aoac会议课件-3m演讲稿

过程中微生物快速检测技术和

效果验证难点分析ysis

of

critical

points

of

rapid

microbial

detection

and

cleanliness

performance

validation

in

food

process飚3M公司亚太区技术©

2014

3M.s.全球日注食品安全消费者饮食结构变化全球加强食品安全

制定公众意识的增强食品貿易全球化发展中国家肉和乳品消费的增加2©

2014

3M.s.致病菌沙门单增O157:H7金葡空弯广泛分布广泛分布反刍动物肠道,包括牛,

,绵羊,鹿及广泛分布产肠毒素(SET)土壤,水,农场牲畜鸟,老鼠,下水道生肉,禽类,鸡蛋,牛奶与乳制品,鱼,生乳和巴杀乳,奶酪,冰淇淋,新鲜蔬未煮熟或生的牛肉糜,紫花苜色拉,奶油烘焙食 生禽肉

–

鸡,

火品,即食熟肉,牛奶 鸡,

鸭,

鹅,

野禽,未猪类致病菌来源哪些食品GB29921-2013

食品安

家标准

食品中致病菌限量2014-07-01

实施3served.致病菌检测中的产品中致病菌出现的几率很低样品中致病菌的数量很少样品中致病菌的分布不均匀可能出现样品本底的干扰要求的检测限很低:1

CFU/25

g

或更低检测方法的灵敏度4©

2014

3M.s.检测范围外部生产加工环境原料货车/装卸车仓库地板非食品接触面空气地板墙壁下水道货盘通风设备产品半成品成品食品接触面设备包装生产线5©

2014

3M.s.6©

2014

3M.s.环境对致病菌检测时间的要求周一周二周三周四周五周六周日传统检测方法(5天）快速(1天）ATP检测

(实时）7©

2014

3M.s.致病菌检测技术平台金字塔便捷(Tier

2)快速方法自动或手动容易操作更快的結果基础(Tier

3)介意成本符合标准結果时间不太重要分子Nucleic

Acid

BasedPolymerase

Chain

ReactionIsothermal

DNA

Amplification培养基Dehydrates/Ready

to

Use

MediaChromogenic

Agar免疫ELISA

(Lateral

Flow

/

Color

Change)ELFA

(Fluorescence)优质(Tier

1)快速方法前沿科技全自動灵敏度与特异性提高更快的結果8©

2014

3M.s.89©

20143M.s.第1天:预增菌第2天:二次增菌第3天:划板第5天:判定第3天:检测第2天:检测技术难点：减少增菌步骤提高特异性提高检出限简化生化鉴定步骤缩短检测时间操作简便PCR技术原理:产生多个

拷贝的分子技术。依赖加热循环,包含多次的加热与冷却反应循环以使DNA分解及酶 。

变性,退火和延伸的过程重复多次(30-40个循环),这样指数级增加目标 的拷贝数使用:Taq聚合酶热稳定DNA聚合酶)引物标记的探针(检测)包含特定DNA序列的引物与单链DNA上的互补序列结合Taq聚合酶结合到引物,然后沿DN段延伸,解读编码并产生1个拷贝双链DNA分解成两个单链TCGGCAGGTCAGATTATATaqTaqTCGPrimerPrimerATAAGCCGTCCAGAGAGAGCTAAGATTATATaq聚合酶

结合到引物,然后沿DN

段延伸,解读编码并产生1个拷贝1234TCGGCAGGTCTCTCTCGCATTCTAATAT10©

2014

3M.s.10Taq聚合酶驱动PCR优点能够承受PCR过程中蛋白变性的条件(高温）最佳活性温度75-80°C,72°C时,能在10秒内

1000

对DNA链缺点Taq聚合酶缺少3’到5’核酸外切酶校正活性,该活性普遍存在于其他聚合酶中Taq酶的失真率为1/9,0001个400bp大小的目标片段在20个循环后会在33%分子中包含错误错误会随机分布11©

2014

3M.s.113M等温核酸扩增技术和PCR的不同点44c

53

2

3c

3c

2c

35c

432c

3c

4c

5c

445

4c

44123561235c

456c

61c

12c

23c

344c

5c

46c

3c

4c

5

65c

6c

4c

5c

41c

2c

3c

1c

2c

1

323c

4c

4

5

65c

6c

3

1

2

1c

2c

3

3c

454c

23c

34c

5c

42c

12©

2014

3M.s.13©

2014

3M.s.3M

等温核酸扩增技术和PCR的比较3MPCR酶链置换DNA

聚合酶Taq

DNA

聚合酶DNA

变性在聚合酶作用下的DNA

链置换高温反应温度I恒温(60°C)反复加热冷却的热循环包括DNA

变性(94°C)

和酶催化的DNA

(55°C,然后72°C)扩增连续循环扩增(72°C

以上)线性的终产物多元体线性扩增子13多组探针识别等温核酸扩增不同区域,DNA核酸酶提供有效快速的目标DNA扩增荧光检测热稳定的荧光素酶催化ATP荧光反应产生荧光,指示检测到目标菌工作原理1.通过DNA扩增产生焦磷酸离子2.和Adenosine5‘phosphosulfate(APS)結合3.ATP

Sulfurylase(硫酸化酶)转化ATP4.热稳定荧光素酶催化产生荧光14©

2014

3M.s.细菌DNA链引物DNA

聚合酶ATP酶荧光素酶脱氧核苷酸在等6引温0°物DCN是随恒A裂为聚着温解检合每该下A过测T酶个A，程P带T该在脱一等P中旦来A酶恒氧首旦温细腺P温核产先D菌苷酶异利苷生引胞-将A荧脱用酸，物内聚-P合的光氧磷焦结即的合组i素核酸合被分D酶等成酶苷硫到N荧子通部极利A酸盐D光高与过被分短用N将释A的高P合(P酶特A链脱S放P分利定和氧S出只间合的D)1腺核来N合个内酶合产A苷，成焦就链成生酸然反A目磷生能的为发T添后应酸P基高光加的从发盐量将础能至酸前中种的自量该序硫体吸副己子的发列酸。取高产标结。光A中酐2D合被来合Pµ特就上。LMA产成定会去拷转生AS的生。T所1P基成个。至检因列D试N结剂A合管链。腺苷-5‘-磷酸硫酸酐(APS)3M

MDS–阳性反应过程15©

2014

3M.s.©

2014

3M.s.1616技术:ATP

生物发光检测操作简便的检测方法灵敏高效的生物发光检测仅当目标序列扩增时会产生光信号的快速增加和减少模板的指数扩增生物荧光的下降17©

20143M.s.简化操作，提高效率173M

MDS沙门氏菌样品增菌培养(BPW,18-24

hrs)37°C

±1°C3M

MDS大肠杆菌O157

(包括

H7)样品增菌培养(BPW,8-24hrs)41.5°C±1°C3M

Method菌样品增菌培养(24-30

hrs)37°C

±1°C所有致病菌项目的操作程序都一样吸取20

µL增菌液至裂解管加热15分钟–100°C

±1°C.冷却10分钟（冷却模块），静置5分钟吸取20µL裂解液至反应试剂管(含有冻干的试剂小球）将反应管置入仪器，开始检测15-75分钟内执行扩增实时自动报告颜色标记的检测结果3M

Method单增

菌样品增菌培养(24-52

hrs)37°C

±1°C技术:等温DNA

扩增利用多个特异性的引物，能够在20-75分钟内对特定区域的目标进行快速扩增DNA聚合酶能更强地抵抗复杂样品的干扰18©

2014

3M.s.技术:等温DNA

扩增利用链置换活性的DNA酶在闭合的试管中和恒温(60°C)下进行扩增在20-75分钟内高效、高度连续地完成大量DNA的扩增DNA扩增中产生大量的焦磷酸盐离子的副产物由于其高度特异性，产生的扩增产物能指示目标的扩增19©

2014

3M.s.20©

2

1

3.s.获得的认证认可3M

分子检测沙门试剂盒ytical

Methods―AOAC

RI

031208―AOAC

OMA

2013.09―NF

VALIDATION

certified

method

3M

01/11-11/12―Health

Canada

–

MLFP

status

in

Compendium

of―Australian &

Inspection

Service

–

DAFF

Validated

Method―Brazilian

Ministry

of

Agriculture

–

MAPA

Official

Method3M

分子检测E.coli

O157(包括H7)

试剂盒―AOAC

RI

071202―NF

VALIDATION

certified

method

3M

01/12-03/133M分子检测—

—AOAC

RI菌试剂盒081203

(August

2012)2121©

2014

3M.s.包容性、排他性

–

性能验证SalmonellaListeriaE.coli

O157Listeriamonocytogenes包容性(%)>

99100100100排它性(%)100100100100包容性(%)

=

100%

-

假 率(%)：目标菌广泛检测的能力。排它性(%)

=

100%

-

假阳性率(%)：抗非目标菌干扰的能力。3M™Petrifilm™

沙门氏菌测试片23©

2014

3M.s.3M

Petrifilm

沙门氏菌快速检测系统用于食品和

环境样品增菌后的快速筛选及生化确认（鉴定）产品包括：3M沙门氏菌增菌肉汤基础(SEB)3M沙门氏菌增菌补充物(SESUP)3M

Petrifilm沙门氏菌测试片3M

Petrifilm沙门氏菌确认反应片3M™

Petrifilm™Salmonella

Express

System

（SALX）24©

2014

3M.s.3M™Petrifilm™

沙门氏菌测试片检测流程24Step

1-2:水化测试片(避光静置1小时)Step

3-5:用接种环蘸取增菌液，然后在水化好的测试片的凝胶表面上划线Step

6:培养22-24小时Step7:观察推测性阳性菌落–红色至红褐色菌落，带有黄色晕圈或/和气泡(确认时)Step9:若发现有推测性阳性的菌落，加入确认反应片，培养4-5小时Step

8:用较细的记号笔在测试片的上层膜上标记出推测性阳性的菌落Step10:仅观察被标记的菌落颜色变化情况。若菌落颜色变为蓝色，则该菌落被确认为沙门氏菌25©

2014

3M.s.26低菌量样品高菌量样品前增菌选择性增菌分离培养肉汤基础+增菌补充物R-V

R10生化确认18

-24

hr8 24

h4-5

hr18

-24

hr4-©520h14r3M.s.高菌量/低菌量样品检测流程(所有培养温度：41.5±1°C)肉汤基础+增菌补充物同一培养温度低菌量样品仅需一步增菌R-VR10(二次增菌)培养时间8-24hr,更方便安排实验时间27©

2014

3M.s.接种10uL（直径3mm）接种环(无菌塑料,新的或材质平滑的金属)划线时必须是一满环的增菌液一步划线划好线后用手轻轻将上层膜压紧，避免气泡41.5±1°C

22-26h培养28加确认片之前加确认片之后颜色变化!生化确认的结果---沙门阳性检出!29©20

4

3M.s.判读生化鉴定结果，并进行进一步的

学鉴定。(低菌量样品）(高菌量样品）测试时间:40-44

HRS测试时间:48-52

HRS样品加入到3M沙门氏菌增菌肉汤+3M沙门氏菌增菌补充物(1:10

稀释)。培养18-24

hr

@

41.5

±

1°C水化测试片,将增菌液划线至测试片。培养24±2

hr

@

41.5

±1°C样品加入到3M沙门氏菌增菌肉汤+3M沙门氏菌增菌补充物(1:10

稀释)。培养18-24

hr

@

41.5

±

1°C选择性增菌:将增菌样品转移至RV[R10]培养8-24

hr

@

41.5

±1°C水化测试片,将增菌液划线至测试片。培养24±2

hr

@

41.5±1°C加入确认反应片，培养4-5

hr

@41.5

±

1°C.培养8-18

hr

@

36°C样品加入到BPW(1:10

稀释).选择性增菌:将增菌液转移至TTB和SC培养18-24

hr

@

42°C

和36°C划线至BS和XLD（或HE等）培养40-48

hr和18-24

hr

@

36°C传统培养方法显色培养基将阳性可疑菌落接种到TSI和LIA斜面，24

hr

@36°C总用时88-128HRS确认反应片3M

Petrifilm™沙门氏菌快速测试片AOACOMA

分析方法

2014.0130©

2014

3M.s.3M

Petrifilm快速霉菌酵母测试片显著地节省了您的操作步骤和培养时间Petrifilm™快速霉菌酵母测试片主要特点&

好处:霉菌酵母测试片培养48-60

小时即可得出结果AOAC

和ISO-AFNOR

的验证延承了其他3M测试片的优点：操作简单，使用方便，货架期久，一致性好，免去了培养基

、

；灭菌；培养皿倾注、

等等大量工作霉菌酵母测试片更容易的判读(特殊的技术防止霉菌扩散和叠加)新的指示剂染色技术使菌落呈现蓝色，快速直观的辨认泡棉凹槽结构使接种、压板更加方便31©

2014

3M.s.32©

2014

3M.s.快速出结果的好处/提早放行1.

减少

空间•2至3天即可放行产品，不必等到5天出结果，节省了终产品的40％的

空间或者2.

测试片仅需很少的存放空间仅需很少的冷藏或冷冻空间节省费用更长的保质期更快的服务于客户更加灵活的生产时间反馈更快/质量问题的快速纠正终产品，原材料以及环境监测33价值所在应用于----所有的企业及合作其希望----微生物可以快速出结果及产品能够加速放行快速霉菌酵母测试片提供了快速出结果—48小时易判读—新的指示剂技术简化的接种、压板步骤—泡棉凹槽结构节省

的空间

—可堆叠至40片和其他测试片相同的优点提高生产效率简便一致性好可靠性第

认证优于----标准的测试片,琼脂平板以及其他即用型培养基测试片的判读酵母菌vs.霉菌的菌落为区分快速霉菌酵母测试片上的酵母和霉菌的菌落,请参考下图酵母菌菌落数:42个酵母菌的菌落特征:菌落小,有明显的边缘,粉褐至蓝绿色,菌落呈现凸起,菌落颜色一致霉菌菌落数:12个霉菌的菌落特征:菌落大,没有明显的边缘,蓝绿色,随培养时间的延长颜色可发生变化,菌落呈现扁平,菌落边缘模糊中心深暗34©

2014

3M.s.蔓越莓鸡尾酒中(酿酒酵母)样品pH值:2.78调整(25C)空气中的

环境样品(25C)烟熏三文鱼中的

热带假丝酵母菌(25C)脱脂奶粉中的白地霉菌(25C)自然样品核桃(28C)性能

测试腰果中的曲霉(28C)天然