细菌内毒素检查结果准确性的影响因素

关于细菌内毒素检查结果准确性的影响因素第1页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五一、试验误差分析及改进措施鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响实验器皿的的影响样品成份及理化性质的影响实验员的影响环境的影响第2页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五1鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性；鲎试剂灵敏度标示值的准确性。鲎试剂灵敏度的误差是否用细菌内毒素国家标准品标定？标示值是否准确？第3页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五2细菌内毒素标准品引起的误差细菌内毒素标准品种类细菌内毒素标准品效价误差细菌内毒素标准品操作误差细菌内毒素单位表示误差细菌内毒素标准品的错误使用

第4页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五1）细菌内毒素标准品种类细菌内毒素国际标准品细菌内毒素国家标准品细菌内毒素工作标准品第5页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五2）细菌内毒素标准品效价误差细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可能存在一定的误差。中国药典要求“当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂标示灵敏度准确。第6页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五3）内毒素标准品操作误差

取细菌内毒素工作标准一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。正确（易折点）错误第7页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五注意：①只能在安瓿的易折点上部开启内毒素，不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素粘在封口膜上。②只能取1ml的细菌内毒素检查用水复溶细菌内毒素工作标准品。③若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装保存。若为细菌内毒素工作标准品，为一次性使用。第8页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五4）错误使用有部分客户使用厂家生产的细菌内毒素来复核鲎试剂的灵敏度，这是一种错误行为，更有甚者使用厂家生产的细菌内毒素来交叉复核鲎试剂的灵敏度，这是一种严重错误行为。第9页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五3实验器皿的影响器皿的计量管理（校正）器皿的选择标准器皿的正确处理第10页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五1）器皿的选择标准鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用注射器，最好使用经过校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不精确，内壁磨沙面吸附内毒素，而且要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，故不宜选用注射器。第11页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五

如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在此行业中被鉴定为无内毒素和β-葡聚糖污染的产品，其中包括,无热原试管、无热原移液器吸头。这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快分析判断出误差原因。第12页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五2）器皿的正确处理2005年版《中国药品检验标准操作规范》278页——细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用自来水将残余的洗液洗净，再用蒸第13页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对第14页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂酶反应抑制或增强的反应，为了保证试验结果的准确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作规程，用多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。第15页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五4

样品成份及理化性质的影响

β-葡聚糖样物质的影响PH值的影响金属离子和弱酸阴离子的影响药物浓度的影响

第16页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五1）β-葡聚糖样物质的影响常见现象：假阳性。鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物质错判为内毒素。第17页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五目前我公司研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将其它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。第18页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五鲎试剂反应机理图第19页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五判断假阳性的方法：1、特异性鲎试剂法；2、定量反应曲线分析法；3、家兔模拟试验法。第20页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五2）PH值对反应速度的影响常见现象：样品阳性不成立。鲎试剂与内毒素反应的最适宜pH在6.5-8.0；pH≤3或≥10时，酶活性受到抑制。相对活力PH7.0第21页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五PH对反应速度的影响:影响酶原的激活；影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构使其变性失活。第22页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五

故鲎试验时，供试品pH最好应预调和6.5-8.0为好，必要时可用无内毒素的HCl或NaOH稀溶液调节pH值。美国、日本药局方以及中国药典故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。第23页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五3）金属离子和弱酸阴离子

离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离子（如Fe3+）的氧化性对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；重金属离子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白质变性而使酶失活；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。第24页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五4）药物浓度1、10%葡萄糖注射液2、白蛋白、小牛血清3、医用透明质酸钠4、中药类注射液

第25页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五5实验员的影响操作时严格按操作规程进行，安瓿开启前应先用酒精棉球擦拭曲颈部，用将颈部折断，防止碎玻屑掉入安瓿内。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加样时，取样均应准确。如果一人独立完成试验，可先稀释配制好内毒素标准溶液和样品溶液，然后开启复溶鲎试剂，最后加样，尽可能缩短鲎试剂溶液暴露在空气中的时间（最好控制在15分钟内）。第26页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五6、环境的影响保温时间保温温度1）保温温度将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成2λ，进行鲎试验，然后分别放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49℃水浴保温。实验中观察到凝胶形成的速度随着温度的升高而加快，但到达49℃保温90min也未出现凝胶。第27页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五

从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很大，保温温度在25～41℃之间，随着温度的升高，反应速度也升高，41℃尚未达到反应速度峰值，25℃时反应速度已相当快；在41～46℃之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响；达到49℃或更高温度时，随温度升高而使酶蛋白逐渐变性，则鲎试剂被破坏，反应速度反而降低。第28页，共31页，2022年，5月20日，19点20分，星期五

2）保温时间将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成2λ，进行鲎试验，37℃保温，分别在10、20、30、40、50、70min时观察，发现凝胶的形成状态随着时间的延长而坚固。第29页，共31页，2022年，5月20日，