蛋白质的表达纯化课件

实验八蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定

(1)了解重组蛋白表达的方法和意义。

(2)了解亲和层析分离纯化的方法。实验八蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定(1)了解重组蛋白实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。实验原理本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL材料与试剂试剂[1]LB液体培养基：Trytone10g,yeastextract5g,NaCl10g,用蒸馏水配至1000mL.[2]氨苄青霉素：100mg/mL[3]上样缓冲液(GLB)：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,10mM2-ME,pH8.0[4]WashingBuffer（UWB）：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,pH6.3[5]ElutionBuffer(洗脱):100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,500mMImidazole,pH8.0[6]IPTG材料与试剂试剂实验步骤一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1.接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mLLB液体培养基中（含100ug/mL氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。2.转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600=0.6-0.8。取10ul样品用于SDS分析。3.加入IPTG至终浓度0.5mmol/l,37℃继续培养1-3h.4.12，000rpm离心10min,弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。实验步骤一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化1.重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融50ml菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液GLB,用吸管抽吸重悬,4℃12000rpm离心30min,将上清（总蛋白细胞裂解液）吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。2.NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mLNTA介质，并分别用8mL去离子水，8mL上样缓冲液GLB洗涤。(调速0.5ml/3分钟)。3.细胞裂解液3mL以10-15mL/h流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液。4.洗脱杂蛋白：用50mL洗涤缓冲液UWB以10-15mL/h流速洗柱，分别取10ul洗涤开始与结束时的样品用于SDS分析。5.洗脱目标蛋白：用10mL洗脱缓冲液洗柱，每管0.5－1mL，共收集6－10管，分别取10ul样品用于SDS分析。二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。30%Acr-Bis

Tris-HClpH8.8

H2O10%APTEMED5ml3ml4ml120ul20ul

灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。30%Acr-Bis3．制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配方如下：30%Arc-Bis

Tris-HClpH6.7

H2O10%APTEMED400ul750ul1800ul50ul10ul3．制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配方如下：30%4.灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。

4.灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入5．加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样10L。6．电泳：先恒压80V，待样品进入分离胶后，调电压为120V（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，停止电泳。5．加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜7．翘开玻璃板，将浓缩胶切掉,剥下凝胶，准备染色。8．凝胶染色：使用考马斯亮蓝R250染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约15-20秒，摇床振荡15分钟，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（25%乙醇，75%乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，每次10分钟。7．翘开玻璃板，将浓缩胶切掉,剥下凝胶，准备染色。注意事项(1)Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩。

(2)玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。

(3)样品槽模板梳齿应平整光滑。

(4)灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。

(5)切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。（6）电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。

(7)稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽，需800毫升。注意事项1.将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。2.在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。1.将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻3.将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内灌胶，放上梳子，待胶凝固。4.取出制好的玻璃（连带胶），将玻璃放入电极架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向电极架，厚玻璃的箭头朝上，玻璃与红色橡胶条必须完全紧贴。（需同时放置两块制好的胶，如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必须使塑料板与橡胶条完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容器。3.将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上5.将底座的开关打开，并向外拨动透明的架子，使中间空隙增大，放入电极架。6.如图所示将电极架往下压（约1~2mm），使底面完全接触。5.将底座的开关打开，并向外拨动透明的架子，使中间空隙增大，7.关上底座开关。8.放入电泳槽内，加上加样架加样。注意加样架与刚才制胶所用的梳子齿数必须一致。7.关上底座开关。8.放入电泳槽内，加上加样架加样。注意加实验八蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定

(1)了解重组蛋白表达的方法和意义。

(2)了解亲和层析分离纯化的方法。实验八蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定(1)了解重组蛋白实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。实验原理本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL材料与试剂试剂[1]LB液体培养基：Trytone10g,yeastextract5g,NaCl10g,用蒸馏水配至1000mL.[2]氨苄青霉素：100mg/mL[3]上样缓冲液(GLB)：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,10mM2-ME,pH8.0[4]WashingBuffer（UWB）：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,pH6.3[5]ElutionBuffer(洗脱):100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,500mMImidazole,pH8.0[6]IPTG材料与试剂试剂实验步骤一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1.接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mLLB液体培养基中（含100ug/mL氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。2.转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600=0.6-0.8。取10ul样品用于SDS分析。3.加入IPTG至终浓度0.5mmol/l,37℃继续培养1-3h.4.12，000rpm离心10min,弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。实验步骤一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化1.重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融50ml菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液GLB,用吸管抽吸重悬,4℃12000rpm离心30min,将上清（总蛋白细胞裂解液）吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。2.NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mLNTA介质，并分别用8mL去离子水，8mL上样缓冲液GLB洗涤。(调速0.5ml/3分钟)。3.细胞裂解液3mL以10-15mL/h流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液。4.洗脱杂蛋白：用50mL洗涤缓冲液UWB以10-15mL/h流速洗柱，分别取10ul洗涤开始与结束时的样品用于SDS分析。5.洗脱目标蛋白：用10mL洗脱缓冲液洗柱，每管0.5－1mL，共收集6－10管，分别取10ul样品用于SDS分析。二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。30%Acr-Bis

Tris-HClpH8.8

H2O10%APTEMED5ml3ml4ml120ul20ul

灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。30%Acr-Bis3．制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配方如下：30%Arc-Bis

Tris-HClpH6.7

H2O10%APTEMED400ul750ul1800ul50ul10ul3．制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配方如下：30%4.灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。

4.灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入5．加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样10L。6．电泳：先恒压80V，待样品进入分离胶后，调电压为120V（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，停止电泳。5．加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜7．翘开玻璃板，将浓缩胶切掉,剥下凝胶，准备染色。8．凝胶染色：使用考马斯亮蓝R250染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约15-20秒，摇床振荡15分钟，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（25%乙醇，75%乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，每次10分钟。7．翘开玻璃板，将浓缩胶切掉,剥下凝胶，准备染色。注意事项(1)Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩。

(2)玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。

(3)样品槽模板梳齿应平整光滑。

(4)灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。

(5)切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。（6）电泳时应选