薄层色谱法课件

薄层色谱法薄层色谱法（

Thinlayerchromatography，TLC）薄层色谱法,又称薄层层析（《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法），系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得色谱图对比，亦可用薄层色谱扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。薄层色谱不需要特殊设备，操作简单，试样和展开剂用量少，展开速度快。特别适合于挥发性较小或较高温易发生变化的物质的分离。薄层色谱经常被用于探索柱层色谱分离条件和监测柱层色谱过程。薄层色谱在药品食品检验、化工化学、临床医学、农药残留检测等领域得到广泛应用。二、基本原理薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在流动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂）、薄层分配层析（纤维素）、薄层离子交换层析（离子交换剂）、薄层凝胶层析（分子筛凝胶）等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。液-固吸附三、仪器与材料①薄层板按支持物的材质分为玻璃板、塑料板或铝板等；按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等；固定相中可根据需要加入粘合剂、荧光剂等辅助物；可使用预制板或在保证色谱质量的前提下实验室自制的薄层板。用于制备薄层板的玻璃板要求表面光洁，平整，最好使用厚度为l-2mm的优质平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄层极，玻璃板需用洗液或碱液洗净至不挂水，晾干，贮存于干燥洁净处备用；反复使用时应注意需再用洗液或碱液清洗，如选用预制板应注意生产厂家提供的有关参数，挑选，检查并试用是否符合要求。

常见固定相种类：

硅胶—为使用最广泛的薄层材料氧化铝—有碱性、中性、酸性硅藻土—为化学中性吸附剂纤维素—天然多糖类聚酰胺—特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键的物质有特别的选择性

纯度高，含杂质少；粒度，结构均匀一致，有一定的比表面积；在展开剂中不溶；与展开剂和样品组分不发生化学反应；具有适当的吸附能力；机械强度和稳定性。按固定相粒径大小分为普通薄层板（10-40μm）和高效薄层板（5-10μm），实验室自制板固定相粒径一般要求10-40μm。固定相要求：实验室应用最广泛的为硅胶薄层板。常用类别有：

硅胶H：不含石膏黏合剂硅胶G：含煅石膏（硫酸钙）粘合剂硅胶S：用5%淀粉作黏合剂硅胶：用羧甲基纤维素（CMC）作黏合剂硅胶GF254：含煅石膏和一种无机荧光剂，即锰激活的硅酸锌，在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。

硅胶：化学分子式为mSiO2·nH2O,多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。③展开容器薄层色谱展开方式按几何类型份为：线型、环型和向心型。（a，b）线型（c）环型（d）向心型环型与向心型展开为特殊情况需求，需要借助特殊展开仪器进行展开；线型根据展开方向的不同可分为上行展开、下行展开、双向展开，水平展开，实验室一般使用的为线型上行展开与水平展开。上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开式必须能密闭。水平展开用专用的水平展开槽。平底、双槽展开缸水平展开室流动相选择与使用时需注意的问题：许多溶剂有吸湿性，使溶剂含水量不一致，导致实验难以重现。溶剂储藏时间和条件对溶剂质量影响，应注意出厂日期。对于易挥发的溶剂，难于配制稳定组成的流动相。要求操作格外小心，同时混合流动相不应重复使用。混合流动相组分之间（或杂质）可能发生相互作用。混合流动相组分要充分混匀形成均相。一些溶剂如氯仿、乙醚一般含有微量乙醇作保护剂，有时需重蒸除去乙醇。显色剂可以分成两大类：一类是检查一般有机化合物的通用显色剂;另一类是根据化合物分类或特殊官能团设计的专属性显色剂。通用显色剂常用的有一定比例的硫酸-水溶液、硫酸-甲醇或乙醇溶液等，喷后110℃烘烤，不同有机物有不同显色；碘蒸汽熏蒸，

对很多化合物显黄棕色；5%磷钼酸乙醇溶液喷后120℃烘烤，还原性化合物显蓝色等。专属性显色剂由于化合物种

类繁多，因此专属性显色剂也是很多的，以下是列举几例常用专属性显色剂：改良碘化铋钾，对含氮有机化合物，如生物碱等显色，结果：呈橙红色斑点；茚三酮，对氨基酸、胺与氨基糖类等显色，结果：呈红紫色斑点；磷钼酸乙醇液，喷后在140℃加热5～10min，皂苷元均显深蓝色。

⑤检视装置为装有可见光、254nm和365nm紫外光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像。暗箱内光源应有足够的光照度。紫外光灯的长波段（365nm）和短波段（254nm）紫外光管：前者用于观察具有荧光的色谱，后者一般用于观察硅胶GFS254薄层板色谱，黄绿色荧光背景下出现的暗蓝紫色吸收斑点，选用紫外光灯应注意荧光管的功率和滤光片的性能。

365nm紫外光检视例图254nm紫外光检视例图⑥薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。薄层扫描仪不仅可以进行原位定量，薄层扫描全图谱对定性鉴别也能提供有用的信息。薄层色谱扫描仪四、操作方法①薄层板的制备市售薄层板（预制板）临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不许活化。预制薄层板分常规薄层板及高效板两种，由于商品供应来源不一，需注意并记录生产厂家及生产批号，必要时需测定板效，以保证较好的重现性。在质量保证的前提下，应尽量选用预制薄层极，以提高时效和色谱的重现性。自制薄层板除另有规定外，将1份固定相（如硅胶G）和3份左右的水（或加有粘合剂的水溶液，如0.2%-0.5%的CMC-Na水溶液，或规定浓度的改性剂溶液）在研钵中沿同一个方向充分研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器，使硅胶浆均匀地涂布，薄层厚度一般为0.2～0.3mm，涂布好的薄层板于室温下水平台上晾干，再于110℃加热活化约30分钟，置干燥器中备用。使用前应在反射光和透射光下检查板面及纹理是否均匀，如不均匀，有气泡或有麻点、有破损或已污染（如灰尘、纤维）者应弃去不用。②点样

除另有规定外，在洁净干燥的环境下，用点样用的微升毛细管（或其他符合要求的点样工具）点样与薄层板上。一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线与底边的距离，视所用板的大小而定，如采用长度为10cm的板，点样距离底边以10-15mm为宜，高效板一般8-10mm。圆点状点样直径一般不大于4mm，高效板不大于2mm。如样品容量较大，或为了改善分离度，也可点成的条带状，条带状宽度一般为5-10mm，高效板条带宽度一般为4-8mm。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜。点样时须注意尽量不要损害薄层表面。一般的自制硅胶G薄层板，板面的牢度不够，定量测定时需特别注意小心点样，不要使原点部分的板面破损。

④显色与检视

有颜色的物质可在可见光下直接检视，无色物质可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或加热显色，在可见光下检视。有荧光的物质或显色后可激发荧光的物质可在紫外光灯（365nm或254nm）下观察荧光斑点。对于在紫外光灯下有吸收的成分，可用带有荧光剂的薄层板（如硅胶GF254板），在紫外光灯（254nm）下观察荧光板面上的荧光物质淬灭形成的斑点。注意事项：使用喷雾法喷洒显色剂时注意用喷雾器均匀喷洒于薄层板面；浸渍法板面显色均匀是其优点，但有的样品经试剂浸渍后斑点容易被浸润扩散，则不适用；涂布试剂后如加热显色需注意控制加热温度和时间，尤其含羧甲基纤维素钠的薄层板温度过高或加热时间过长易焦化，如用硫酸等试剂则可使板面碳化而影响显色效果；有的成分加试剂后加热温度和加热时间不同，显色效果可能有差别；有的品种用蒸气熏蒸（如碘蒸气）显色者，可在密闭器皿中放置适当时间至斑点显色清晰。⑤记录薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存，也可用薄层色谱扫描或其他适宜的方式（如薄层色谱原始记录）记录相应色谱图。①样品的预处理及供试液的制备

一般认为薄层色谱所用固定相（薄层板）可即用即弃，不怕供试液中杂质的污染，因而样品无需净化精制。但在实践中，由于中药的成分复杂，未知成分多，供试液中溶出的物质较多，其中既有欲测成分也有其他“杂质”。常常由于相互干扰或背景污染而难以得到满意的分高效果，甚至难以辨认。

所以在许多情况下为了得到一个较为清晰的色谱，样品提取物经预处理，使供试液得以净化，往往是一个重要的有时甚至是关键的步骤。

制各样品供试液所用的溶剂一般要求溶解度不宜太大，粘度不宜太高，沸点适中；但中药制剂往往希望将各成分尽量多地提取出来，最常被选用的是甲醇或乙醇，欲测成分和许多其他"杂质"均可能被提取出来。因此供试液的净化就显得更为必要。

样品供试液净化的方法通常有1．单一溶剂萃取法；2．分段萃取法；3．液液萃取法；4．固液萃取法。

②薄层色谱的点样技术

点样是薄层色谱的第一步，也是关键的一步，它既关系到能否得到可以重现的薄层色谱，也关系到定量测定结果的准确与否，因为不良的点样是测定误差的最主要的来源。

一般在常规薄层板上原点的直径不大于4mm，高效薄层板要求原点直径不大于2mm。点样量不宜过大，最好控制在10μl以下，如在一个位置重复多次点样时，须注意尽量不将原点点成一个空心圈。

选用溶剂沸点不宜太高（如正丁醇）或太低（如己醚）。如用乙醚提取，可将最终溶液改用其他非极性溶剂。如用亲水性溶剂，或在较高相对湿度环境下点样，点样后应将薄层板再干燥（如真空干燥）。点样时需注意尽量不要损伤薄层板表面。

控制展开时的相对湿度可在双槽展开箱的一侧用一定浓度的硫酸溶液，密闭放置一定时间（如15～30分钟），再加入展开剂于另一侧展开。也可将点样后的薄层板放入一定的容器中（或特制的湿度控制箱中）内有一定浓度的硫酸溶液或其他调节相对湿度的无机盐水溶液，密闭放置一定时间后，取出，立即在箱中展开。试验结果必须有展开时的相对湿度的记录。控制相对湿度用的硫酸溶液配制可参考下表：④溶剂蒸气在薄层色谱中的作用

薄层色谱与柱层色谱的区别之一就是溶剂的蒸气相在展开箱中也参与色谱的展开而形成三维的层析过程。展开箱的空间气体在薄层层析过程中起着重要的作用。

在常规薄层色谱分析中，层析过程是很复杂的