肿瘤实验诊治技术教案-免疫组织化学

肿瘤实验诊治技术教案学科肿瘤实验诊治技术学时4专业、层次临床本科肿瘤分流方向课程章节免疫组织化学基本教材及主要参考书1.《免疫组织化学病理诊断》，吴秉铨,刘彦仿主编，北京科学技术出版社2.银平章，主编。《临床病理学实验技术》，中原农民出版社3．李甘地，主编。《组织病理技术》研究生用教材，人民卫生出版社授课内容：授课内容：免疫组织化学技术概述免疫组织化学染色前的基本技术免疫组织化学染色的基本原理免疫组织化学主要染色方法免疫组化染色对照设置和染色结果分析第六节免疫组化实验中常见问题及解决办法教学目的与要求：掌握：1．IHC几种常用方法的基本原理2．PAP法、ABC法的操作要点3．掌握染色对照、结果判定等程序步骤和要求熟悉：1.标本处理、染色等程序步骤和要求2．抗原抗体的基本知识了解：1.了解免疫组织化学的双重和多重染色技术，讲授重点1．IHC几种常用方法的基本原理及二步法的操作要点2．掌握染色对照、结果判定等程序步骤和要求讲授难点及疑点难点：掌握染色对照、结果判定等程序步骤和要求，IHC几种常用方法的基本原理疑点：染色结果分析教学方法充分利用多媒体、绘图等多种教学手段。利用“病例导入式”教学法进行教学，从病例着手提出问题，紧密结合临床，运用启发式教学法，提高学生的学习兴趣。教具媒体教学课件、投影仪、粉笔教学过程及板书设计（见讲稿）讲稿中包括概述、巨检、镜检、鉴别诊断、预后五方面内容第一节免疫组织化学技术概述(20分钟)（一）、发展简史(3分钟)1941年Coons首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。60年代Nakane建立酶标抗体技术运用铁蛋白标记Ab技术。70年代Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶（PAP）技术，使免疫组织化学进入了应用阶段。80年代Hsu等建立了抗生物素—生物素（ABC）法使IHC得到了广泛的应用，随后免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。90年代分子杂交技术、原位杂交技术。2000年各种免疫组化技术更加成熟,使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。（二）、免疫组织化学的原理（7分钟）定义:免疫组织化学又称为免疫细胞化学（Immunocytochemistrytechniques）,它是组织化学的分支它是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测技术,因此又被称为原位免疫学（Insituimmunology）。它借助于荧光素、酶等标记抗体与组织切片或细胞涂片中相关抗原相结合，由于荧光素所发荧光可用荧光显微镜检出，而酶可经一定的显色处理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准确定位欲测定的抗原物质。利用显微镜的精确性与抗原抗体反应的敏感性相结合的方法，发展成一门崭新的学科。三大系统本技术是应用免疫学原理来识别待测抗原，再通过酶和底物的作用外加显色剂，将上述反应显示出来。因此可将此技术分为三个部分或三个系统，即识别系统、联结系统和显示系统。识别系统是指特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特异性结合是本技术的基本依据。联结系统由联结抗体构成。它的作用是联接识别系统和显示系统。显示系统的目的是使抗原抗体间的特异性结合变为肉眼可见。因此显示系统由标记酶，底物和显色剂组成，以在靶抗原存在位点上形成有色沉淀。特点：特异性强；灵敏度高；定位准确和简便快速等优点；又能够将形态、功能及代谢的研究有机结合起来；免疫组化的发展已有半个多世纪,直到近10多年才迅速发展，被广泛用于外科病理学及其他研究领域。（三）、免疫组化的应用（10分钟）①分化差恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断；②恶性淋巴瘤的诊断、鉴别诊断和功能分类；③证实内分泌肿瘤和神经内分泌肿瘤；④应用肿瘤胚胎性抗原诊断某些肿瘤，如癌胚抗原（CEA）对胃肠道癌、甲胎蛋白（AFP）对肝癌和卵巢内胚窦癌诊断有帮助；⑤确定同一肿瘤中的多种成分；⑥有时可帮助确定肿瘤的良恶性，如应用免疫球蛋白轻链κ和λ来鉴别滤泡性恶性淋巴瘤和滤泡性反应性增生；⑦研究组织来源不明的肿瘤；⑧研究某些癌症与病毒的关系，如肝癌与乙型肝炎病毒、鼻咽癌与EB病毒、宫颈癌与乳头状瘤病毒等的关系；⑨为肿瘤治疗的选择提供依据，如乳腺癌检测雌、孕激素受体（ER、PR）呈阳性时，应用他莫昔芬（三苯氧胺）治疗可预期获得较好的疗效；⑩检测癌基因和抑癌基因蛋白产物（如c-erbB2，p53）、增生活性抗原（如Ki-67，PCNA）用来估计肿瘤的预后。免疫组化在临床诊断中应用病例示范（Case1）临床病史资料：48岁，男性，胃活检标本取自胃大弯部位。H&E染色切片描述肿瘤细胞显示在间质中呈癌巢样，邻近的腺体肠上皮化生，间质中的不规则的巢状结构待诊断，能否诊断为胃癌？第二节免疫组织化学染色前的基本技术（30分钟）（一）、样品的取材（5分钟）组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。细胞标本包括组织印片、和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究.样品制备的第一步就是取材，取材的好坏关系到实验的结果。所以必须做好准备工作。现将组织取材的原则和具体要求分述如下：1、刀剪锐利、洁净。2、快速、准确、尽量保持生活状态，力争1分钟之内放入固定液，最迟不能超过3分钟。3、一刀切取，切取应在蜡版或滤纸上进行，避免拉锯、牵拉或挤压等动作。4、低温操作，防止自溶现象，通常以0℃-4℃的低温条件下操作为佳。5、样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内，免疫组织化学样品大约在：2cm×1.5cm×0.3cm[厚度控制在0.3cm]。电镜样品规格要求切成0.5-1.0cm共3小块。对病理组织取材还应做到以下几点：①取材部位必须是主要病变区；②必须取病灶与正常组织的交界区；③必要时取远离病灶的正常组织做对照。细胞标本的取材：印片法:常用于活检标本沉淀法:主要用于胸水、腹水、尿液等穿刺抽吸法：常用于淋巴结、软组织、肾、肝、肺等组织。注意事项：①细胞经离心后细胞粘附性较差，标记过程中容易脱片，载玻片应涂粘附剂②细胞总数应以105个为宜，并集中在直径0.6-1.0cm的圆圈内。③富于粘液的标本，未经处理不宜作免疫组化标记。（二）、组织固定（5分钟）1、目的:固有形态和结构、抗原完整性2、免疫组化标本固定时，好的固定剂应满足哪些要求？①能快速固定抗原；②防止抗原物质扩散；③固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应。3、各种固定液：①甲醛固定液：分类较多，最常用的4%多聚甲醛固定液，对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；主要特点：组织穿透性好，收缩性小但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。②Bouin,S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。③PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。（三）、组织脱水浸蜡及包埋（5分钟）①脱水透明等过程需在4℃或室温下进行，避免组织抗原的损失；②为使组织充分脱水、透明和浸蜡，组织块的厚度以1.0-1.5mm为宜;③浸蜡及包埋过程中,石蜡温度应保持在60℃或60℃以下,用熔点低的石蜡包埋;④制备蜡块在较低的温度进行,故试剂处理时应适当延长,否则会给切片带来困难常用的包埋法①碳蜡包埋②冰冻干燥包埋③塑料包埋（四）、组织切片中载玻片的处理（5分钟）抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用Poly-L-Lysine、ZLI-9001APESZLI-9003HistogripTM或ZLI-9005等几种试剂，对已常规清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20-30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。HistogripT：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1-2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60℃烤箱烘烤一小时，装盒备用。（五）、抗原修复（7分钟）抗原修复是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。石蜡切片为什么要做抗原修复？有那些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽.所以要求在进行IHC染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。抗原修复方法一、热修复1、微波炉加热法将玻片分别插入抗原修复盒中，以保证各部位的玻片受热均匀。在抗原修复盒中加入抗原修复液，盖上带有小孔的盖子。将抗原修复盒置于微波炉中央，加热2x5min。两次加热之间，加入50ml蒸馏水。加热过程中，组织标本不可干燥。第二次处理后，将微波炉中的修复盒移至室温冷却15-20分钟。不要打开盖子！蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶并置于蒸馏水中。用TBS或PBS液冲洗。进行免疫组化染色。2、压力锅法在压力锅中放入1500-3000ml抗原修复缓冲液加热到沸腾，不加阀，玻片插入切片架并放入沸腾的修复缓冲液中。后加阀，使之加压2分钟。后将压力锅置于流水槽或继续冷却20分钟（减压）。取出切片，蒸馏水冲洗，移至TBS或PBS液中，以避免组织干燥。以下同微波炉修复法。加热长短的控制很重要:从组织切片放入缓冲液到高压锅到压力锅离开热源总时间在5-8分钟，时间过长可能会使染色背景加深。高压锅煮沸方法，可避免假阳、阴性，使IHC染色效果更佳。二、酶消化方法抗原修复的方法选择，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。胰蛋白酶和蛋白酶K:一般用于细胞内抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。胃蛋白酶则主要用于细胞间质抗原的检测，如fibronectin，Laminin，各型胶原等。1、胰蛋白酶处理：滴加一滴胰蛋白酶工作液于组织上。室温--37℃孵育20-40分钟，孵育时间的长短依福尔马林固定时间及所测抗原情况而定。蒸馏水冲洗，终止反应。阻断内源性过氧化物酶。免疫组化染色。2、胃蛋白酶处理滴加胃蛋白酶工作液于组织上。最佳消化时间取决于福尔马林的固定时间，37℃预热。一般消化10分钟，长至30分钟。以下同胰蛋白酶处理方法3,4,5。注：过度消化将导致组织结构的丢失，并引起组织脱片三、综合方法微波炉加胰酶修复法：将组织切片置于盛有50ml修复液的塑料盒中，封口膜封口后加热5分钟。冷却后打开，将切片置于37℃预热的蒸馏水中，胰蛋白酶消化。室温胰蛋白酶处理30秒钟。蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶，置蒸馏水中。免疫组化染色。四、操作中还应注意如下问题：热处理后应注意自然冷却。热处理时要防止切片干燥。应根据不同的抗体选择合适的抗原修复方法。一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。注意形态学结构的改变(一般经高温修复后胞浆会明显的破坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象，而经酶水解的切片，其细胞浆破坏视消化时间而异，但核破坏较轻)。如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTA等可改善某些抗原的修复。(五)免疫组织化学的全过程（3分钟）抗原的提取与纯化；免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；将显色剂与抗体结合形成标记抗体；标本的制备；免疫细胞化学反应以及呈色反应；观察结果。第三节免疫组织化学染色的基本原理（30分钟）（一）、抗原的概念和性质（5分钟）1、抗原的概念凡能在机体内引起体液免疫和（或）细胞免疫反应的物质，称为抗原（antigen，Ag）。能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物质,物质的这种特性称抗原性（antigenicity）。抗原性包括（1）免疫原性：刺激机体产生抗体（2）反应原性：能与相应抗体发生特异结合；具备二者为完全抗原，只具后者为半抗原（hapten），如多肽、甾类激素、多糖、类脂质等）。Hapten+大分子蛋白=完全抗原（人工抗原）。2.抗原的性质:抗原的免疫原性是由抗原分子表面特殊的化学活性基团决定的,包括蛋白质的一段氨基酸序列、三维立体构象等，这些部位称为抗原决定簇(基)(antigendeterminant),是抗原与抗体及TCR结合的基本单位,也称为表位(epitope)。某种抗原它的决定簇可有一个或多个，由此抗原也可分为单价和多价，如hapten为一价，完全抗原为多价，BSA有18个决定簇，甲状腺球蛋白有40个决定簇。抗原具有特异性，只与相应的抗体结合，其特异性是由抗原决定簇的性质、数量、空间构型决定的。（二）、抗体的概念、性质、分类（3分钟）1、概念:抗体（antibody，Ab）是机体受Ag刺激后由B淋巴细胞的衍生物—浆细胞分泌的一类免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig),可与相应抗原特异性结合。2、Ig的基本结构与性质：每条Ig单体皆由2条相同的重链和2条相同的轻链构成，链间以二硫键连接。在多肽链的N端因氨基酸序列不同而有2个可变区，它们是结构相同的2个Fab片段，因此一个Ab单体分子有2个Ag结合部位（双价）；在C端氨基酸序列稳定为恒定区，即Fc片段，是第二抗体的结合部位或受体结合部位。3、抗体的分类免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb）是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体（polyclonalantibody，PcAb）是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。（三）、抗体的标记（20分钟）Ag－Ab产生特异性结合后，其Ag－Ab复合物是不可见的。为了使得反应的结果可见，必须将抗体加以标记，并利用标记物与其它物质的反应，将阳性的结果放大后转换成可见的发光（荧光）或颜色方能观察.从理论上讲，标记物应具有以下的特点：①能与抗体形成比较牢固的结合；②不影响抗体与抗原的结合；③放大的效率高；④发光或显色反应要在抗原一抗体结合的原位，并且鲜明，有良好的对比。经过几十年来不断地筛选，目前较为成熟的标记物有：异硫氰酸荧光素和四甲基异硫氰酸罗丹明，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，铁蛋白，胶体金，葡萄球菌A蛋白，生物素和放射性同位素等。一、荧光标记物和荧光抗体1.异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC），它能与抗体形成较稳定的结合物。FITC是一种分子量为389D的黄色结晶粉末。FITC的最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm，为明亮的黄绿色荧光。通过FITC的硫碳胺键与Ig中赖氨酸的ε—氨基在碱性条件下结合，ε—氨基碳酰胺化形成硫碳氨基键，构成FITC-Ig结合物。一个IgG分子含有86个赖氨酸残基，最多能结合15～20个FITC分子。一般可结合2～8个。2.四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）。是一种紫红色的粉末，最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm。为桔红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比十分鲜明。多用于双重标记荧光染色。3.荧光标记抗体的使用范围和优缺点：优点：由于IF有其独特的能对活细胞进行染色，在组织培养细胞、肾炎、皮肤免疫性疾病的研究和诊断，病原体及自身抗体的检测等方面，至今还在使用。在McAb出现后，荧光标记的McAb在流式细胞术，荧光激活细胞分类器以及激光扫描共聚焦显微镜等技术中得到越来越广泛的应用。缺点：染色的组织切片或细胞涂片不能长期保存（几天后荧光淬灭），需及时观察和照相。4.免疫荧光技术和免疫酶技术的比较IFIPO组织学结构差好背景染色+±是否需要冰冻切片是不必可否用于石蜡切片否可以染色后切片保存时间一周几年以上可否用于电镜否可以可否用于活细胞染色可以否是否需要荧光显微镜是否二、酶标记物和酶标抗体1966年Nakane等首次用过氧化物酶代替荧光素对抗体进行标记，对组织抗原定位，开创了免疫过氧化物酶技术(immunoperoxidase，IPO）。1974年Sternberger在此基础上创建了PAP技术，并进入实用阶段。理想的标记酶应当具备：①酶的活性高并且稳定；②终产物稳定，不扩散，有良好的定位：③酶与抗体结合不影响Ag－Ab的特异性反应；④在组织与体液中不存在内源性的酶及其底物。实际上没有一种酶能满足上述条件，效果好又应用最多的是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。1.辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（horseredishpero-xidase，HRP）是从植物辣根中获取的一种酶，在pH3.5～12范围内稳定，60℃加热15分钟不失活。分子量为40，000D，穿透性较强。其活性较高，溶解度大，等电点为7.2，是当今理想的标记酶。HRP的抑制剂有叠氮纳（NaN3）、重铬酸钾、氰化物和氟化物等。HRP的底物为H2O2。催化反应式为：HRP+H2O2→HRP／H2O2（复合物）HRP／H2O2＋DAB（供氢体）→HRP+2H2O+DAB棕此处DAB为供氢体。DAB即3’,3-二氨基联苯胺(3’,3-diaminobezidine,DAB)，有致癌性，应注意防护。DAB在HRP催化下，脱氢聚合成吲达氨聚合体，再氧化成DAB棕，形成不溶于水及有机溶剂的棕色颗粒。因为酶与抗体已经结合，所以酶促反应的产物的定位间接地显示Ag-Ab反应的定位。由于HRP的酶促反应效率极高，一般在反应2－5分钟（室温下10—20min）后即可形成在光镜下可见的反应产物。对Ag-Ab反应有放大作用。（附图）：胰岛内可见棕色着色的阳性细胞，阳性产物见于细胞质注意：在正常组织细胞中，如粒细胞、骨髓造血细胞中均含有丰富的内源性过氧化物酶。成熟红细胞所含的伪过氧化酶也可使DAB显色。因此在过氧化物酶染色中一般要用0.3％过氧化氢水(H2O2)溶液或0.3%过氧化氢—甲醇液处理切片5-10分钟，以耗尽其内源性过氧化物酶，避免出现假阳性。2.碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）为分子量80,000的水解酶，最佳反应pH值8.9-9.4。AP在碱性环境下，可催化下列水解反应:生成产物分别为蓝色和红色，不溶于水，但溶于有机溶剂。因此封片时不能用酒精脱水、二甲苯透明，只能用明胶甘油或缓冲液封片，故切片易退色,不宜久置，应立即观察、照相。Newfuscion（新复红）的反应产物为鲜红色，不溶于酒精和二甲苯，可用酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片，长期保存不褪色，并可用苏木素复染后细胞核呈蓝色，对比鲜明。注意:封片时不能用酒精脱水、二甲苯透明切片易退色,不宜久置内源性AP广泛存在于肝、胎盘、小肠绒毛、骨基质、肾小管上皮等处。冰冻切片和细胞涂片染色时假阳性反应尤为突出。需要在孵育液中加入左旋咪唑抑制内源性AP的活性。3.其它标记酶与非酶性标记物除HRP和AP之外，在IHC中试用过的标记酶还有葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase）、β-半乳糖酶等，但均未能得到广泛地使用。除荧光素和酶以外，胶体金、铁蛋白、藻红蛋白等标记物也被应用。尤其是在免疫电镜中，胶体金与铁蛋白是两种主要的标记物。藻红蛋白是新发现的一种从植物叶绿素中提取的蛋白。在受到与FITC相同的激发光照射时，发出亮红色荧光，可以与FITC（黄绿色）同时用于双重标记。三、亲和组织化学标记方法随着IHC技术的发展和新的亲和物质的发现（如生物素与卵白素、葡萄球菌A蛋白与IgG、配体与受体等），IHC技术从Ag-Ab反应，发展到更为广泛的利用亲和物质对的特异结合反应来进行标记染色，这就是亲和组织化学（affinityhistochemistry）。亲和组织化学技术的发展使IHC反应的灵敏度大为提高，非特异反应大为降低。除了在IHC中得到广泛地使用外，在核酸分子杂交，免疫印迹，ELISA等领域也使用的越来越多。1.生物素和卵白素(1)生物素和卵白素的化学结构与性质生物素是从鸡蛋黄中分离获得。它是一种分子量244、等电点3．5的环性分子。卵白素又称亲和素或抗生物素，由蛋清中获得,是分子量为68KD的碱性蛋白。等电点为10.5。由4个含128个氨基酸的亚基组成。l分子卵白素可与4分子生物素结合。二者的结合为不可逆反应，是自然界中已知的结合最紧密的物质之一，比Ag－Ab的亲和力（结合力）大100万倍。只有在pH1.5时才能将二者分开。(2)．生物素卵白素系统的优点生物素分子量小，1个抗体可结合150个生物素分子，并且与抗体分子结合（生物素化）后，不影响抗体与抗原的结合力；多种酶可与生物素结合，且活性不受影响；卵白素也可与荧光亲、酶等标记物结合，活性不受影响；二者结合力强，胜过抗原-抗体。这些特点决定了生物素与卵白素是极为理想的一对亲和物质对，使其在各个领域得到广泛应用。缺点动物体内也存在内源性的生物素，(肝、肾、肥大细胞)，可与卵白素结合出现假阳性。近年来从链霉菌中提纯出了链霉卵白素（streptavidin）（也叫链亲和素）代替了卵白素。链亲和素分子量为60KD，等电点为中性，不与内源性生物素结合是其优点。2.葡萄球菌A蛋白与IgG葡萄球菌A蛋白（staphylococalproteinA,SPA）是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白成份，分子量为42KD，pI为5.1,对热稳定。SPA能与人和多种哺乳动物的lgG的Fc片断非特异性的结合。理论上有4个抗体（Fc片断）结合位点，但实际上这种结合是双价的，即1分子SPA只能与2个IgG分子结合。利用这一特点，可以将SPA标记上荧光素或过氧化物酶后，作为IHC中的第Ⅱ抗体使用。标记物总结（2分钟）标记物特点观察方式FITC黄绿色荧光荧光显微镜TMRITC橘红色荧光荧光显微镜辣根过氧化物酶（HRP）DAB+H2O2棕色沉淀LM和EM碱性磷酸酶（AP）偶氮染料（红或蓝）LM观察胶体金（金银法）红色（黑色）LM和EM第四节免疫组织化学主要染色方法（40分钟）基本方法：免疫组化常用的方法有：1.标记抗体法：直接法、间接法；2.未标记抗体法：酶桥法、PAP法、APAAP法；3.亲合素—生物素法：ABC法、LAB法、BRAB法一、直接法（directmethod，一步法）（5分钟）该法使用最早，即用已知的荧光素标记或酶标记抗体，去检测组织细胞中的抗原。当Ab与Ag结合后，即用荧光显微镜观察，或用酶促反应显色后普通光镜观察。特点：1、此法特异性高，但敏感性低；2、每种抗体均需单独标记，使用不便。商品化标记抗体诞生后，此法得到了广泛应用。特别是用FITC和TMRITC分别标记2种Ab同时检测两种Ag。如检测乳腺癌中雌激素受体和孕激素受体。二、间接法（indirectmethod、又称sandwichmethod，夹心法）（5分钟）检测抗原时：①加入未标记的特异性抗体（常称第一抗体或一抗）与组织细胞中的抗原结合；②洗去未结合的一抗后，加入酶标记或荧光素标记的第二抗体（简称二抗）与一抗结合，再行显色光镜观察或荧光显微镜观察。1个一抗可结合3-5个二抗。检测抗体时：用含有已知抗原的组织细胞标本，加入适当稀释的待检血清，再加标记抗体（二抗）进行观察。如检测人血清抗壁细胞抗体。该法特点是：1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异性较低；2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动物的二抗；3、一抗可高度稀释，节省一抗，且可用PBS代替一抗做空白对照。三、未标记抗体法（10分钟）为避免标记抗体法对抗体活性和标记物活性两方面的影响，发明了非标记抗体法。Mason于1969年报道了酶桥法，Sternberger于1974年报道了PAP法，Mason于1983年报道了APAAP法。1、酶桥法（enzymebridgetechnique）3种抗体一种酶，4步完成：即一抗、二抗、三抗、过氧化物酶。第1、3抗体来自同一种动物，如兔，其中一抗针对组织细胞中的待检抗原，三抗针对过氧化物酶；第2抗体来自另一种动物，如羊，即为羊抗兔IgG。染色关键为二抗要过量，使之2个结合位点分别与一抗和三抗结合。特点：敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非特异性结合的酶不易洗去，背景染色重。2、PAP法（peroxidaseantiperoxidase，PAP）3种抗体一种酶，3步完成，即一抗、二抗、酶抗酶复合物。第1、3抗体来自同一种动物，如兔，其中一抗针对组织细胞中的待检抗原，三抗针对过氧化物酶；第2抗体来自另一种动物，如羊，即为羊抗兔IgG。染色关键为二抗要过量，使之2个结合位点分别与一抗和三抗结合。该法与酶桥法的区别：在于将三抗与过氧化物酶制成了酶抗酶复合物，直接稀释使用，不需临时配置，酶浓度不好掌握。PAP复合物由2个Ab分子与3个酶分子构成，呈环状，分子量432kD。特点：敏感性高，比间接荧光法敏感20倍，比间接酶标记抗体法敏感100倍，因而非特异性染色轻。3、APAAP法（alkalinephosphatase，AP-anti-AP）原理同PAP法，只是用AP取代P（peroxidase）。优点：用APAAP方法，显色时用fastblue或fastred，而不用PAP法显色时有致癌性的DAB。显色对比好，国外使用广泛。4、亲和素—生物素方法包括3种免疫组化方法：=1\*GB3①亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（avidin-biotin-peroxidasecomplextechnique，ABC法）。关键的程序步骤为3步：Ag+Ab1+（Ab2-B）+AB★C复合物（Ab2-B为生物素标记的第二抗体）（B★为生物素标记的过氧化物酶）AB★C复合物是avidin与酶联biotin1比1在使用前30min配置，混匀。1个avidin分子结合了3个biotin分子，剩下1个结合点与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。ABC法敏感性更高，比PAP法敏感20-40倍，背景也更清晰。=2\*GB3②酶标亲和素-生物素技术（labelledavidin-biotintechnique，简称LAB法）。即用辣根过氧化物酶直接标记avidin，用biotin标记2抗。关键步骤为3步：Ag+Ab1+（Ab2-B）+A★（A★为HRP标记的卵白素）A★与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。如将该法中的卵白素（avidin）变换成链霉卵白素（streptavidin），LAB法即成LsAB法，或称SP法。据认为LAB法比ABC法敏感2-4倍，而LsAB法因streptavidin不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在SP法已趋于取代ABC法而广为应用。=3\*GB3③桥联亲和素-生物素技术（bridgedavidin-biotintechnique,简称BRAB或BAB法），是用生物素分别标记2抗和辣根过氧化物酶，avidin起桥联作用将2抗与生物素化的HRP连接起来。关键步骤为4步：Ag+Ab1+（Ab2-B）+A+B★（Ab2-B为生物素化2抗）（A为卵白素）（B★为生物素化的酶，avidin起桥联作用。）上述3种方法因均使用了第二抗体，因而称为间接法。如省去2抗即称为直接法。四、常用免疫组化方法染色程序（10分钟）免疫组化PAP法染色程序1、冰冻切片或石蜡切片脱蜡下降酒精至水；0.01mol/LpH7.4PBS洗5min×3次；2、0.3%Triton-X100（表面活性剂、去污剂）室温下处理切片20min；3、阻断内源性peroxidase,0.3%H2O2_甲醇溶液(或PBS)室温10-30min;4、Ag修复:0.1%trypsin消化,37℃1小时;PBS洗5min×3次;5、1:50正常羊血清,室温,15min,不需漂洗,直接加Ⅰ抗;6、滴加Ⅰ抗(1比200，PBS稀释，不同Ab稀释度不同),湿盒内,37℃1h,或4℃冰箱内48-72h;PBS洗5min×3次;7、滴加Ⅱ抗(桥抗体)1:100-200;湿盒内,37℃1h;PBS洗5min×3次;8、滴加Ⅲ抗（即PAP复合物），1：100倍PBS稀释，湿盒内,37℃1h;PB5min×3次;9、0.05%DAB-0.01%H2O2液显色(0.05mol/LpH7.6TBS配制),室温10-20min;显微镜下监控，至阳性产物出现而背景浅淡时，及时自来水洗终止反应；10、苏木素复染(可用可不用),酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。注：1抗与3抗来自同种动物，2抗是抗1抗和3抗的。免疫组化ABC法染色程序1、冰冻切片或石蜡切片脱蜡下降酒精至水；0.01mol/LpH7.4PBS洗5min×3次；2、阻断内源性peroxidase,0.3%H2O2-甲醇溶液(或PBS)室温10~30min;3、Ag修复:0.1%trypsin消化,37℃1小时;PBS洗5min×3次;4、1:50正常羊血清,室温,15min,不需漂洗,直接加Ⅰ抗;5、滴加1比200倍稀释的Ⅰ抗(不同Ab稀释度不同),湿盒内,37℃1h,或4℃冰箱内48~72h;PBS洗5min×3次;6、滴加生物素化Ⅱ抗1:100~200;湿盒内,37℃1h;PBS洗5min×3次;7、滴加ABC复合物1：100，湿盒内,37℃1h;PBS洗5min×3次;（ABC复合物为卵白素、生物素1比1，PBS100倍稀释，用前30min配好，）8、0.05%DAB-0.01%H2O2液显色(0.05mol/LpH7.6TBS配制),室温10-20min;显微镜下监控，至阳性产物出现而背景浅淡时，及时自来水洗终止反应；9、复染,脱水,透明,封片。免疫组化LsAB（SP法）法染色程序1、冰冻切片或石蜡切片脱蜡下降酒精至水；0.01mol/LpH7.4PBS洗5min×3次；2、阻断内源性peroxidase,0.3%H2O2--甲醇溶液(或PBS)室温10~30min;3、Ag修复:0.1%trypsin消化,37℃1小时;PBS洗5min×3次;4、1:50正常羊血清,室温,15min,不需漂洗,直接加Ⅰ抗;5、滴加1：200Ⅰ抗(不同Ab稀释度不同),湿盒内,37OC1h,或4OC冰箱内48-72h;PBS洗5min×3次;6、滴加生物素化Ⅱ抗1:100;湿盒内,37℃1h;PBS洗5min×3次;7、滴加HRP标记的链霉卵白素1:100，湿盒内,37℃1h;PBS洗5min×3次;8、0.05%DAB-0.01%H2O2液显色(0.05mol/LpH7.6TBS配制),室温10-20min;显微镜下监控，至阳性产物出现而背景浅淡时，及时自来水洗终止反应；9、复染,脱水,透明,封片。免疫酶技术的局限性（2分钟）1．各种肿瘤的标记物为相对特异性，也常常出现交叉反应。未分化或低分化的肿瘤有时不表达有关抗原，因此给诊断造成困难。尤其软组织肿瘤，其组织起源多样性和具多向分化的潜能，加之目前可用抗原数量有限，使鉴别诊断困难更多。2.商品性抗体价格较贵，给使用加重经济负担。3.必须结合形态学特征、病史和其他检查综合评价结果才不至出现诊断上的误差。双染色技术（5分钟）双染色技术已经发展得很完善。可以从同一切片上甚至同一细胞中同时显示两种不同的抗原。最初主要是用异硫氰酸荧光素和罗丹明标记两种抗体进行双染色。不同的靶抗原由不同抗体标记而在荧光镜下显示绿色或红色荧光。随着免疫酶技术的发展，可用两套由不同酶标记的抗体着染两种不同的靶抗原。方法为先以第一套抗体、继而用第二套抗体着染切片。不同的标记酶例如辣根过氧化酶和碱性磷酸酶的应用，克服了相同的标记酶和抗体间的交叉反应。底物显色剂

①DAB（3,3-二氨基联苯胺）：显色后阳性反应产物呈棕褐色；

②AEC（3,氨基-9-乙基卡巴唑）：显色后阳性反应产物呈红色或紫红色。（附图）免疫标记电镜技术的原理：（3分钟）免疫标记电镜技术是利用电镜下可见的示踪标记物，如铁蛋白、胶体金等电子致密物质标记特异性抗体（或抗原），使之与组织超薄切片中的相应抗原（或抗体）反应，形成不溶性免疫复合物，用电子显微镜观察可见的标记物，间接证实免疫反应的发生。标记物所在位置即为抗原抗体发生反应的部位。同时，由于电子显微镜的高分辩力，可以对组织细胞进行超微结构水平上的分析。此技术成功的关键1）对细胞超微结构的完好保存；2）保持被检细胞或其亚细胞结构的抗原表位，其抗原性不受损伤；3）选择的免疫试剂能顺利穿透组织细胞结构与抗原结合。第五节免疫组化染色对照设置和染色结果分析（20分钟）一、正确设计免疫组化对照的方法（5分钟）设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照，常用的对照有空白对照、替代对照、抑制对照、自身对照、阴性对照、阳性对照和吸收试验。空白对照：用PBS替代特异抗体，这是一种最有效的对照，是阴性对照中最常用的一种。染色结果应为阴性。若出现阳性结果，则说明实验组的阳性为假阳性常见原因：自发荧光、色素及内源性酶第二抗体或桥抗的假阳性阴性对照：用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，另外空白、替代、吸收和抑制试验均为阴性对照。当阴性对照成立时，才能判定检测结果，主要用于排除假阳性。替代对照：用与第一抗来源的同一动物免疫前血清来替代第一抗，染色结果阴性。用以证明待测组织切片的阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是该抗体与组织内抗原特异性反应的结果抑制对照：待检标本先与未标记的特异抗体反应后再与标记的特异性抗体进行染色，结果明显减弱或转为阴性，主要用来检测抗原抗体特异性吸收试验：吸收试验是最可靠的检测方法。以过量抗原与第一抗体混合，抗原抗体将结合而形成抗原抗体复合物沉淀。用吸收过的抗体染色切片作为对照，如未吸收的抗体染色阳性，而吸收过的抗体染色阴性，则染色有效；如吸收过的抗体着染，则染色无效。原因：说明抗体不纯，阳性染色反应不是待检抗原与抗体特异性反应形成的。阳性对照：用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果证明整个染色程序符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照就更加重要。二、对照结果的正确判断（10分钟）分组实验组阳性对照组阴性对照组吸收对照组空白对照组替代对照组结果判断1方法不可靠或操作有误2++++++非特异性染色,找原因3+++阴性对照标本靶抗原4+阳性对照相标本不含靶抗原5++--+吸收实验失败6++--+++非特异性染色,可能与二抗交叉反应有关7++方法可靠,为特异性染色8--+方法可靠三、染色结果分析（5分钟）阳性细胞的染色特征免疫组织化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，作为定性、定位和定量的依据。（1）阳性细胞染色分布有三种类型：①细胞质；②细胞核；③细胞膜表面。大部分抗原见于细胞质，可见于整个胞质或部分胞质。（附图）（2）阳性细胞分布可分为散在、灶性和弥漫性。（3）由于细胞内抗原含量不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。（4）阳性染色定位于细胞，且阳性与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。（5）若仅在切片边缘、刀痕或皱折区域，坏死或挤压的细胞区，胶原结缔组织等部位呈现阳性反应，且表现为相同的阳性染色强度，不能判为阳性。阳性结果的评价法a.根据经验判断颗粒大小和多少以及范围，综合作出弱阳、阳性和强阳的评价。b.计算法：首先将阳性强度分为0、1、2、3；其次将阳性范围分为：0:%（指阳性所占面积比例）1:1%-10%2:10%-50%3:50%-75%4:75%-100%计算结果=强度x面积分别得0、1、2、3、4、6、8、9、12阴性强阳例如强度=2，面积=2计算结果：2x2=4第六节免疫组化实验中常见问题及解决办法(20分钟)一、免疫组化染色中常见的非特异性染色（5分钟）非特异性染色的识别常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性，均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。非特异性染色的原因1.Ig与Fc受体结合多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。避免方法：①用以二抗相同种族的正常血清封闭切片；②用不含Fc段的抗体，但价格贵（V区，C1区不含Fc段，用Pepsin消化）2．静电吸附抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。避免方法：①尽量稀释一抗