在pH≤1条件下生存的甲烷氧化菌

疣微菌门的一个新种：在pHW1条件下生存的甲烷氧化菌泥火山、泥沸泉和火山喷气孔是不一般的地质特征，它们会有气体、水和/或半流体泥浆基质1喷出，并且伴随有相当数量的甲烷气体排放到大气中（10-1至103ty-1）2-4。这些区域的环境条件从环境温度、中性pH到高温、低pH都有。虽然有强烈的迹象显示在泥火山有生物学的甲烷消耗4,5，但众所周知没有甲烷氧化菌能在火山喷气孔的恶劣条件（温度高达70°c而pH值低至1.8）下繁茂生长2。甲烷的有氧氧化第一步由可溶性或膜结合的甲烷单氧化酶进行催化。本文报道了pmoA（编码膜结合甲烷单氧化酶的P亚基）克隆库，它们是利用从火山泥沸泉硫质喷气孔和火山喷气孔附近裸土中提取的DNA而获得的，结果显示了新的远缘pmoA基因簇。在50C和pH2.0条件下对甲烷氧化菌进行富集培养后，与所有巳知pmoA基因同源性都不足50%的远缘基因簇在培养菌中得到了表达。最后，我们分离到1株嗜酸甲烷氧化菌AcidimethylosilexfumarolicumSo1V，属于浮霉菌门/疣微菌门/衣原体超门6，“不属于”包括巳定名甲烷氧化菌在内的a-和y-变形菌亚门。这种细菌生长在氧气受限条件下，以甲烷作为唯一能源，pH值可低至0.8 远低于曾报道过的甲烷氧化菌最佳pH值。A.fumarolicumSo1V有3种不同的pmoA基因，其中2种与泥沸泉处菌样的基因序列非常相似。源自美国黄石公园环境高度相似的16SrRNA基因序列表明：这种新型甲烷氧化菌可能是极端环境中的常见菌种。本文首次报道了分布广泛的疣微菌门中的代表菌与地球化学反应有关，而大部分疣微菌仍未分离鉴定6。生产于地球地壳的大量地质甲烷一般自然地释放到大气中3,7,8。甲烷释放的初步地球评估显示应该有足够量的甲烷资源来解释全球甲烷失踪8。最近的HaakonMosby和Carpatian泥火山研究结果表明，这些系统可能也是这些地质甲烷的汇4,5,9。在这些温和环境条件地区（2-25C和中性pH值），好氧和厌氧甲烷氧化菌中16SrRNA基因都存在。相反，那些例如位于那不勒斯附近波佐利（意大利南部）的硫质喷气孔的喷气孔处，也排放的大量甲烷（73吨甲烷每km2每年）2,它们土壤的特点是pH值低（低至1.0）且温度不断升高（高至70C）。这些地方富含硫化氢这种亚硫气体，其被微生物氧化成硫酸，从而造成了极度的酸性环境。硫质喷气孔的极度酸性土壤支持大量的甲烷消耗2,但迄今为止仍不知道可能是微生物造成这一消耗。假设绝对好氧甲烷氧化菌是一组独特的细菌组，无论是属于变形菌门a或y亚纲，它们均使用甲烷作为唯一的能量和碳源来源10。到目前为止，除报道Methylocellasp,是唯一含有可溶性细胞质形式的MMO（sMMO）外11，已证明其他所有好氧甲烷氧化菌均包含一类膜结合微粒甲烷单氧化酶（pMMO）。pmoA基因（编码膜结合MMO的24kDa的0-亚基12）通常作为甲烷氧化菌系统进化的标志。甲烷氧化菌广泛分别于自然环境中，并大多嗜中性和嗜温。但是，在分子研究的基础上，过去十年中极端变形甲烷氧化菌的分离和鉴定仍是刚刚开始13。迄今为止，从酸沼中分离细菌的报告仍然支持最低pH值下甲烷氧化菌仍具活性的事实11,14,15。这些细菌属于变形菌纲a亚纲（Methylocella，Methylocapsa和Methylocystis），并显示它们生长的pH在4.2和7.5之间，且在pH5.0左右甲烷氧化酶活性最大。

硫质喷气孔的内部，具有中央泥池（fangaia）周围充满裸露的酸性土壤（pH值1-2）的特点，那里是取样并提取DNA并开始对pmoA基因进行分子研究的地方。本文中构建存在于这种环境下的pmoA基因克隆库，需使用这种DNA为模板进行聚合酶链反应，其中pmoA引物为A189/A682C参见16），这样才能够广泛应用，也可扩增铵基单-氧化酶B亚基（amoA）的基因。我们只能使用非限制性条件（退火温度从56°C降低至48^；无假阳性克隆获得）扩增pmoA基因，需指出的是存在的pmoA基因与已知序列一致性低。pmoA序列的系统发育分析支持这种观点，并显示硫质喷气孔pmoA序列组分成两个组:一组代表着一枝全新的，pmoA/amoA进化系统树中的深枝，它们与已知序列同源性非常低（图1）；另一组是Y变形甲烷氧化菌。「SoilPmo397|FiangaiaPmoS^oilPhid49SFangaiaPmolZPmoS89Lr~IM82AfetJtyfomjcrofcwjmsp.Nl=FangaiaPmo3FamgaiaPmo4SoilPmol455076^Cionothrixfuses Thermophilicmetlian?DtrophHB闵厂MethyfococcuscapsrtrJatusBathB69SFangaiaPmolZPmoS89Lr~IM82AfetJtyfomjcrofcwjmsp.Nl=FangaiaPmo3FamgaiaPmo4SoilPmol455076^Cionothrixfuses Thermophilicmetlian?DtrophHB闵厂MethyfococcuscapsrtrJatusBathB6Gamma-proteobacteriaPmoA1=M&thyioc^ldumM&thyfocsidumt&pidumM&thyfacsidumgracflerMrtrosococctjsocea门倨100LMrtrosococctjssp.C11399厂M白thyfocy潇&sp.SC2Pito^Gamma-proteobacteriaAmoA68「 Metfr^fosjntjssponumS08PmoA2 Afef/iyfocapsaocidiphii^■—M祯yiocy^tissp.SC2PmoAl

lOOLAJelfty/osj'nussporii/mSC8PmoAl^AAlpha-proteobacteriaPmoA—Acidim9thyiQ3i^fumomi\cumPmoA2Acidim&thyiG&HQXfum^rolicumPmoAlSoilPmo8--SoilPmoS,FangaiaPmo8■EnrichmentB3EnrichmentA2SA3,B2.IB199待91NitrnsoiabusmuStifamiisNitmsospi^bnonsis Wftrosj/ironassuropaseArdKmeitianotroptis(PmoA)proteobacteriaPmoA0.5图1.推论的PmoA和AmoA蛋白间的亲缘关系。由PAMDayhoff矩阵计算出来的邻接树如图所示，分枝中用到了500个重复样品值作为引导指令值。那个条代表了50%的估计序列散度。应用不同的方法编排树发现树拓扑结构一致。FangaiaPmo和土壤Pmoprefix分别是指从泥温泉中心和裸露酸土样本中提取DNA进行的环境克隆。富集是指从两种（A和B）不同的富集培养物中提取DNA进行克隆。表1AcidimethylosilexfumarolicumSolv菌株的C1代谢基因Enzyme EnzymeCommissionGene BLASTPsearchagainstM^hyloaK.a/scopsA/iGtus(EC)nlieber Identity(%)Similarity(%)ExpectedvalueGenBankMethanemono-oxygenasepmoA2pmoA3pmoBlpmoB2pmoB3pmoCl*pmoC2pmoC3mmoX5357717441394038726：JMethanoldehydrogenaseFormaldehydedehydrogenaseForrnaldehyde-activatingenzymeFormatedehydrogenase4.3.-.-Serine-glyoxylateaminotransferaMethanemono-oxygenasepmoA2pmoA3pmoBlpmoB2pmoB3pmoCl*pmoC2pmoC3mmoX5357717441394038726：JMethanoldehydrogenaseFormaldehydedehydrogenaseForrnaldehyde-activatingenzymeFormatedehydrogenase4.3.-.-Serine-glyoxylateaminotransferaseHydroxypyruvatedehydrogenaseFormate-tetrahydrofolateligaseSerinehydroxymethyltransferase5-formyltetrahydrofolateeyeloli四seMethylenetetrahydrofolatedehydrogenase/methenyltetrahydrofolatecyclohydrolaseHexulose-6-phosphatesynthaseHexulose-6-phosphatei&omeraseRibulo&ebisphosphatecarboxylasePhosphoribulokina&ePhosphoglyceratekinaseGlyceraIdehyde-3-pbosphatedehydrogena&e9.2163.3.2/4.125.--.92.7.2312.1.135843NotpresentinSoIV7B1702055678655774NotpresentinM.aipWntustNotpresentinSoIMNotpresentinSoIMJ60 754164404920146866X105.5X101.2X10X10X108.7X10X108.0X1024X101.7X102.0X108.5X103.1X106.7X103.0X106.1X105.0X101.5X10X105.7X104.9X104.5X106.6X101.5X101.4X10监mcal797S1mcal79751mcal79775mca285376mca285375mca2853??mc^029550mca0295169mca029936mca0300耳mca0781mc^07752&mcal393172mcal392mcal391mcal38940m宜140623mcal407165mca2219135mcal66011Lmczi2773mc32743mca2744mc33051mca2021mca2598C1代谢基因在焦磷酸测序后基因组组装中被确定。组装产生了88.9Mb的序列信息，并导致了35倍的覆盖面，这是根据基因组2.5Mb的大小估算的。蛋白质序列的表达建立在基因确定的基础上，并用于荚膜甲基球菌基因组的BLAST搜索（http://pedant.gsf.de/）。*部分基因（48氨基酸）；+Prosthecochlorisaestuarii中最好的NCBIBLASThitwithfolD（一致性51%;相似性71%,E值1.0x10-73）；++Burkholderiaphytofirmans中最好的NCBIBLASThitwithgutQ（糖磷酸异构酶组）（一致性45%湘似性66%,E值2.0x10-78）。在新pmoA序列的启发下，我们用取样点的泥和混合土在50^和pH值2下富集培养，并把甲烷作为唯一能源和碳源来源。3个星期后，观测土和泥培养中的甲烷消耗量。以富集培养中的DNA为模板，进行pmoA序列的非限制性PCR扩增，产生与环境克隆中远亲组几乎相同序列的5份克隆体（来自两种不同的富集培养）（图1）。泥培养物连续重复的加入到新鲜介质中（见方法），并最终稀释的培养物通过浮动聚碳酸酯过滤器过滤17产生纯的培养物，并把它们命名为So1v菌株。过滤器上微小的白色菌落在1周后出现，显微镜观察发现只有一种杆状形态型。当指数增殖的So1v细胞经过测试，发现sMMO活性测试（转换萘为萘酚）为阴性，但pMMO活性（微粒MMO;使用丙烯）可以很容易地测量（50nmol-每min每mg蛋白）。提取So1v的基因组DNA并进行焦磷酸测序18。从这些数据中，我们可以确定许多C1代谢的基因（表1），这表明So1v菌株可能使用丝氨酸，四氢叶酸和核酮糖-1,5双磷酸盐的新组合途径进行碳同化。核酮糖-单磷酸盐途径的特征基因似乎不存在（见表1）。甲醛转换似乎被一四氢叶酸-依赖途径或直接的甲醛脱氢酶（活性110nmol每min每mg蛋白）所介导。甲醇脱氢酶的活性为每60nmol每min每mg蛋白质，并且mxaF基因显示与荚膜甲基球菌的mxaF有50%的一致性。没有发现sMMO亚基。但是，有两个完整的pmoCAB操纵子和一个带有部分pmoC的pmoCAB簇被发现。发现与pmoA引物A189/A682有几次（9次中有2次）不匹配（补充图.1），说明在环境DNA的PCR扩增中恢复性低。然而，所有标记的PmoA氨基酸均呈现，而标记的AmoA氨基酸酸不存在19。在所有细菌PmoA/AmoA蛋白中所有的42个高度保守的氨基酸19,6至8个没有共享一个或多个So1v菌株的pmoA基因（补充图.2）。pmoA基因的系统进化分析表明，pmoA1和pmoA2与硫质喷气孔和富集培养中的环境序列高度一致（图1，见上文）。pmoA3基因代表了另一种全新的深枝。综合这三个新pmoA序列表明，甲烷氧化菌有比目前假设更多样化的系统发育。最近基因组数据显示，两个相同或远亲的pmoA基因均可以在一种a-或Y-变形甲烷氧化菌中出现20-22。用特异性引物在在甲烷中生长的So1v细胞中提取mRNA（见方法），通过RT-PCR方法证实pmoA1和pmoA2的信使RNA的表达。透射电子显微镜观察发现甲烷氧化菌表达的pMMO的堆叠膜结构特性在So1v中不存在（补充图.3）。相反，在戊二醛固定或冷冻固定后观察到约50-70nm圆形体。这些圆形体可能会让人联想起在嗜酸甲烷氧化菌Methylocellapalustris中观察到小泡23。图2So1v菌株的生长特征。a，典型的生长曲线显示了甲烷（循环）的降低和光密度的升高，其中培养条件为PH2和55^。该方程是通过数据点得来的最好的指数适合的方程。b，增长率与pH值。插入图显示pH值低于2的扩增数据。不同的符号表示在不同的日期进行实验。Solv菌株的生长pH在0.8和5.8之间（图2）。最适生长温度为55°C,在温度低于40°C或高于55C只观察到微小的生长。在甲烷中最高比增长率为0.07h-1（倍增时间10小时）。泥水中二氧化碳和无机部分刺激其增长。甲烷转换为二氧化碳是根据一种对甲烷氧化菌很典型的化学计量法即：CH4+1.6O2—0.65CO2+1.55H2O+0.35CH20（生物量），其产量为6.4克干重每摩尔甲烷。醋酸，苹果酸，琥珀酸，甲酸，甲醛和酵母提取物（全部为1gl-1）在pH2下可完全抑制So1v在甲烷中的生长。这种细菌似乎在低pH值下对有机酸的非耦合趋势非常明显，因为在pH值5下甲酸（pKa值3.75）并没有抑制其生长。在NaCl大于100mM或含有葡萄糖的培养基中没有增长。除甲烷外，氢气也被氧化。So1v菌株在甲醇中生长良好，但增加的甲醇会完全抑制甲烷的消耗。当甲醇耗尽后，只有4小时后甲烷消耗和细菌增长才开始。乙烷会抑制细菌的生长，虽然它会作为甲烷竞争性的基质以同甲烷同样的转换速率被转换。乙炔（0.1%v/v）会瞬间造成甲烷消耗的完全抑制，一观察结果支持pMMO是主要的甲烷氧化系统。So1v菌株可以同时使用铵盐和硝酸盐作为氮源。在没有甲烷的铵盐中其不会生长。固氮和缺氧硝酸盐-依赖的甲醇氧化没有观察。So1v菌株有一个甲烷标准Ks值，为6gM。然而，其对氧的亲和力也非常高（Ks=0.7gM），这反映了其在自然生存环境下竞争氧的需要，微生物耗氧和氧气不断减少的恒流量火山气（主要含有二氧化碳）会导致氧气浓度非常低。图3Solv菌株和浮霉菌门/疣微菌门/衣原体总门中的代表菌株的16SrRNA基因序列间的亲缘关系。该树使用邻接算法木村2-参数校正进行计算。500个重复样品的引导指令值显示在节点处。比例尺为0.05核苷酸改变每个位置。使用探头EUBIII进行分离物的荧光原位杂交（FISH）分析，其目的主要想覆盖疣微菌目24,25，结果表现出强烈的杂交信号（补充图.4）。用EUBI，EUBII或a（ALF968），。（BET42a）或y（GAM42a）变形杆菌探针没有得到信号25,26。分离物的与疣微菌纲的类似身份通过其16SrRNA基因焦磷酸测序获得的序列确认（见上文）。一个特殊的探针设计建立在这个序列的基础上（SolV830，见方法），并且和探针EUBIII一起使用以确认Solv培养物的纯度。指数增长培养物中的所有细胞显示了双杂交（补充图.4）。So1v的16SrRNA序列的系统进化分析表明，分离物代表了一个新的细分在疣微菌门的第一成员（图3和补充图.5）。成对距离分析结果显示，其与其它细分成员有小于81%的一致性。SolV菌株属于极端嗜酸甲烷氧化菌是首次报告，其在系统发育上属于a-和y-变形菌纲（含有确定的甲烷氧化菌）亚门，我们建议这样命名它：’Acidimethylosilexfumarolicum',gen.nov.sp.nov,（补充资料）。到目前为止，疣微菌纲只包含少数厌氧或好氧异养型培养菌株，它们生长在含糖的简单或复杂的培养基中。但是环境克隆库显示，疣微菌纲有一个大的生物多样性，它们在许多生态系统中（土壤，泥炭沼，酸岩石排水处和垃圾堆渗滤液）都可以遇到，并往往数量相对较高，但其生理学是未知的6。有趣的推测是广泛分布的疣微菌门中大多数成员仍然不能人工培养6，这可能是耦合到地球化学的相关反应。So1v菌株16rRNA基因序列的BLAST探究显示了与6种环境克隆体非常高的（98-99%）相似性（图3），这6种环境克隆体是在黄石国家公园酸性温泉（RainbowandJoseph’sCoat）的微生物群落地球化学研究过程中获得的（未公布；NCBI编录号：AY882698，AY882699，AY882710，AY882819，AY882820和AY882834）。这表明，与A.fumarolicum类似的细菌可能是这些极端环境中的普通成员。新的pmoA和16SrRNA基因序列可能协助辨认在不太极端的环境中生存的浮霉菌门/疣微菌门/衣原体总门甲烷氧化菌，并显示它们是如何分布于全球。方法概要富集培养在从喷气孔取得的泥和混合土样品中进行，培养温度为50r，pH为2.0，并且甲烷作为唯一的能源和碳源来源。当观察到甲烷消耗时，样品向新鲜培养基中的系列转移开始。最后使用浮动-过滤技术获得纯的培养物17。使用FISH进行纯度检查，并对酵母膏富集的介质进行电镀，顶部空间中不含甲烷。环境样本的DNA和So1v菌株的基因组DNA分离按描述的方法进行28。pmoA和16SrRNA基因扩增分别使用引物A189和A682（参见16），616F（5’-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-37）和630R（5’-CAKAAAGGAGGTGATCC-3’）28热启动。基因组DNA的焦磷酸测序按描述的方法进行18。FISH显微镜检也按描述的方法进行29,并使用下面的核苷酸探针:EUBI，EUBII，EUBIII和SolV830（5'-GGTCGATTCCGCCAACGC-3’）。后来的探针设计按ARB程序进行30。pmoAmRNA的表达用RT-PCR进行分析。甲烷亲和力利用批处理培养细胞估计（OD600=0.24）。表观氧亲和力常数通过溶解氧微呼吸系统（UnisenseA/S）测量1mL微呼吸瓶中搅拌培养物的甲烷呼吸来测定。表1提到的酶活根据参考.23测定。好氧性甲烷氧化菌(Methanotrophicbacteria)能氧化从土壤和泥沙沉积等中释放出来的甲烷，甲烷是主要的温室气体之一，这些甲烷氧化菌就像是一个生物过滤器，能减少大气中甲烷的含量，因此也就成为了应对全球气候变化中的一种生物武器。目前这类细菌生长环境没有发现能低于pH5的，但是一些活性甲烷循环的环境酸度十分高。泥沸泉是含有限水分的酸性温泉，地下的酸麻和微生物瘠麻孔周圉的岩石分解成黏土和火山一檬的泥聚。如沸腾的水冒著泥泡，富泥聚越澧，底下的蒸麻厘力越高，嗔畿性就越大。如：「彩色金蔺嗔泉」(FountainPaintPot)，因岩石中分解出不同礁物^而呈淡粉、乳白和青蓝等色，又因受地熟影警而呈煮沸起泡状。它的圆周大的20公尺，四周用稠杆圉住，以免遮客太接近而畿生危除。KineticsandenzymeactivitEhsaffinityformethanewasestimatedbymeasuringtheconsumptionrateinaseriesofincubationsof10mlsamples,takenfromabatchculture(CD600=0.24)in100mlbottlesat50°C.Variousamountsofmethanewereaddedandbottleswereshakenvigorouslyat500r.p.m.Virtuallylinearratesweremeasuredduringonehour.Rateswereproportionaltothecelldensityintherangeused,indicatingthattherewasnomass-transferlimitationformethane.Fivemlof