植物原生质体组织培养课件

第七章

植物原生质体的分离与培养7.1原生质体培养的意义及分离技术—原生质体制备7.2原生质体的培养与植株再生，原生质体的融合及体细胞杂种的鉴定与筛选第七章植物原生质体的分离与培养7.1原生质体培养的意义及植物原生质体培养和细胞融合原生质体的分离与培养概念及研究进展原生质体融合植物原生质体培养和细胞融合原生质体的分离与培养概念及研究进展原生质体(protoplast)：

脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球

原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体(subprotoplast)在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的减少而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。核质体(nuclearplast)由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体。胞质体(cytoplast)不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。第一节

原生质体培养的意义及分离技术原生质体(protoplast)：

脱去细胞壁、裸露的细胞ProtoplastsystemOrganogenesisRegenerativeabilityOntogenicprocessesCelldifferentiationSomaticgeneticsCellphysiologyCellcloningOrganelle,DNAuptakeCellfusion应用ProtoplastsystemOrganogene植物细胞育种中的核质替换细胞质杂种的获得远缘杂交创造新物种细胞细胞器的互作研究意义植物细胞育种中的核质替换意义植物原生质体的分离和培养材料预处理原生质体分离的方法原生质体纯化原生质体活力测定影响原生质体数量和活力的因素原生质体培养方法影响原生质体培养的因素原生质体再生过程Flash植物原生质体的分离和培养材料预处理Flash用于分离原生质体的材料材料预处理用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。

☆龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。

☆甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才能分裂。

☆马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体，才能获得高产量。用于分离原生质体的材料材料预处理用黑暗处理、低温处理和不同光原生质体分离的方法酶解分离法机械分离法原生质体分离的方法酶解分离法机械分离法机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质酶解分离法：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。酶解分离法：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一酶来源生产厂家纤维素酶类OnozukaR-10绿色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin绿色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan酶来源生产厂家纤维素酶类OnozukaR-10绿色木霉Ya酶来源生产厂家果胶酶类MacerozymeR-10根霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo.PectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纤维素酶RhozymeHP-150黑曲霉RohmandHassCo.,Rhiladelphia,UAS酶来源生产厂家果胶酶类MacerozymeR-10根霉Ya酶解法的优缺点优点：获得量大，适用广泛。缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。 会影响所获原生质体的活力。酶解法的优缺点优点：获得量大，适用广泛。沉降法漂浮法不连续梯度法原生质体纯化的方法沉降法漂浮法不连续梯度法原生质体纯化的方法飘浮法Protoplast采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。优点：可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。所用药品简单，成本低。缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。飘浮法Protoplast采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗沉降法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。优缺点：

纯化原生质体比较简单。由于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。沉降法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。12mL碎片带含原生质体带0.6mL

0.45M蔗糖0.45M甘露醇不连续梯度法又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使植物原生质体组织培养课件植物原生质体组织培养课件植物原生质体组织培养课件原生质体鉴定低渗爆破法荧光增白剂法(calcoflowerwhite0.1%)原生质体鉴定低渗爆破法原生质体活力测定形态识别

形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。原生质体活力测定形态识别原生质体活力测定荧光显微镜识别(FDA法)FDA(fluoresceindiacetate)

本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。使用浓度：0.01%原生质体活力测定荧光显微镜识别(FDA法)使用原生质体活力测定酚藏花红染色法（0.1%)酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。 伊凡蓝(Evan’sblue)染色法(0.025%)有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。

原生质体活力测定酚藏花红染色法（0.1%)伊凡影响原生质体数量和活力的因素供试材料及预处理方法酶解条件：酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度渗透压稳定剂质膜稳定剂分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间。分离用具

影响原生质体数量和活力的因素供试材料及预处理方法酶的种类、组合、浓度材料纤维素酶半纤维素酶崩溃酶果胶酶离析酶蜗牛酶研究者烟草叶片禾谷类叶片油菜花粉马铃薯子叶马铃薯花粉1.02.01.01.01.00.51.00.1~0.20.50.51.0UchimiyaScott李仕琼戴朝曦王蒂几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)酶的种类、组合、浓度材料纤维素酶半纤维素酶崩溃酶果胶酶离析酶材料纤维素酶半纤维素酶崩溃酶果胶酶离析酶研究者枸杞愈伤组织檀香幼叶檀香愈伤组织榆幼叶山毛榉幼叶胡杨悬浮细胞0.52.01.00.1~0.21.00.50.50.50.20.50.050.50.50.01~0.030.11.00.20.50.5孙勇如等LakshmiLakshmiDorinAhuja诸葛强几种木本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)材料纤维素酶半纤维素酶崩溃酶果胶酶离析酶研究者枸杞愈伤组织0pH分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH值是不一致的。如制备菜豆叶片原生质体时：低pH（<4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，被破坏的细胞较多;pH值偏高（7.0），酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。pH分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的问题。因为降解酶光照和温度制备原生质体时，在细胞中加入酶液、渗透压稳定剂、质膜稳定剂后，还需在一定时间内保持一定的温度，原生质体方能释放。脱壁的原生质体对光非常敏感，分离原生质体一般是在黑暗条件下进行的。在28℃条件下，每分钟40转的旋转式摇床上培养4h后，叶片组织可完全分离。悬浮细胞需在25℃～33℃条件下酶解24h。光照和温度制备原生质体时，在细胞中加入酶液、渗透压稳定剂、质渗透压稳定剂原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起细胞破碎。因而在酶液、原生质体洗涤液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内外渗透压平衡，防止细胞涨破或过分收缩而破坏内部结构。常用的渗透压稳定剂：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，浓度约在0.40M~0.80M。渗透压稳定剂还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂。渗透压稳定剂原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起细胞破质膜稳定剂目的：增加完整原生质体的数量，防止质膜破坏，促进原生质体细胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。常用的质膜稳定剂 葡聚糖硫酸钾、2-（N-吗啉）-乙烷磺酸、氯化钙、磷酸二氢钾。质膜稳定剂目的：增加完整原生质体的数量，防止质膜破坏，促进原原生质体培养方法原生质体培养方法液体浅层培养法优点：原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。液体浅层培养法优点：双层培养法——液体-固体双层培养法优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。双层培养法——液体-固体双层培养法优点：固体薄层培养法优点：使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。缺点：培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。固体薄层培养法优点：琼脂糖珠培养将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ml一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育，这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。琼脂糖珠培养将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50影响原生质体培养的因素原生质体的活力原生质体的起始密度适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率常显著提高。渗透压稳定剂培养基营养原生质体培养经常使用的KM-P培养基就是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS培养基为基础改进的。影响原生质体培养的因素原生质体的活力影响原生质体培养的因素培养条件温度，光照植物材料和基因型柑桔，葡萄，桃供体细胞的生长同步性影响原生质体培养的因素培养条件原生质体再生过程原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分化出完整植株的过程。细胞壁再生细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成植株再生原生质体再生过程原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质体在适细胞壁再生是细胞分裂的先决条件再生所需时间与植物种类和起源细胞的分化程度及生理状态有关。再生过程：先是质膜合成细胞壁主要成分微纤维，然后在质膜表面进行聚合作用，形成多片层的结构，以后在质膜和片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。检测新壁合成的方法荧光增白剂法(calcoflowerwhite0.1%)和电镜技术细胞壁再生是细胞分裂的先决条件再生所需时间与植物种类和起源细细胞分裂植株再生愈伤组织或胚状体形成细胞分裂植株再生愈伤组织或胚状体形成原生质体类型第一次分裂时间%植板率(%)细胞分裂情况愈伤组织分化速度原生质体到再生植株烟草叶片4d

602周—20个细胞组成的细胞团1m形成芽3m胡萝卜培养细胞6d

8~10d形成细胞团，4周后形成胚状体胚状体3周后成苗4m矮牵牛愈伤组织4d2周后形成20~25个细胞的细胞团8~10周出芽3m油菜叶片2~3d15d形成细胞团28d愈伤组织10d分化出芽3m马铃薯子叶48h9~10d形成16个细胞的细胞团2m马铃薯花粉2h15d形成细胞团几种不同类型的原生质体分裂和发育速度比较6010-205-301046.1原生质体类型第一次分裂植板率细胞分裂情况愈伤组织分化速度原生第二节原生质体融合及培养原生质体融合方法原生质体融合类型第二节原生质体融合及培养原生质体融合方法植物原生质体组织培养课件原生质体融合（protoplastfusion)

体细胞杂种：杂种细胞可进一步发育成杂种植物体。由融合细胞培养成的植株称为体细胞杂种植株。两种异源（种、属间）原生质体，在人工控制条件下，相互接触从而发生膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种细胞的过程。原生质体融合（protoplastfusion)体细胞诱导原生质体融合的方法化学融合(chemicalfusion)定义：利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。主要种类：盐类融合法（NaNO3融合）高pH-高浓度钙离子融合法PEG融合法电融合(electrofusion)利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法。诱导原生质体融合的方法化学融合(chemicalfusioNaNO3融合法机理：

NaNO3能诱导原生质体融合的原因是钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触，促进细胞融合原生质体表面带有负电荷(-10～-30mV)，同性质电荷彼此凝聚的原生质体质膜无法靠近到足以融合的程度。融合率0.1%~4%。例子：Power（1970），玉米与燕麦原生质体融合NaNO3融合法机理：高pH-高浓度钙离子融合法Keller和Melchers(1972，1974)首先发现高pH-高浓度钙离子的诱发融合效应。机理：钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结合；高pH又能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合钙离子浓度和pH范围因植物种类不同而异。（例：烟草原生质体融合－－pH10.5，0.05mMCaCl2）高pH-高浓度钙离子融合法Keller和Melchers(1PEG融合法诱导融合的机理PEG具有分子桥的作用

原生质体－水、蛋白质和碳水化合物－（氢键）PEG（氢键）－原生质体 打破电荷平衡 再经高浓度Ca2＋和高pH溶液处理并用培养液清洗，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连到另一种原生质体的带负电荷的基团上，导致原生质体融合。PEG融合法诱导融合的机理PEG融合技术的要点融合液配置A液：CaCl2 2~8mM KH2PO4 0.5~0.7mM

甘露醇或山梨醇 0.1~0.2mM PEG（分子量6000） 25%~30% pH 5.8 B液：CaCl2 2~8mM KH2PO4 0.5~0.7mM

甘露醇或山梨醇 0.1~0.2mM pH 7.0~10.0 PEG融合技术的要点融合液配置PEG融合技术的要点融合原生质体的密度和比例密度：1×105个/毫升比例：1:1融合融合原生质体溶液0.1~0.5ml，静置3～5min融合液A0.1~0.5ml，保持15~20min，25℃融合液B0.1~0.5ml，保持10~20min，25℃培养液洗涤（3～4次），离心（100×g，5min）PEG融合技术的要点融合原生质体的密度和比例植物原生质体组织培养课件电融合基本原理：在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接、融合，形成融合体。电融合基本原理：电融合将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室微电极型平行多电极两个电极的端部同时与两个靠近的原生质体膜表面接触，原生质体由于脉冲电流间断刺激，两层膜间产生小孔，连接成桥，经点连接到面连接，最后形成融合体。平行多电极通过1MHz交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。此时，加入直流电脉冲，质膜被击穿，进一步形成融合体电融合将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室微电极型平行植物原生质体组织培养课件电融合与PEG融合比较起来，电融合的优点：不存在对细胞的毒害问题融合效率高融合技术操作简便电融合参数（例：马铃薯，融合率>40%）交变电场的振幅频率 100V/cm交变电场处理时间 20s直流高频电压 1100V/cm脉冲宽度 60us脉冲次数 1电融合与PEG融合比较起来，电融合的优点：融合类型自发融合诱发融合对称融合非对称融合核失活细胞质失活Flash融合类型自发融合Flash影响原生质体融合的因素原生质体质量至关重要，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件。融合方法融合参数，包括各种融合液都应选择适当。影响原生质体融合的因素原生质体质量至关重要，高质量的原生质体融合体类型异核体(heterokaryon)或异核细胞基因型不同的原生质体融合成杂交细胞同核体(homokaryon)基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞非对称杂种或细胞质杂种融合体类型异核体(heterokaryon)或异核细(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交过程示意图标志去壁(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交过程示意图植物体细胞的杂交过程植物体细胞的杂交过程细胞质工程

(cytoplasmicengineering)细胞质工程又称细胞拆合工程是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研究和育种工作。

细胞质工程

(cytoplasmicengineering细胞质工程细胞质杂种应用细胞融合技术，使两种来源不同的核外遗传物质与一个特定的核基因组结合在一起细胞质杂种获得途径（4条）：一个正常原生质体与一个去核原生质体融合；Lorz等（1981）用密度梯度离心（5％~50%Percoll，20000~40000g，40~90min）获得高纯度的去核原生质体。细胞质工程细胞质杂种细胞质工程细胞质杂种获得途径一个正常原生质体和一个核失活原生质体融合使核失活的方法：X射线，碘乙酰胺，罗丹明异核体形成后，两个核中有一个消失；较晚时期，染色体选择性消失。细胞质工程细胞质杂种获得途径体细胞杂种产生的其它途径细胞器移植叶绿体移植叶绿体的来源 叶片－－－机械法－低速离心 原生质体－低渗涨破－低速离心叶绿体的纯化

Percoll或蔗糖密度梯度离心叶绿体的转移

夹层离心法和PEG诱导融合应用PEG诱导胡萝卜原生质体摄入藻类叶绿体利用叶绿体的转移使低光效作物的原生质体通过摄取高光效作物的叶绿体而提高其光合效率。体细胞杂种产生的其它途径细胞器移植细胞器移植细胞核移植细胞核的来源 植物组织－机械法（加TritonX-100）－过滤离心 原生质体－低渗涨破(加TritonX-100)－过滤离心细胞核的纯化

Percoll或蔗糖密度梯度离心细胞核的转移

夹层离心法：原生质体－核－原生质体－核∙∙∙PEG诱导

电场诱导和微注射体细胞杂种产生的其它途径细胞器移植体细胞杂种产生的其它途径体细胞杂种产生的其它途径微生物移植内吞作用摄入固氮根瘤菌外源染色体和DNA的摄入染色体分离细胞－同步化处理－原生质体－涨破－差速离心（200g,10min；1000g，20min）转移方法PEG诱导，显微注射农杆菌介导，基因抢，电穿孔，超声波，激光穿孔体细胞杂种产生的其它途径微生物移植体细胞杂种选择及杂种植株鉴定根据可见标记性状的机械选择法体细胞杂种选择及杂种植株鉴定根据可见标记性状的机械选择法体细胞杂种选择及杂种植株鉴定。

FITC(异硫氰酸荧光素)在荧光显徽镜下呈绿色RITC(异硫氰酸罗丹明)

RITC在荧光显徽镜下呈红色体细胞杂种选择及杂种植株鉴定。

FITC(异硫氰酸荧光素体细胞杂种选择及杂种植株鉴定根据其遗传和生理生化特性的互补选择法体细胞杂种选择及杂种植株鉴定根据其遗传和生理生化特性的互补选互补选择法互补选择法是指利用两个亲本具有不同遗传和生理特性,在特定培养条件下,只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。抗性互补选择法营养代谢互补选择法生长互补选择法 矮牵牛+爬山虎融合体的选择互补选择法互补选择法是指利用两个亲本具有不同遗传和生理特性,原生质体矮牵牛爬山虎冠瘿混合体融合处理矮牵牛+爬山虎细胞团愈伤组织（异核体）NT培养基MS培养基(无激素)NT培养基NT培养基细胞团MS培养基(无激素)死亡MS培养基(有激素)愈伤组织原生质体细胞团MS培养基(无激素)死亡愈伤组织原生质体矮牵牛爬山虎冠瘿混合体融合处理矮牵牛+爬山虎细胞团愈体细胞杂种选择及杂种植株鉴定细胞学鉴定利用染色体显带技术，以亲本染色体为对照，对细胞杂种的染色体数目、形态和带型进行观察。体细胞杂种选择及杂种植株鉴定细胞学鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定同功酶鉴定根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴别杂种。有的呈双亲谱带的总和、有的出现新谱带或丢失部分亲本谱带。常用的鉴定酶为：乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、过氧化物酶、酯酶等。体细胞杂种选择及杂种植株鉴定同功酶鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定DNA分子标记鉴定是在DNA水平上对亲本和杂种植株遗传差异进行鉴定的一种技术。依据DNA的多态性（polymorphism）RandomAmplifiedPolymorphicDNA体细胞杂种选择及杂种植株鉴定DNA分子标记鉴定Random体细胞杂种选择及杂种植株鉴定体细胞杂种选择及杂种植株鉴定主要原因：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯—番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？主要原因：为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想形似白菜味近甘蓝生长期短耐热性强易于储存形似白菜味近甘蓝生长期短P38思考与探究2P38思考与探究2小结原生质体是植物除去细胞壁的裸露细胞，是进行各种细胞操作的理想系统。原生质体的分离和纯化是对其操作和培养的前提。分离的原生质体活性受供体材料和分离条件的影响。原生质体培养是细胞工程精细技术，培养技术成熟程度直接影响体系的应用。小结原生质体是植物除去细胞壁的裸露细胞，是进行各种细胞操作的小结原生质体融合是获得胞质杂种的理想途径。体细胞杂交在远缘育种和新物种、新资源创造中具有深远意义。原生质体融合技术主要有PEG融合及电融合提高融合效率和融合细胞培养重复性是该技术研究的重点小结原生质体融合是获得胞质杂种的理想途径。思考题1．原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原生质球的概念。2．为什么原生质体要培养在等渗培养基中？3．影响原生质体培养的主要因素。4．原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点5．为什么说原生质体培养系统是现代生物技术的载体？思考题1．原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原生质球的概念思考题6．植物体细胞杂交的概念和类型。7.什么是细胞质工程？8．对称融合和非对称融合的概念及非对称融合的作用。9．PEG融合与电融合的原理及影响因素。10．杂种细胞的获得和选择方法。思考题6．植物体细胞杂交的概念和类型。第七章

植物原生质体的分离与培养7.1原生质体培养的意义及分离技术—原生质体制备7.2原生质体的培养与植株再生，原生质体的融合及体细胞杂种的鉴定与筛选第七章植物原生质体的分离与培养7.1原生质体培养的意义及植物原生质体培养和细胞融合原生质体的分离与培养概念及研究进展原生质体融合植物原生质体培养和细胞融合原生质体的分离与培养概念及研究进展原生质体(protoplast)：

脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球

原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体(subprotoplast)在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的减少而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。核质体(nuclearplast)由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体。胞质体(cytoplast)不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。第一节

原生质体培养的意义及分离技术原生质体(protoplast)：

脱去细胞壁、裸露的细胞ProtoplastsystemOrganogenesisRegenerativeabilityOntogenicprocessesCelldifferentiationSomaticgeneticsCellphysiologyCellcloningOrganelle,DNAuptakeCellfusion应用ProtoplastsystemOrganogene植物细胞育种中的核质替换细胞质杂种的获得远缘杂交创造新物种细胞细胞器的互作研究意义植物细胞育种中的核质替换意义植物原生质体的分离和培养材料预处理原生质体分离的方法原生质体纯化原生质体活力测定影响原生质体数量和活力的因素原生质体培养方法影响原生质体培养的因素原生质体再生过程Flash植物原生质体的分离和培养材料预处理Flash用于分离原生质体的材料材料预处理用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。

☆龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。

☆甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才能分裂。

☆马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体，才能获得高产量。用于分离原生质体的材料材料预处理用黑暗处理、低温处理和不同光原生质体分离的方法酶解分离法机械分离法原生质体分离的方法酶解分离法机械分离法机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质酶解分离法：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。酶解分离法：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一酶来源生产厂家纤维素酶类OnozukaR-10绿色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin绿色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan酶来源生产厂家纤维素酶类OnozukaR-10绿色木霉Ya酶来源生产厂家果胶酶类MacerozymeR-10根霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo.PectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纤维素酶RhozymeHP-150黑曲霉RohmandHassCo.,Rhiladelphia,UAS酶来源生产厂家果胶酶类MacerozymeR-10根霉Ya酶解法的优缺点优点：获得量大，适用广泛。缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。 会影响所获原生质体的活力。酶解法的优缺点优点：获得量大，适用广泛。沉降法漂浮法不连续梯度法原生质体纯化的方法沉降法漂浮法不连续梯度法原生质体纯化的方法飘浮法Protoplast采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。优点：可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。所用药品简单，成本低。缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。飘浮法Protoplast采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗沉降法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。优缺点：

纯化原生质体比较简单。由于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。沉降法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。12mL碎片带含原生质体带0.6mL

0.45M蔗糖0.45M甘露醇不连续梯度法又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使植物原生质体组织培养课件植物原生质体组织培养课件植物原生质体组织培养课件原生质体鉴定低渗爆破法荧光增白剂法(calcoflowerwhite0.1%)原生质体鉴定低渗爆破法原生质体活力测定形态识别

形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。原生质体活力测定形态识别原生质体活力测定荧光显微镜识别(FDA法)FDA(fluoresceindiacetate)

本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。使用浓度：0.01%原生质体活力测定荧光显微镜识别(FDA法)使用原生质体活力测定酚藏花红染色法（0.1%)酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。 伊凡蓝(Evan’sblue)染色法(0.025%)有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。

原生质体活力测定酚藏花红染色法（0.1%)伊凡影响原生质体数量和活力的因素供试材料及预处理方法酶解条件：酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度渗透压稳定剂质膜稳定剂分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间。分离用具

影响原生质体数量和活力的因素供试材料及预处理方法酶的种类、组合、浓度材料纤维素酶半纤维素酶崩溃酶果胶酶离析酶蜗牛酶研究者烟草叶片禾谷类叶片油菜花粉马铃薯子叶马铃薯花粉1.02.01.01.01.00.51.00.1~0.20.50.51.0UchimiyaScott李仕琼戴朝曦王蒂几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)酶的种类、组合、浓度材料纤维素酶半纤维素酶崩溃酶果胶酶离析酶材料纤维素酶半纤维素酶崩溃酶果胶酶离析酶研究者枸杞愈伤组织檀香幼叶檀香愈伤组织榆幼叶山毛榉幼叶胡杨悬浮细胞0.52.01.00.1~0.21.00.50.50.50.20.50.050.50.50.01~0.030.11.00.20.50.5孙勇如等LakshmiLakshmiDorinAhuja诸葛强几种木本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)材料纤维素酶半纤维素酶崩溃酶果胶酶离析酶研究者枸杞愈伤组织0pH分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH值是不一致的。如制备菜豆叶片原生质体时：低pH（<4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，被破坏的细胞较多;pH值偏高（7.0），酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。pH分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的问题。因为降解酶光照和温度制备原生质体时，在细胞中加入酶液、渗透压稳定剂、质膜稳定剂后，还需在一定时间内保持一定的温度，原生质体方能释放。脱壁的原生质体对光非常敏感，分离原生质体一般是在黑暗条件下进行的。在28℃条件下，每分钟40转的旋转式摇床上培养4h后，叶片组织可完全分离。悬浮细胞需在25℃～33℃条件下酶解24h。光照和温度制备原生质体时，在细胞中加入酶液、渗透压稳定剂、质渗透压稳定剂原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起细胞破碎。因而在酶液、原生质体洗涤液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内外渗透压平衡，防止细胞涨破或过分收缩而破坏内部结构。常用的渗透压稳定剂：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，浓度约在0.40M~0.80M。渗透压稳定剂还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂。渗透压稳定剂原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起细胞破质膜稳定剂目的：增加完整原生质体的数量，防止质膜破坏，促进原生质体细胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。常用的质膜稳定剂 葡聚糖硫酸钾、2-（N-吗啉）-乙烷磺酸、氯化钙、磷酸二氢钾。质膜稳定剂目的：增加完整原生质体的数量，防止质膜破坏，促进原原生质体培养方法原生质体培养方法液体浅层培养法优点：原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。液体浅层培养法优点：双层培养法——液体-固体双层培养法优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。双层培养法——液体-固体双层培养法优点：固体薄层培养法优点：使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。缺点：培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。固体薄层培养法优点：琼脂糖珠培养将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ml一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育，这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。琼脂糖珠培养将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50影响原生质体培养的因素原生质体的活力原生质体的起始密度适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率常显著提高。渗透压稳定剂培养基营养原生质体培养经常使用的KM-P培养基就是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS培养基为基础改进的。影响原生质体培养的因素原生质体的活力影响原生质体培养的因素培养条件温度，光照植物材料和基因型柑桔，葡萄，桃供体细胞的生长同步性影响原生质体培养的因素培养条件原生质体再生过程原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分化出完整植株的过程。细胞壁再生细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成植株再生原生质体再生过程原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质体在适细胞壁再生是细胞分裂的先决条件再生所需时间与植物种类和起源细胞的分化程度及生理状态有关。再生过程：先是质膜合成细胞壁主要成分微纤维，然后在质膜表面进行聚合作用，形成多片层的结构，以后在质膜和片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。检测新壁合成的方法荧光增白剂法(calcoflowerwhite0.1%)和电镜技术细胞壁再生是细胞分裂的先决条件再生所需时间与植物种类和起源细细胞分裂植株再生愈伤组织或胚状体形成细胞分裂植株再生愈伤组织或胚状体形成原生质体类型第一次分裂时间%植板率(%)细胞分裂情况愈伤组织分化速度原生质体到再生植株烟草叶片4d

602周—20个细胞组成的细胞团1m形成芽3m胡萝卜培养细胞6d

8~10d形成细胞团，4周后形成胚状体胚状体3周后成苗4m矮牵牛愈伤组织4d2周后形成20~25个细胞的细胞团8~10周出芽3m油菜叶片2~3d15d形成细胞团28d愈伤组织10d分化出芽3m马铃薯子叶48h9~10d形成16个细胞的细胞团2m马铃薯花粉2h15d形成细胞团几种不同类型的原生质体分裂和发育速度比较6010-205-301046.1原生质体类型第一次分裂植板率细胞分裂情况愈伤组织分化速度原生第二节原生质体融合及培养原生质体融合方法原生质体融合类型第二节原生质体融合及培养原生质体融合方法植物原生质体组织培养课件原生质体融合（protoplastfusion)

体细胞杂种：杂种细胞可进一步发育成杂种植物体。由融合细胞培养成的植株称为体细胞杂种植株。两种异源（种、属间）原生质体，在人工控制条件下，相互接触从而发生膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种细胞的过程。原生质体融合（protoplastfusion)体细胞诱导原生质体融合的方法化学融合(chemicalfusion)定义：利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。主要种类：盐类融合法（NaNO3融合）高pH-高浓度钙离子融合法PEG融合法电融合(electrofusion)利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法。诱导原生质体融合的方法化学融合(chemicalfusioNaNO3融合法机理：

NaNO3能诱导原生质体融合的原因是钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触，促进细胞融合原生质体表面带有负电荷(-10～-30mV)，同性质电荷彼此凝聚的原生质体质膜无法靠近到足以融合的程度。融合率0.1%~4%。例子：Power（1970），玉米与燕麦原生质体融合NaNO3融合法机理：高pH-高浓度钙离子融合法Keller和Melchers(1972，1974)首先发现高pH-高浓度钙离子的诱发融合效应。机理：钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结合；高pH又能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合钙离子浓度和pH范围因植物种类不同而异。（例：烟草原生质体融合－－pH10.5，0.05mMCaCl2）高pH-高浓度钙离子融合法Keller和Melchers(1PEG融合法诱导融合的机理PEG具有分子桥的作用

原生质体－水、蛋白质和碳水化合物－（氢键）PEG（氢键）－原生质体 打破电荷平衡 再经高浓度Ca2＋和高pH溶液处理并用培养液清洗，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连到另一种原生质体的带负电荷的基团上，导致原生质体融合。PEG融合法诱导融合的机理PEG融合技术的要点融合液配置A液：CaCl2 2~8mM KH2PO4 0.5~0.7mM

甘露醇或山梨醇 0.1~0.2mM PEG（分子量6000） 25%~30% pH 5.8 B液：CaCl2 2~8mM KH2PO4 0.5~0.7mM

甘露醇或山梨醇 0.1~0.2mM pH 7.0~10.0 PEG融合技术的要点融合液配置PEG融合技术的要点融合原生质体的密度和比例密度：1×105个/毫升比例：1:1融合融合原生质体溶液0.1~0.5ml，静置3～5min融合液A0.1~0.5ml，保持15~20min，25℃融合液B0.1~0.5ml，保持10~20min，25℃培养液洗涤（3～4次），离心（100×g，5min）PEG融合技术的要点融合原生质体的密度和比例植物原生质体组织培养课件电融合基本原理：在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接、融合，形成融合体。电融合基本原理：电融合将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室微电极型平行多电极两个电极的端部同时与两个靠近的原生质体膜表面接触，原生质体由于脉冲电流间断刺激，两层膜间产生小孔，连接成桥，经点连接到面连接，最后形成融合体。平行多电极通过1MHz交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。此时，加入直流电脉冲，质膜被击穿，进一步形成融合体电融合将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室微电极型平行植物原生质体组织培养课件电融合与PEG融合比较起来，电融合的优点：不存在对细胞的毒害问题融合效率高融合技术操作简便电融合参数（例：马铃薯，融合率>40%）交变电场的振幅频率 100V/cm交变电场处理时间 20s直流高频电压 1100V/cm脉冲宽度 60us脉冲次数 1电融合与PEG融合比较起来，电融合的优点：融合类型自发融合诱发融合对称融合非对称融合核失活细胞质失活Flash融合类型自发融合Flash影响原生质体融合的因素原生质体质量至关重要，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件。融合方法融合参数，包括各种融合液都应选择适当。影响原生质体融合的因素原生质体质量至关重要，高质量的原生质体融合体类型异核体(heterokaryon)或异核细胞基因型不同的原生质体融合成杂交细胞同核体(homokaryon)基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞非对称杂种或细胞质杂种融合体类型异核体(heterokaryon)或异核细(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交过程示意图标志去壁(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交过程示意图植物体细胞的杂交过程植物体细胞的杂交过程细胞质工程

(cytoplasmicengineering)细胞质工程又称细胞拆合工程是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研究和育种工作。

细胞质工程

(cytoplasmicengineering细胞质工程细胞质杂种应用细胞融合技术，使两种来源不同的核外遗传物质与一个特定的核基因组结合在一起细胞质杂种获得途径（4条）：一个正常原生质体与一个去核原生质体融合；Lorz等（1981）用密度梯度离心（5％~50%Percoll，20000~40000g，40~90min）获得高纯度的去核原生质体。细胞质工程细胞质杂种细胞质工程细胞质杂种获得途径一个正常原生质体和一个核失活原生质体融合使核失活的方法：X射线，碘乙酰胺，罗丹明异核体形成后，两个核中有一个消失；较晚时期，染色体选择性消失。细胞质工程细胞质杂种获得途径体细胞杂种产生的其它途径细胞器移植叶绿体移植叶绿体的来源 叶片－－－机械法－低速离心 原生质体－低渗涨破－低速离心叶绿体的纯化

Percoll或蔗糖密