刘焰-201212本免疫学实验课件

医学免疫学实验刘焰2012.11

实验内容一、实验室规则二、实验报告书写要求三、自做实验项目：①对流免疫电泳②巨噬细胞吞噬功能试验③间接免疫荧光实验④ELISA双抗原夹心法测HBs-Ab

⑤凋亡细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳四、示教实验项目：①沉淀反应（单扩、双扩、火箭电泳、免疫电泳等）②淋巴细胞转化实验、E花环实验实验室规则1、穿好工作服。需要时严格进行无菌操作。禁止在实验室吃东西、吸烟。2、认真做好各项实验，各种实验物品按指定地点存放，使用后的吸管、滴管及玻片等放指定地方。3、实验中发生意外事故时，应立即报告及时处理，切勿隐瞒或自作主张，不按规定处理。4、爱护室内仪器设备，按使用规则操作，不得随意拨动电器开关，显微镜用好后要功能部件复位。实验室公用物品用完之后按原样放回，不得擅自借出或带出到其它实验室。5、节约使用实验材料，如不慎损坏了器材，应告知相关管理人员登记。6、实验完毕后整理操作区，关好水、电、门、窗。需培养的材料要标记组名，姓名等。

第一次实验

内容：

1、实验一对流免疫电泳（自做）2、实验二巨噬细胞吞噬功能检测（自做）3、单扩、双扩、对流、火箭、免疫电泳（示教）4、凝集反应、沉淀反应、免疫细胞检测等（理论）

要求掌握：1、抗原抗体反应特点、影响因素2、凝集反应、间接凝集反应、沉淀反应概念3、对流免疫电泳原理、吞噬细胞吞噬功能检测原理

第二次实验内容：

1、实验三ELISA双抗原夹心法测HBs-Ab

（自做）2、实验四间接免疫荧光（自做）3、实验五凋亡细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳（自做）

4、淋巴细胞转化实验、E花环实验结果（示教）

5、免疫标记技术、免疫细胞检测等（理论）要求掌握：

1、间接免疫荧光原理

2、ELISA（双抗原夹心法）原理

3、标记一种抗抗体可检测多种Ag-Ab的原理

4、凋亡细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳原理

实验一对流免疫电泳[原理]对流免疫电泳是双向琼脂扩散与电泳技术的结合。Ag或Ab分子在一定的pH溶液中带有电荷，在电场作用下可发生定向移动。将Ag、Ab分别加在pH为8.6缓冲液琼脂中电泳，因各种血清蛋白质都带负电荷，泳向阳极。由于电渗作用，液体则流向阴极，二者方向相反。Ab（多为丙种球蛋白）的等电点较高（pI6~7），故带负电荷少，所以电泳力小于电渗力，向阴极移动。而Ag的等电点较低（pI4~5），所带负电荷多，故其电泳力大于电渗力，向正极移动。如Ag、Ab相应，相遇，在比例适当时即形成白色沉淀线。由于电场限制了Ag、Ab分子的自由扩散，因而提高了试验的敏感性(提高10~20倍),并缩短了反应时间（与双向琼脂扩散相比）。

电渗负极

正极

AgAb

电泳力：

正极

正极

电渗力：

负极

负极[方法]

1.

制板：取一洁净载玻片，先用0.4%巴比妥琼脂铺底、烘干，放置水平台面上。再取4mL隔水煮融的1.3%巴比妥琼脂，立即浇注在已铺底的玻片上，制成厚薄均匀的琼脂板。2.

打孔：待琼脂凝固后，用打孔器按下图打孔，孔径3mm，孔距5mm。

3.加样：用微量加样器取Ag（人血清）20μL分别加于阴极侧1、2、3、4孔内，阳极侧5、6、7、8各孔均加抗体（抗人血清）。加样量以孔满为宜，但不可溢出孔外。

4.电泳：琼脂板放入电泳槽内，琼脂板两端用滤纸或纱布与缓冲液相接，Ag端接负极电源，抗体端接正极电源。按电场强度4~6V/cm电泳50min左右。方法：

实验二小鼠巨噬细胞吞噬功能的检测（体外法）[原理]巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在光学显微镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬率，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。[方法]

(1)小鼠巨噬细胞制备实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1ml。实验时眼球放血、断椎处死小鼠，新洁尔灭浸泡5分钟（或酒、洒精消毒皮肤），剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)用生理盐水(或1640)灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4ml)，1500r/min，离心10min，去上清，沉积细胞用生理盐水(或1640)洗二次（离心转速、时间同上）。最后沉积细胞用含10％小牛血清1640（约0.5ml）配成适当浓度备用(1-2×106／ml)。（2）白色念珠菌制备

将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30min灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。（3）吞噬细胞与菌混合培养取巨噬细胞0.5ml加l×l08／ml白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃温育30min。取2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数，或离心1000r／min,10min，取细胞沉淀混悬液制成涂片，甲醇固定，姆萨染色、油镜观察计数。[结果]高倍镜下观察计算：吞噬率％=(吞噬白色念珠菌的巨噬细胞数/100个巨噬细胞)×100％吞噬指数=至少含一个细菌的吞噬细胞百分率×每一个阳性细胞内吞噬真菌的平均数[注意事项]

1、菌与细胞混合后充分混匀非常重要。对于此实验，菌与吞噬细胞之比10：1时吞噬作用容易观察和计数。但是吞噬效果好，能真正反映实际情况又可被检测的比例为1：1。2、菌和细胞在摇床中作用的时间不超过30min，如果在37C条件下作用时间过长，被吞噬的菌很快会被裂解，也就不能计数为吞噬了菌的细胞。3、滴片时加入的细胞数依细胞的大小而定，如果使用的吞噬细胞是细胞系，细胞体积较大，那么加入的细胞数就相应的少一点。实验三ELISA（双抗原夹心法）检测HBs-Ab免疫标记技术

免疫标记技术是指用酶、荧光素、同位素、化学发光物等标记物质标记抗原或抗体，而进行的抗原抗体反应。该技术灵敏度高、特异性强，可进行定性、定量，及定位的检测。

酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)

属于固相免疫检测。利用AgAb反应具有特异性，Ag或Ab吸附到固相载体（例聚乙烯）表面，以及Ag或Ab与酶连接后，仍保持免疫活性和酶活性，当酶遇到相应底物时，可引起底物水解显色。此法的特异性及灵敏度与荧光及同位素标记相似，但其方法较以上两者简便，且不需特殊贵重仪器。常用ELISA检测方法有：间接法、抗原竞争法、夹心法（双抗体夹心法、双抗原夹心法）和其他方法。1、间接法2、抗原竟争法4、双抗原夹心法

实验三ELISA（双抗原夹心法）检测HBs-Ab[原理]

采用纯化HBsAg包被酶标板，加入待测标本，同时加入酶标抗原（HBsAg-HRP），当标本中存在抗HBsAg的抗体HBsAb时，HBsAb与包被HBsAg结合并与HBsAg-HRP结合形成

HBsAg－HBsAb-HBsAg-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。

辣根过氧化物酶（HRP）[材料]1、HBsAg包被酶标板2、酶标抗原（HBsAg-HRP）3、阳性对照（HBsAb+）4、阴性对照（HBsAb-）5、待测标本（血浆）6、洗涤液7、显色剂A+显色剂B（TMB底物）8、终止液[结果]先观察阳性对照孔、阴性对照孔、空白对照孔。待测样品孔颜色与阳性孔同，则为阳性。或样品OD值/阴性对照平均OD值≥2.1判断为阳性，否则为阴性。2wellsforneededdectectionoffirsthumanserum2wellsforneededdectectionofsecondhumanserum2wellsforPositivecontrol2wellsforNegativecontrol1wellforBlankAddonedropStopSolutionintoeachwell思考题为什么标记一种二抗能检测多对抗原抗体系统？

免疫荧光技术

是利用荧光素标记的抗体来分析或定位相应抗原，以测定细胞相应抗原的存在。广泛应用于免疫学中的一种荧光素是异硫氰酸荧光素（FITC），当在荧光显微镜下用紫外光照射时，其发出可见的黄绿色荧光。另一个广泛应用的荧光素是藻红蛋白（PE），其发红色荧光。免疫荧光技术主要包括直接法和间接法。实验四间接免疫荧光实验免疫荧光技术-直接法免疫荧光技术-间接法

实验四间接免疫荧光实验[原理]间接免疫荧光法是用荧光素标记二抗以检测Ag或Ab的一种实验技术。其原理是Ag首先与一抗结合，然后一抗再与荧光素标记的二抗结合，形成一个Ag-Ab1-荧光素标记Ab2的三分子复合物，在荧光显微镜下呈现荧光。[材料]1、抗原：外周血单个核细胞（PBMC）2、一抗：兔抗PBMC血清3、荧光素标记二抗：FITC-抗兔单克隆抗体4、其他：载玻片、接种环、pH7.2PBS、荧光显微镜等。[方法]1、制备抗原滴片：将PBMC用1mlPBS稀释，混匀。用吸管取1滴液体（约10ul）滴加到标本片黑色圈圈背面中央（圆圈正面中央已涂防脱片剂）。静止5-10分钟，待PBMC干燥。2、加一抗：滴加15uL稀释好的一抗至抗原片上，37℃湿盒孵育30分钟。3、洗涤：甩干标本片上液体，小心擦去圆圈周围的残余液体，于圆圈中央滴加洗脱液1滴，来回震荡，静置1分钟，再甩去液体。重复上述步骤，洗涤3次。4、加荧光二抗（整个实验过程需关闭强烈光源，避光！）

：迅速滴加荧光标记二抗15uL，37℃湿盒,孵育30分钟。5、洗涤：同步骤3，洗涤5次。

。6、镜检：用吸水纸印干玻片，荧光显微镜观察。FITC为绿色荧光。

[结果]

荧光显微镜观察：暗背景中有黄绿色明亮荧光的外周血单个核细胞[思考题]为什么用间接免疫荧光技术可以检测人PBMC？[方法]常规分离外周血单个核细胞

外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

1、无菌采集静脉血2ml,注入盛有1mlHank’s液（含20u/ml肝素）的试管中，混匀。2、吸取淋巴细胞分层液3ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液3ml小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。

3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层。4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加入另一支已含有2~5mlHank’s液的离心管中，混匀。5、室温下,1500rpm离心10min。6、弃上清，重复洗涤一次（即加入2~5mlHank’s液到离心管中，混匀。然后，室温下，1500rpm离心10min。）7、弃上清，用完全RPMI-16401ml定容，计数细胞，调整细胞悬液至所需浓度：一般每ml血可分离出1~2×106个单个核细胞。8、细胞活力检查取0.1ml细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，作湿片高倍镜检计数200个细胞，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。一般活性应在95％以上。实验五细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳[原理]细胞凋亡或程序性细胞死亡，是受基因控制的细胞自主性死亡的过程，是有别于细胞坏死的一种细胞死亡方式。凋亡细胞有其形态、化学等特征。其中最重要和最具有特征性的改变是Ca2+/Mg2+依赖性的核酸内切酶的激活而导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成以180~200bp为最小单位的单体或寡聚体片段。检测细胞凋亡的方法有形态学方法、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术、原位末端标记等方法。

DNA琼脂糖凝胶电泳是最早用于研究细胞凋亡的传统方法，是检测细胞凋亡过程中DNA降解的敏感、特异、快速的方法。随着核酸内切酶的活化，DNA降解成寡核小体，这些降解片段均为180~200bp或其整倍数的片段，通过电泳可形成典型的“梯状带”，而坏死细胞或凋亡后期的继发性坏死细胞DNA电泳后则成模糊的“涂片状”。

本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠胸腺淋巴细胞DNA在地塞米松诱导下细胞的凋亡现象。染色质的基本单位—核小体核小体(nucleosome)结构

DNA绕在组蛋白八聚体(H2A、H2B、H3、H4各一对)核心外1.8周(146bp)，形成核小体核心颗粒。

两个核小体核心颗粒之间有LinkerDNA(0-80bp)

核小体核心颗粒+Linker=核小体(180-200bp)核小体组蛋白DNA凋亡小体(apoptoticbody)

编程性死亡细胞的核DNA在核小体连接处断裂成核小体片段，并向核膜下或中央异染色质区聚集形成浓缩的染色质块。随着染色质不断聚集，核纤层断裂消失，核膜在核孔处断裂，形成核碎片。同时在编程性死亡过程中，由于不断脱水，细胞质不断浓缩，细胞体积减小。调亡细胞经核碎裂形成的染色质块(核碎片)，然后整个细胞通过发芽(bybudding)、起泡(byzelosls)等方式形成一个球形的突起，并在其根部绞窄而脱落形成一些大小不等，内含胞质、细胞器及核碎片的小体称为凋亡小体。

[材料]1、昆明小鼠2、RPMI-1640培养基3、小牛血清4、地塞米松5、基因组DNA抽提试剂盒6、10mg/mLRNA酶7、TE缓冲液(pH8.0)8、50×TAE电泳缓冲液9、DNAladder分子量标准品10、6×凝胶加样缓冲液11、眼科剪、眼科镊、不锈钢网、250目尼龙滤布、台式高速离心机、恒温水浴、琼脂糖凝胶电泳装置、紫外透色仪等[方法]一、制备小鼠胸腺细胞：颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取胸腺，去除小血管及结缔组织，浸入含5%小牛血清的预冷RPMI1640，先用不锈钢网研磨，再将研磨好的细胞悬液用250目尼龙滤布过滤，1000rpm离心4min，调节细胞浓度为2x106/mL待用。二、地塞米松诱导细胞凋亡：取上述2x106/mL浓度的胸腺细胞加入终浓度为1x10－5M的地塞米松，培养5h即为凋亡阳性细胞，对照组不加地塞米松。三、小鼠胸腺细胞DNA快速提取1.裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、RNaseA/蛋白酶K液=A液）：将诱导后或未诱导的细胞移入EP管（1.5ml）中，12000转/分离心10s后，彻底弃上清，离心管中加入100μlL液和20μlA液，充分混匀，置于55℃温浴20分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。

2.结合DNA阶段(使用到的试剂:结合缓冲液=B液、3MNaAC)加入10μl3MNaAC(pH4.8)，随后加入1250μlB液，充分振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心3分钟。将上清分2次加入到离心吸附管（注：离心吸附管上层容积为700ul左右，故eppendorf管中结合缓冲液需分2次加入到离心吸附管中）。静置1分钟，12000rpm离心30秒钟，倒掉收集管中废液。第二次同上，静置1分钟，离心30秒。

3.漂洗阶段（使用试剂：600ul漂洗缓冲液×2=W液）倒掉收集管中的废液，再加入600ulW液，12000rpm离心30秒。重复上述步骤，再次加入600ulW液，12000rpm离心30秒。倒掉废液，不加任何液体，再次12000rpm离心30秒（此步必须！）。

4.洗脱收获（使用试剂：50μl洗脱缓冲液=T液）小心取出离心吸附柱（不可沾上T液，因其中含有乙醇，会使提取DNA变性），将其套入一个干净的1.5mleppendorf管中，沿吸附柱的正中间小心加入50μlT液，尽量保证洗脱缓冲液在吸附材料上。静置1分钟后，于12000rpm离心1分钟。取出Eppendorf管，其中便是收集到的基因组DNA。5.电泳观察：（1）1％琼脂糖凝胶的制备称取1g琼脂糖粉溶于100ml1×TAE缓冲液中，隔水煮沸溶解(或微波炉中溶解),并加入DNA染料（比如：SYBRGreen染料0.01%）。取一定量上述1％琼脂糖制成凝胶板备用。（2）吸取10uL/20uLDNA与2uL/4uL上样缓冲液混匀,加到1％琼脂糖凝胶的样本孔中，室温，恒流75mA电泳1小时。（3）电泳结束后，从电泳槽中取出琼脂糖凝胶，在紫外灯下观察实验结果。续三、小鼠胸腺细胞DNA快速提取【结果】

加地塞米松培养的胸腺细胞DNA电泳后呈典型的“阶梯状”条带，与标准分子量DNA参照物比较，为多倍的180~200bpDNA片断。未加地塞米松培养的胸腺细胞，DNA无类似改变。细胞坏死对照的DNA电泳呈现弥漫的片状图谱。地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡1：DNAmarker;2-3：细胞坏死对照4-6：细胞凋亡；7：正常细胞对照1234567思考题为什么小鼠胸腺细胞用地塞米松诱导后易产生梯状DNA条带？免疫学检测抗原抗体检测（血清学反应）

细胞免疫检测

补充材料抗原抗体的检测方法凝集反应（直接凝集、间接凝集）沉淀反应（单向免疫扩散、双向免疫扩散、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫电泳、免疫比浊）补体参与反应标记技术（免疫荧光法、酶免疫测定、放射免疫测定、化学发光免疫法、免疫印迹法、免疫PCR）

1.特异性：抗原-抗体的结合是特异性结合2.可逆性：抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合3.阶段性：抗原抗体反应可分为两个阶段特异性结合阶段可见的反应阶段比例性：抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象与两者的分子比例密切相关抗原-抗体反应的特点抗原抗体比例对反应现象的影响抗原-抗体反应受多种因素影响1.电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液，以供给适应浓度的电解质。2.温度：一般常使用反应在37度水浴或孵育箱中进行。3.酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度

为PH6~8。（一）凝集反应

1、直接凝集①玻片凝集：定性实验，已知Ab测Ag？

用于细菌和血型鉴定玻片凝集反应是在玻片上将Ab直接与颗粒性Ag物质（如细菌、红细胞等）混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。

②试管凝集试验：半定量实验，已知Ag定量测Ab？。

用已知的定量的颗粒性Ag悬液直接与系列稀释的待检血清（Ab？）在试管内混合，经一定时间后，观察各管有无凝集，并根据凝集程度定量测定血清中的Ab水平及其效价。

试管凝集试验管号1234567盐水(mL)0.50.50.50.50.50.50.5

血清(mL)0.50.50.50.50.50.5弃0

抗原(mL)0.50.50.50.50.50.50.5终体积(mL)1.01.01.01.01.01.01.0

稀释度1：201：401：801：1601：3201：640盐水对照

结果++++++++++++--

效价——

能与定量Ag产生明显凝集现象（++）的血清最高稀释倍数。

2、间接凝集

将可溶性Ag（或Ab）包被在惰性颗粒载体（红细胞、乳胶颗粒等）表面，再与相应Ab（或Ag）反应，出现可见凝集物的现象。

（免疫微球）（二）沉淀反应定义：可溶性Ag（如血清蛋白、细胞裂解液或组织液等）与相应Ab特异性结合，在一定条件下，出现可见沉淀物的现象。

方法：

1、环状沉淀

2、

絮状沉淀

3、

免疫比浊4、

琼脂凝胶扩散：①单向免疫扩散②双向免疫扩散③对流免疫电泳④火箭电泳⑤免疫电泳①单向免疫扩散[原理]将某种特异性Ab混合于琼脂凝胶中，制成含Ab的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的Ag加入孔中。Ag在孔中向四周作辐射状扩散，如Ag与已知的Ab相对应，在两者比例适合处出现由免疫复合物所形成的白色沉淀环。沉淀环直径的大小与Ag的含量成正比。以不同浓度的标准Ag与固定浓度的Ab抗体反应后测得沉淀环的直径作为横坐标，以Ag浓度为纵坐标可绘制标准曲线。根据待测样本沉淀环的大小，从标准曲线中即可推算其含量。主要用于定量测定抗原或IgG、IgM、IgA方法：抗原浓度mg/ml）②双向免疫扩散[原理]将可溶性Ag和Ab分别加到琼脂板上相应的小孔中，使两者各自向四周扩散，若Ag与Ab相对应，两者相遇即发生特异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线。每一对应Ag和Ab可出现一条沉淀线，根据沉淀线的有无、位置、形状以及对比关系，可分析Ag或Ab成分。③对流免疫电泳[原理]对流免疫电泳是双向琼脂扩散与电泳技术的结合。Ag或Ab分子在一定的pH溶液中带有电荷，在电场作用下可发生定向移动。将Ag、Ab分别加在pH为8.6缓冲液琼脂中电泳，因各种血清蛋白质都带负电荷，泳向阳极。由于电渗作用，液体则流向阴极，二者方向相反。Ab（多为丙种球蛋白）的等电点较高（pH6~7），故带负电荷少，所以电泳力小于电渗力，向阴极移动。而Ag的等电点较低（pH4~5），所带负电荷多，故其电泳力大于电渗力，向正极移动。如Ag、Ab相应，相遇，在比例适当时即形成白色沉淀线。由于电场限制了Ag、Ab分子的自由扩散，因而提高了试验的敏感性(提高10~20倍),并缩短了反应时间（与双向琼脂扩