第四章-药物定量分析与分析方法验证课件

第四章

药物定量分析与分析方法验证基本要求掌握：容量分析法、紫外分光光度法应用和计算熟悉：定量分析样品的前处理方法色谱分析法的应用和计算药品质量标准分析方法验证了解：生物样品分析方法的基本要求第一节定量分析样品的前处理方法不经有机破坏的分析方法直接测定法适用于含金属的有机药物或某些结合不牢固的有机金属药物配位滴定法、氧化还原滴定法富马酸亚铁【含量测定】取本品约0.3g，精密称定，加稀硫酸15ml，加热溶解后，放冷，加新沸过的冷水50ml与邻二氮菲指示液2滴，立即用硫酸铈滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。经水解后测定法适用于含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物碱水解后测定法、酸水解后测定法三氯叔丁醇【含量测定】取本品约0.1g，精密称定，加乙醇5ml，溶解后，加20％氢氧化钠溶液5ml，加热回流15分钟，放冷至室温，加水20ml与硝酸5ml，精密加硝酸银滴定液(0.1mol/L)30ml，再加邻苯二甲酸二丁酯5ml，密塞，强力振摇后，加硫酸铁铵指示液2ml，用硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。经还原分解后测定法碘原子直接与芳环相连的有机药物，在碱性溶液中加还原剂回流，转化为无机碘化物后测定泛影酸【含量测定】取本品约0.4g，精密称定，加氢氧化钠试液30ml与锌粉1.0g，加热回流30分钟，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤3次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。+NaI原理将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构氧化分解成二氧化碳和水，有机结合的氮转变为无机氮，与过量硫酸结合成硫酸氢铵及硫酸铵，经氢氧化钠碱化后释放出氨气，并随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。凯氏烧瓶电炉小漏斗冷凝管锥形瓶蒸馏装置消化装置第一法常量法干法破坏适用于含X，S，P等有机药物分析的前处理，以及某些药物中Se和As盐的检查高温炽灼法原理：将有机药物高温灼烧灰化，使有机结构分解，待测元素转化为无机元素或可溶性无机盐方法：加入辅助灰化试剂，小火加热，样品完全炭化后，高温灼烧

氧瓶燃烧法样品制备燃烧分解测定概念：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中充分燃烧，使待测元素转化为相应的无机物，用适当吸收液吸收后，采用适宜方法进行分析特点：简便快速，破坏完全，尤其适用于微量分析吸收液的作用与选择

作用：将样品经燃烧分解产生的各种价态的待测元素定量吸收并转变为一定的便于测定的价态

选择原则：根据待测元素的种类及所用分析方法选择合适的吸收液常用吸收液H2O（含F药物）H2O-NaOH（含Cl药物、含I药物）H2O-NaOH-SO2（含Br药物、含I药物）H2O-H2O2（含S药物）H2O-HNO3（含P药物）H2O-HNO3（含Se药物）第二节定量分析方法的特点一、容量分析法借助合适的指示剂变色来判断化学计量点操作简便快速，测定准确，但专属性较差化学原料药的含量测定首选容量分析法

特点滴定度（T，mg/ml）

每1ml规定浓度的滴定液相当于被测药物的质量aA+bB===cC+dD例：用碘量法测定VitC（M=176.13）含量时，碘滴定液的摩尔浓度为0.05mol/L，求其滴定度。C6H8O6+I2→C6H6O6+2HI————药物滴定液有关计算直接滴定法校正因数空白试验间接滴定法生成物滴定法计算需考虑药物、中间物和滴定剂三者之间的摩尔比例：葡萄糖酸锑钠的含量测定Sb5++2I-→Sb3++I2I2+2S2O32-→2I-+S4O62-剩余量滴定法（回滴定法）空白试验校正例：司可巴比妥钠的含量测定注意：第一滴定液与第二滴定液的浓度相当，即可以发生传递二、光谱分析法紫外-可见分光光度法波长范围：200-760nmLambert-Beer'slaw：A=lg1/T=ECl特点：灵敏、准确、简便、应用广泛测定法对照品比较法吸收系数法计算分光光度法比色法3691215200

220

260

280

320

340对照品比较法吸收系数法计算公式原料药固体制剂液体制剂例1利血平的含量测定：精密称取利血平对照品0.0201g，置100ml量瓶中，加氯仿4ml使溶解，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀；精密量取5m1，置50ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀。精密称取利血平供试品0.0205g，同法制备。在390nm的波长处分别测定吸收度，供试品和对照品溶液的吸收度分别为0.604、0.594，求其百分含量。

例2对乙酰氨基酚的含量测定：精密称取本品0.0410g，置250ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液50ml溶解后，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液10m1，加水至刻度，摇匀，照分光光度法，在257nm的波长处测定吸收度为0.58，按C8H9NO2的吸收系数()为715计算，求其百分含量。例3维生素B12注射液的含量测定：精密量取本品（规格1ml:0.1mg）7.5m1，置25ml量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，混匀，置lcm石英池中，以蒸馏水为空白，在361±1nm波长处吸收度为0.593，按为207计算本品按标示量的百分含量。三、色谱分析法高效液相色谱法用途：分析混合物的最有力工具构成：泵、流动相、色谱柱、进样阀、检测器、工作站特点：高灵敏、高选择、高效能、高速度、应用广泛一般要求：ODS，methanol-H2O，UV，etal

系统适用性试验

理论板数（n）分离度（R）重复性（RSD

）拖尾因子（T）测定法内标法加校正因子对照品溶液中加入内标物后测定，计算校正因子供试品溶液中加入内标物后测定，计算供试品含量外标法以对照品为参比，相对比较求出供试品含量例黄体酮的含量测定内标溶液配制：精密称取己烯雌醇25.06mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。对照溶液配制：精密称取黄体酮对照品26.05mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。测定法：精密量取对照溶液与内标溶液各5ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，取5ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取本品25.38mg，同法操作，测定。测得：对照溶液中，黄体酮峰面积为527635，内标峰面积为663451；供试品溶液中，黄体酮峰面积为495626；内标峰面积为671643。试按内标法计算供试品中黄体酮的百分含量。气相色谱法构成：载气、色谱柱、进样口、检测器、工作站一般要求：N2，packedorcapillarycolumn，

FID，250～350℃，etal测定法内标法加校正因子

排除留针时间、室温等因素影响外标法

自动进样，重复性较好

标准溶液加入法

顶空进样，消除基质效应的影响第三节药品分析方法的验证验证目的证明采用的方法适合于相应检测要求需验证的项目鉴别试验、杂质定量或限度检查、含量测定、制剂中其他成分测定等验证内容准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性准确度（accuracy）

测定结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(%)表示原料药制剂可获得全部组分，则同原料药方法不能获得全部组分，可采用标准加入法或与已知准确度的另一方法比较数据要求：至少高中低3个浓度9个数据精密度（precision）规定测试条件下，同一均匀样品经多次取样测定所得结果之间的接近程度表示方法偏差（deviation,d）标准偏差（standarddeviation,SD,S）相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD)验证内容重复性（批内精密度）3个不同浓度，分别制备3份供试品溶液测定相当于100%水平的供试品溶液，至少6次结果中间精密度考察随机变动因素：不同日期、人员、设备重现性不同实验室、不同人员进行协同检验数据要求：报告SD，RSD和可信限专属性（specificity）在其它成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性鉴别试验与结构相似物或共存物能区分，且互不干扰含量测定和杂质测定色谱法应附代表性图谱并标明位置加入杂质后考察结果是否受到干扰测定含杂质样品并与经典方法比较检测限（limitofdetection,LOD）

试样中被测物能被检测出的最低浓度或量常用方法目视法

适用于可目测评价的分析方法，如TLC法信噪比法适用于能显示基线噪音的方法，如HPLC法数据要求：用5～6份接近目标值的样品分析在设计的范围内，响应值与被测物浓度呈正比关系的程度配制系列浓度标准溶液，以响应值对浓度作图用最小二乘法进行线性回归回归方程Y=aX+b相关系数r定量限（limitofquantitation,LOQ）在准确度和精密度达到要求的前提下，分析方法能定量测定样品中药物的最低量测定方法与LOD相同信噪比法S/N=10线性（linearity）能达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限浓度或量的区间根据具体应用和考察结果确定，适用于定量测定耐用性（robustness）范围（range）测定条件有微小波动时，测定结果不受影响的承受程度典型变动因素：溶液稳定性、提取次数、时间；HPLC法中流动相组成和pH、不同品牌色谱柱等第四节生物样品分析方法的基本要求一、常用样品的种类、采集和贮藏血样血浆(plasma)、血清(serum)

血浆的制备全血、抗凝、离心、上清液

血浆的保存短期置冰箱冷藏，长期需低温冷冻

Eppendorf管二、生物样品分析前处理技术去除蛋白质目的释放出结合型的药物预防萃取中的乳化现象保护仪器性能常用方法与水混溶的有机溶剂：乙腈、甲醇中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠强酸：10%三氯醋酸、6%高氯酸Zn2+、Cu2+沉淀剂：CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH酶解：枯草菌溶素考虑3方面：1.生物样品的种类2.待测药物的性质3.采用的测定方法分离与纯化萃取目的从大量共存物中分离所需的微量组分通过溶剂蒸发使样品得到浓集液-液萃取法（liquid-liquidextraction，LLE）选择性强，效率高常用乙醚、三氯甲烷有机相:水相=1:1或2:1一般在碱性下萃取1次液-固萃取法（liquid-solidextraction，LSE）纯净安全、快速高效、消除乳化、溶剂兼容常用填充柱担体：亲水性的硅藻土和疏水性的活性炭、聚苯乙烯、C18键合硅胶商用微型柱：BoundElut，Sep-pak三、生物样品定量分析方法验证特异性标准曲线与线性范围精密度与准确度定量下限样品稳定性提取回收率质量控制练习与思考[名词解释]1.氧瓶燃烧法2.滴定度3.专属性4.线性1.氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为A.H2O2溶液B.H2O2-NaOH溶液C.NaOH溶液D.HNO3溶液E.H2SO4溶液[A型题]2.准确度是指用某分析方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，其常用评价指标是A.相对标准偏差B.代表性色谱图C.信噪比D.回收率E.相关系数[A型题]3.HPLC法中分离度（R）的计算公式为A.R=2（tR1-tR2）/（W1-W2）B.R=2（tR1+tR2）/（W1-W2）C.R=2（tR1-tR2）/（W1+W2）D.R=（tR2-tR1）