霍乱实验室检测课件

霍乱的实验室检测

什么是霍乱?

霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌（V．cholerae）引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波及范围广、危害严重的甲类传染病。霍乱概述古典生物型小川型Ogawa(AB)O1群稻叶型Inaba(AC)埃尔托生物型彦岛型Hikojim(ABC)霍乱弧菌霍乱病原菌O139群（Bengal）非O1群O2-O200群腹泻病原菌毒

素

霍乱肠毒素(CT)：前噬菌体基因编码

小带联结毒素Zot增加肠黏膜通透性

副霍乱肠毒素Ace肠段积液侵袭力鞭

毛菌毛：acf、tcpA致病物质所致疾病：烈性肠道传染病霍乱传染源:病人/无症状带菌者,人是霍乱弧菌的唯一易感者传播途径：粪-口途径

流行特征：地方性、季节性。霍乱典型临床特征患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”。并发症有血容量减少，

循环衰竭及肾功能衰竭，导致尿闭、电解质、酸碱平衡失调导致肌肉痉挛。

免疫性感染后可获牢固免疫力；再感染少见局部黏膜免疫；抗菌抗体（O）；抗毒素抗体（B）

O1群与O139群不存在交叉免疫保护作用。病原体

O1群，O139群霍乱弧菌发病特征：

剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20－50％（重症病人达70－100％）

培养特性：营养要求不高，兼性厌氧，37℃生长，怕酸嗜碱，pH:7.4-9.6快速生长检验依据：

WS289-2008《霍乱诊断标准》霍乱防治手册（1999年第五版）

样品的采集和运输采集：

病例：粪便、肛拭子、呕吐物未使用抗生素之前“健康”人：粪便、肛拭子其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品……

监测：水样，水产品等运输：一般要求在3小时内室温（20-25℃）条件下送达实验室检测

C-B运输培养基（pH8.4）;（或文腊二氏保存液）

碱性蛋白胨水（pH8.4-9.2）

：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，尽量采用C-B运输培养基。水体的采集与保存运送

水体的采集一般用无菌的500ml水样瓶采集相对静止的表层水(深度为30cm以内)500ml，密封加盖后于室温（20-25℃）3小时内送达实验室检测。分离培养要点（十倍浓缩碱胨水增菌培养法）：

取450ml水样，用1M氢氧化钠调整至pH8.4-9.2。然后加10倍浓缩碱性胨水50ml。再加入1%亚碲酸钾0.25～0.5ml和1000单位/ml青霉素1ml。37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）分离培养，同时吸0.1～0.2ml表层培养物转种于碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）。

水体分离流程及技术要点可疑菌落挑取经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验，鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良好后再次进行玻片凝集试验加以确证。

庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。

TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐。（TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）

平板分离及可疑菌落挑取TCBS平板培养菌落形态（呈黄色）霍乱弧菌在庆大培养基上菌落形态。(菌落呈现无色、圆形半透明、湿润、扁平或稍突起、边缘整齐，由于亚碲酸钾的作用，菌落中央常呈灰色或灰黑色）Ｏ１３９型霍乱弧菌在４号平板和ＴＣＢＳ上的菌落形态

O1群和O139群抗原构造与血清分型型别群特异性抗原型特异性抗原AO139BC小川+++少量稻叶+—+彦岛+++O139—+——国内商品化的霍乱检测血清国外血清：日本生研，泰国S&A血清等生化鉴定

生化鉴定管：发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、产酸不产气能分解色氨酸赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+）精氨酸双水解酶（-）

霍乱弧菌生化鉴定管（11种生化,套装，环凯）；

生化鉴定条：梅里埃API20E鉴定条等全自动生化检测仪检测：梅里埃VITEK2COMP全自动生化鉴定卡等进一步分型鉴定(省CDC进行)

噬菌体分型

PFGE脉冲场分型

进一步实验针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌后的菌液进行快速检测胶体金快速检测卡

O1群霍乱胶体金标记快诊卡

O139群霍乱胶体金标记快诊卡荧光PCR快速检测试剂盒

O1群、O139群双色荧光检测试剂盒

霍乱CTX毒力基因荧光检测试剂盒注：快速检测并不能替代常规检测的进行，只是作为辅助检测的一种手段霍乱快速检测技术的应用

荧光PCR检测霍乱弧菌病例标本检测环境和食品调查的初筛方法O1群、O139群双色荧光检测试剂盒深圳生科源生物技术有限公司O1群和O139群霍乱弧菌的检验程序鉴定分型确诊报告胶体金、荧光PCR快速诊断增菌培养（碱胨水）分离培养庆大霉素、4号、TCBS琼脂标本（粪便等）玻片凝集阳性（结合菌落、菌体形态）凝集菌落或可疑菌落纯培养（营养琼脂或克氏双糖培养）第二次增菌（碱胨水）初步报告10-20小时6-8小时10-20小时直接检测工作中应关注的事项

生物安全与个人防护（生物安全2级实验室操作，做好个人防护，整个培养流程产生的实验培养