生物化学视频专辑

生命现象的执行者蛋白质与核酸是体内主要的生物大分子第一节

生命的物质基础-蛋白质一、蛋白质是构成生物体的基本成分蛋白质（protein）是生命的物质基础，是构成生物体的基本成分，生命现象的执行者。的45%为蛋白质，脾、肺、肌肉含量均超过80%，细菌的含量为50~80%，干酵母的含量为46.6%。二、蛋白质生物学功能的多样性蛋白质的生物学功能作为生物催化剂调节代谢反应载体参与机体的运动参与机体的防御接受传递信息控制生长和分化生物膜的功能没有蛋白质就没有生命。药学领域♣很多蛋白质本身就为药物（如一些多肽、激素等）；♣即使有效成分不是蛋白质，但在提取、分离时必然遇到有关蛋白质的处理问题；♣

蛋白质的研究对有关药物的生产、

、分析和应用等也具有重要的现实意义。第二节

蛋白质的化学组成一、蛋白质的元素组成蛋白质平均含N量为16％，这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据：蛋白质含量＝蛋白质含N量×6.25蛋白质主要元素组成：C、H、O、N、S

及P、Fe、Cu、Zn、Mn、I、Se

等。含量%：元素组成：

N组成蛋白质的基本结构单位是什么呢？蛋白质的水解酸水解、碱水解、蛋白酶水解二、蛋白质的基本结构单位—氨基酸20种蛋白质氨基酸。（一）氨基酸的结构COOHR

group氨基羧基L-Form

Amino

AcidR=H

-GlycineR=CH3-AlanineH2

NH从氨基酸的结构通式可以看出：α-氨基酸（甘氨酸）α-碳原子都是不对称的，可形成不同的构型，

旋光性。天然蛋白质中基本氨基酸均为L-型。CHH2NCOOHR组成蛋白质的氨基酸都为L型（Gly除外）非极性氨基酸极性氨基酸极性不带电荷的氨基酸带负电荷带正电荷的氨基酸组成蛋白质的氨基酸共有20

种不同的aa

在于R基团的不同1.由R基团的极性性质（二）氨基酸的分类I非极性氨基酸（八种）丙氨酸

AlaCH3C

COOHHNH2CHCHCOOHNH2CH3CH3缬氨酸

ValC

COOHHNH2CH3CH3CH

CH2亮氨酸

Leu异亮氨酸

IleCOOHNH2HCH

CCH3CH2CH3I非极性氨基酸（八种）脯氨酸

ProCOOHNHCH2HCH2

CCH2苯丙氨酸

PheHC

COOHNH2CH2CH2C

COOHHNH2色氨酸

TrpNH甲硫氨酸

MetCOOHNH2HCH2

CCH2CH3

SII极性不带电荷的氨基酸（七种）COOHCH苏氨酸

ThrCH3

NH2HO

CH丝氨酸

SerHC

COOHNH2CH2HO半胱氨酸

CysCOOHHCNH2CH2HS酪氨酸

TyrCOOHHCNH2CH2HO

II极性不带电荷的氨基酸（七种）天冬酰胺

AsnHC

COOHNH2CH2OH2

CNCOOHHNH2谷氨酰胺

GlnOH2

CNCH2

CH2

C甘氨酸

GlyCOOHHCNH2HIII带负电荷的氨基酸（两种）天冬氨酸

AspHC

COOHNH2CH2OHO

CHNH2谷氨酸

GluOHO

CCH2

CH2

C

COOHIV带正电荷的氨基酸（三种）赖氨酸

LysCOOHHCNH2H2N

(CH2)4精氨酸

ArgHC

COOHNH2NH

(

CH2)3NHH2

CNCOOHHNH2组氨酸

HisCH2

CHN

N1.稀有的蛋白质氨基酸通常是常见氨基酸的衍生物如4羟脯氨酸、5羟赖氨酸稀有氨基酸2.非蛋白质氨基酸以游离或结合态存在细胞或组织中，大部分是常见氨基酸的衍生物或异构型。鸟氨酸、胍氨酸、高丝氨酸、β-丙氨酸、

γ-氨基丁酸等。形态：溶解性：：（三）氨基酸的性质pI

是氨基酸的特征常数COO-H3N+C

H

R-H+

pK1'+

H+H3N+COOH

C

H

R+

H+-H+

pK2'COO-

H2N

C

HR2.化学性质–氨基酸的两性解离与等电点氨基酸的等电点（isoeletric

point）氨基酸的等电点：当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3

和-COO

数目正好相+

-等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，pH变化时，迁移发生变化。氨基酸的R基团含有共轭双键，具有紫外吸收特性，在280nm处具有最大吸收值。2.化学性质–紫外吸收性质在加热条件及弱酸环境下，氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处，利用该性质进行比色测定氨基酸含量2.化学性质–茚三酮反应（四）氨基酸的生理功能寡肽、多肽的组成单位多种生物活性物质的前体：NO前体—精氨酸；褪黑色素前体-色氨酸。作为神经递质氧化分解产生ATP作为糖异生的前体蛋白质是具有三

结构的高分子物质，根据蛋白质肽链的折叠方式和复杂程度，将蛋白质结构分为…….123蛋白质的结构层次4Mathewset

al

(2000)

Biochemistry

(3e)

p.195蛋白质结构的层次一级结构氨基酸序列二级结构主要由氢键稳固的局部构象，如-helix,-sheet等三级结构一条多肽链中所有原子或基团在三 的整体排布四级结构多个多肽链的组合一、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构指蛋白质分子中多肽链的氨基酸排列顺序，包括二硫键的位置。IleAlaSerLeuPhe

TyrThr

LeuAsn

—COO-His

LysH3N+—

GlyVal

Cys

Glu

GlnSSPro

Val

Cys

Arg

AspLys蛋白质分子中氨基酸是如何连接的呢？一、肽键与肽链一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。二肽，多肽。氨基酸残基。COOHNH1

2OC

NH21两个氨基酸分子头尾连接起来肽键的形成以肽键为平面连接成多肽长链两肽键平面的交接点为α

-碳注意：α

-碳上面接有各种大小不等的基团肽链中AA的排列顺序和命名在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或

C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Gly-Tyr-Ala-Lue二、蛋白质的一级结构的测定蛋白质的一级结构指蛋

白质多肽链中AA的排列顺序以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物学功能的基础。如何测定蛋白质一级结构：氨基酸序列：Edman

degradationF.

Sanger

(Cambridge

U.)由cDNA

序列反推氨基酸序列：DNA

定序法：F.Sanger分析多肽链的N-末端和C－末端残基(二硝基氟苯法,丹酰氯法)用两种不同的裂解方式裂解多肽链为较小片段测定各片段的氨基酸顺序用片段 法重新建立完整多肽链的一级结构拆分蛋白质分子中的多肽链测定蛋白质分子中多肽链的数目蛋白质末端分析或SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定多肽链的氨基酸组成(盐酸水解,氨基酸分析仪分析)测序战略非共价键（需要用变性剂尿素或SDS）二硫键需要用氧化法或还原法末端氨基酸测定专一性裂解将肽段分离并测出顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序二硫键拆开纯蛋白质蛋白质顺序测定基本路线测定步骤A.测定蛋白质分子中多肽链的数目蛋

通过测定末端氨基酸残基数与蛋白质分白质

子量可确定多肽链的数目。—级结构的测定测定步骤B.多肽链的拆分由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。可用8mol/L尿素或

6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。蛋白质一级结构的测定测定步骤蛋白质一级结构的测定C.

二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在

8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。胰岛素-巯基乙醇碘乙酸二硫键的断裂D.分析每条多肽链的氨基酸组成经分离、纯化的多肽链一部分样品进行完全水解，离子交换柱层析分离测定氨基酸组成。蛋白质一级结构的测定测定步骤测定步骤E.分析多肽链的N-末端和C-末端残基以便建立两个重要的氨基酸序列参考点N末端

二硝基氟苯（DNFB）法丹磺酰氯（DNS）法Edman降解法氨肽酶法C末端

肼解法还原法

羧肽酶蛋白质一级结构的测定Edman降解法（苯异硫

酸酯法）主要涉及三步反应：偶联反应、环化断裂反应、转化反应。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。脱去N末端氨基酸后，剩下的肽链仍然是完整的。N末端基氨基酸测定苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）利用各种层析技术分离该物质在268nm处有最大的吸收值。苯异硫 酸酯（PITC)偶联、环化断裂、转化多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯 缩 不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。C末端基氨基酸测定①肼解法R

OH2N

CH

CRn

OHN

CH

C

OHR

n-1OHN

CH

CN-端氨基酸C-端氨基酸Rn

OCH

C

OHR

OCH

C

NHNH2+H2NH+NH2NH2

H2N氨基酸酰肼C-端氨基酸羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个水解。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；羧肽酶A能水解脂肪族或芳香族氨基酸（Pro除外）C-末端肽键；B只能水解由碱性氨基酸构成的C-末端肽键；C水解C-末端的Pro

；Y能切断各种氨基酸在C-末端的肽键，是一种最适用的羧肽酶。C末端基氨基酸测定②羧肽酶法测定步骤F.多肽链断裂成多个肽段可采用两种或多种不同的断裂方法（断裂点不同）将多肽样品断裂成两套或多套肽段，并将其分离开来。蛋白质一级结构的测定多肽链断裂法：酶解法和化学法

酶解法:胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶溴化

水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。多肽链的选

化学法：(Cyanogen

bromide)择性降解测定步骤蛋白质一级结构的测定G.测定每个肽段的氨基酸顺序Edman（苯异硫

酸酯法）氨基酸顺序分析法测定步骤H.确定肽段在多肽链中的次序利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错 ，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。蛋白质一级结构的测定借助

肽确定肽段次序：末端残基

H末端肽段

HOWTSAPS

（OUS）第一套肽段

HOWT

OUS

EOVE

RLA

PS第二套肽段

HO

WTOU

SEO

VERL

APS推断全顺序

HOWTOUSEOVERLAPS氨基末端残基H羧基末端残基S第二套肽段SEO

WTOU

VERL

APSHO第一套肽段OUS

PS

EOVERLA

HOWT片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意所得资料举例核酸推导法原理：蛋白质的氨基酸顺序是由核酸的核苷酸顺序决定的。测出核酸的核苷酸顺序根据三个核苷酸确定一个氨基酸的推导出蛋白质的氨基酸顺序蛋白质的空间结构蛋白质分子的构象又称空间结构、结构、高级结构、三维构象等，是指蛋白质分子中原子和基团在三上的排列、分布及肽链的。蛋白质分子的构象取决于一级结构，是蛋白质生物学功能或活性所必需的。蛋白质的构象可分为二、三、四级结构。二、蛋白质的构象123蛋白质的结构层次4Mathewset

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p.195蛋白质的构象如何维持？非共价键（次级键）（一）维持蛋白质构象的化学键非共价键（又称为次级键或副键）决定生物大分子和分子复合物的高级结构，在分子识别中起着关键的作用。氢键、疏水键、盐键、二硫键和力氢键的形成常见于连接在一电负性很强的原子上的氢1.氢键(hydrogen

bond)氢键(hydrogen

bond)氢键作用弱，但数量多，在维系蛋白质的空间结构稳定上起着重要的作用，主链骨架羰基的氧原子与亚氨基的氢原子形成的氢键是维持蛋白质二级结构的主要次级键。2.疏水键（hydrophobic

bond）疏水键是由两个非极性基团为避开水相而聚集在一起的作用力。蛋白质分子中许多氨基酸残基侧链是非极性的，这些非极性基团在水中相互 而形成疏水键，是维持蛋白质三、四级结构的主要作用力。三级结构中