫外灯，照射20分钟后，关闭紫外灯，使超净工作台正常送风，10分钟左右后，即可开始无菌操作。⑵双手及接种器械灭菌进行无菌操作前，先用肥皂洗涤双手，穿好工作服。用70％～75％的酒精擦拭台面并消毒双手。所有接种器械用75％酒精浸泡，在酒精灯上灼烧灭菌。⑶接种切去材料两端各0.5cm左右长度茎段，将茎段接种到初代培养基上。在培养容器上标明培养基代号和接种日期。

4、初代培养接种完成后，尽快将接种材料置于适当的培养条件下进行培养。并定期进行观察记录。初代培养

5、污染的原因及对策

污染：组培过程中培养基和培养材料滋生杂菌导致培养失败现象。（1）污染的原因

外植体带菌，培养基灭菌不彻底，操作员不遵守操作规程等。细菌污染在接种后1-2天可发现，菌斑呈粘液状。真菌污染在接种3天后可发现，污染部分长有不同颜色的霉菌。

（2）污染的预防措施将取的枝条用水冲干净后插入自来水中使其抽枝，用新抽的枝作外植体。晴天中午到下午采样操作人员严格遵守操作规程接种培养基及其用具灭菌要彻底组织培养时的注意事项

1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。

2、消毒剂最好在使用前临时配制，氯化汞可在短时间内贮用。

3、灭菌后的材料应立即接种，以免造成二次污染。

组织培养时的注意事项

4、紫外线对人体有危害，在工作台灭菌时，不能将皮肤暴露于紫外灯下，不可直接用眼睛看紫外光。超净工作台上的紫外灯关闭后不要立即走近工作台，以免臭氧伤害呼吸道和眼睛。

5、无菌操作时注意手臂切勿从培养基、无菌材料或接种工具上方经过，以免引起污染。离体培养体系的建立——继代与生根培养

1、无菌苗继代培养

2、生根培养当无菌苗植株健壮，高度达到2-3cm时，即可进行生根培养。配制生根培养基在1/2MS或1/4MS培养基中，添加浓度比例较高的生长素和细胞分裂素。继代与生根培养注意事项：1、进行继代时，如发现培养物的底部长出愈伤组织，应将其切去。2、无菌苗用于生根培养前，应适当进行壮苗，否则无菌苗