感染性疾病诊断技术新进展

感染性疾病诊断技术新进展感染性疾病：全球共同的挑战2016年，5岁以下儿童死亡的三大主要原因是呼吸道感染、新生儿早产并发症以及新生儿因出生窒息和创伤而导致的新生儿脑病，总共导致了1亿8千万人死亡在全球范围内，2016年死亡率的前五大原因主要是心血管疾病;腹泻、下呼吸道感染和其他常见感染性疾病;肿瘤;新生儿疾病;HIV/艾滋病和肺结核血流感染发展迅速，死亡率高院内死亡率达16%，比其他诊断的死亡率高8倍以上住院时间延长，住院费用高1990年-2003年间，败血症相关住院时间增长了153%，年均增长6%感染性疾病—严重感染导致住院时间延长感染性疾病—增加耐药菌感染的抗菌药物治疗花费传统临床微生物检测传统微生物检测方法：分离培养+抗原抗体检测+普通PCR检测缺点：细菌无法生长（应用抗生素后）病毒、真菌、寄生虫难以培养多种细菌混合很难分离鉴定厌氧菌经常被忽略无法准确定量局限性微生物实验室的挑战硬件设施和人员的技术水平、诊断水平等参差不齐微生物专家需多年的经验培养

传统鉴定能力有限

人力资源普遍不足平均每1000床位<5位临床微生物专家

<2012上海国际医院感染控制论坛>临床要求更快检验时效更高的工作强度临床微生物专家与临床医师对称、沟通有障碍较少涉略临床用药指引政策,评鉴需求增多抗菌药物临床应用管理办法（卫生部令第84号)三级综合医院评审标准实施细则耐药菌株逐年上升更多药物敏感性报告需求微生物实验室如何面对挑战?更加标准化更高效率更主动的信息交流更高质量微生物检测新技术的发展趋势敏感快速特异准确多种病原体同时检测（multiplex）高通量型别的鉴定MALDI-TOFGeneXpertFilmArray基因芯片检测高通量测序技术（NGS）有应用前景的微生物检测技术FilmarrayMALDI-TOF质谱技术（MALDI-TOFMS）是最新开发的鉴定固体培养基上分离的病原菌的方法原理：是在高真空系统中将样本分子离解成带电的离子，并通过对生成离子的质量和强度的测定，而进行样品成分和结构分析的方法BrukerABI岛津MALDI-TOFMS-基本原理激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电高过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程X轴：M/ZY轴：相对强度很直观的看到整个分子的质谱全貌质谱信号：分子离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰、重排离子峰等MALDI-TOFMS蛋白质指纹特征基于谱图模式比对的细菌鉴定2022/11/17MALDI-TOF鉴定流程MALDI-TOFvsVITEK2微生物培养（withoutMALDI)微生物培养（withMALDI)Day1接种平板培养；PCT接种平板培养，PCTDay2革兰染色，直接镜检；配置鉴定药敏菌悬液上机；及药敏试验MS检测1~3分钟鉴定出细菌报告临床；同时有选择做药敏Day3ID&AST临床报告药敏报告缩短报告TAT（24h）TAT时间——将数天数小时降低至数分钟传统VSMALDI-TOFMALDI-TOF用于血培养检测应用MALDI-TOFMS降低治疗成本将快速识别和易感技术与抗菌管理结合起来，大大改善了最佳治疗的时间，并降低了住院时间和总成本MALDITOF-MS优缺点优势：操作简单、快速一个样品从获得单克隆开始，到样本处理、谱图采集和获得鉴定结果可以在几分钟之内完成，操作简单、快速、通量高灵敏度高使用经久耐用且性能可靠的布鲁克•道尔顿的MALDI-TOF系列质谱仪，可以实现高重现性的快速可靠的检测准确度好MALDI-TOF获得的蛋白指纹图谱用作模式匹配，匹配分值用作鉴定结果的分级和归类，软件对所得的图谱进行归一化分析，其精巧的算法保证了鉴定的精确性缺点：MALDI-TOFMS检测的次代培养物，从血培养阳性到鉴定还需要24-36hr无法提供AST实时荧光定量PCR技术检测方法：SYBRGreenI

TaqMan

MolecularBeacon优势：扩增、检测在一个实时PCR反应系统中即时完成，快速、特异、敏感，最有发展前景检测对象：真菌、结核分枝杆菌、淋病奈瑟氏菌、HBV、HCV、HIV、解脲支原体、巨细胞病毒、EB病毒等20GeneXpert检测原理：应用microfluidiccartridges（微流样品管）中的超声装置破碎原始样品释放内含的DNA，并在各小室间转移并洗涤、纯化和浓缩DNA，在定量PCR反应管中进行实时荧光定量PCR反应，同时进行扩增和检测GeneXpert技术整合的微流控技术仪器平台试剂盒运行程序和对照GeneXpert检测流程2010年12月世界卫生组织宣布认可并向全球推荐使用XpertMTB/RIF技术用于结核病及利福平耐药的检测在2个小时之内直接检出病人痰标本中是否有结核分枝杆菌以及利福平耐药性GeneXpert技术GeneXpert可检测的其他项目检测难辨梭菌毒素用于抗生素相关性腹泻诊断耐药菌株的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因、碳青霉烯类耐药基因、万古霉素耐药肠球菌基因病毒及载量EV、Flu、H1N1、HIV-1、HCV等GeneXpert优点：全自动的工作流程整合了裂解、提取、扩增和实时检测的过程快速获得结果整合的超声裂解装置以快速获得核酸特殊的PCR反应管设计大大缩短PCR循环时间自动解读结果即时检测无需批次检测随时进行任意检测即插即用无需日常维护通过整合LIS系统即时获得结果Filmarray基本原理两种具有独特扩增产物序列的不同靶标的熔解曲线样本裂解、提纯、扩增、检测一步到位节省培养时间，缩短TAT48小时1小时报告覆盖80%常见病原微生物提供万古霉素等抗生素耐药基因情况Filmarray检测统一平台下的多种检测解决方案测试面广广泛的临床研究FilmarrayMEPanel与培养或PCR对比，FA对于脑脊液标本的检测9种病原体敏感性达100%；2种病原体一致性达85%以上

我院2017年Filmarray与DFA检查FilmarrayDFA法阳性率：58.02%阳性率：16.33%多重PCR用于微生物检测大多数呼吸道感染的临床表现是非特异的，可能由分枝杆菌、病毒、嗜肺军团菌、衣原体和支原体等病原微生物中的一种或几种感染引起。多重PCR在一个反应管中加入了多对引物来扩增不同靶基因的核苷酸片断，从而筛选临床标本中可能存在的多种病原菌。34高通量基因芯片用于微生物检测35基因芯片用于多种耐药基因的检测可以检测革兰阳性菌常见的90种耐药基因此平台可用于基础研究、食品安全和耐药监测高通量测序（NGS）边合成边测序，通过捕捉新生成的末端的标记来确定DNA的序列DNA文库的制备连接接头测序数据分析应用：基因组/宏基因组测序新一代高通量测序技术使得微生物基因组学获得长足发展高通量测序（NGS）NGS在临床领域的应用进展高通量测序（NGS）NGS检测病原体的优势当前应用的能快速诊断感