DB15T 2555-2022原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法

ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB40内蒙古自治区地方标准DB15/T2555—2022原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法Technicalregulationoftheisolation,primarycultureandTechnicalregulationoftheisolation,primarycultureandidentificationofBovineMammaryEpithelialCellsderivedfromfreshmilk2022-04-252022-05-25内蒙古自治区市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。本文件主要起草人：杜瑞平、王潇、特日格勒、张兴夫、崔新洁、赵濛、云伏雨、张春华、羿静、康长清。原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法范围本文件规定了乳汁分离法培养鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞的术语与定义、材料、仪器和试剂耗材、操作步骤等技术要求与规范。本文件适用于从奶牛乳汁中分离培养和鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞。本文件没有规范性引用文件。下列术语和定义适用于本文件。原代原代牛腺皮胞 primarybovinemammaryepithelialcells从奶牛乳汁或乳腺中分离、培养并鉴定出来的上皮细胞。免疫光术 immunofluorescencetechnique染色组分析 karyotypeanalysis对不同生物的染色体组型（有丝分裂中期的染色体数目及其特征）进行定性和定量的分析和研究。4材料乳汁来源泌乳前期（22d～100d）健康奶牛。取样用无菌水及75%酒精擦洗奶牛乳房，挤牛乳约500mL分装于灭菌的蓝盖瓶中，37℃保温瓶保温带回实验室。仪器生物安全柜，CO2培养箱，高压蒸汽灭菌锅（137℃，0.25MPa），普通光学显微镜，超低温冰箱（-50℃～-86℃），PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪，低速冷冻离心机（2000g，-8℃～10℃），低温高速台式离心机（20000g，-8℃～10℃），酶标仪，恒温水浴锅，倒置荧光显微镜（40x～640x）。试剂PBS0.25，0.4%台盼蓝，MTT(0.5mg/mL(DMSO)，总RNADNA，PCR，Taq4（10IgG，DAPI（10μg/（5μg/mL），0.2%TritonX－100，10%Giemsa染色液等。完全培养液：10%FBS+DMEM/F12+100U青链霉素双抗+氢化考的松（1μg/mL）+孕酮（1μg/mL）+转铁蛋白（5μg/mL）+胰岛素（5μg/mL）+谷氨酰胺（200mmol/L）+EGF（10ng/mL）。核型分析固定液：甲醇：冰醋酸为3:1。耗材T25细胞培养瓶，96孔细胞培养板，90mm培养皿，0.22μM滤膜，15mL/50mL离心管，2mL细胞冻存管，无酶PCR管，移液器，血球计数板等。分离200mL（100U/mL）PBS2：115mL，500g20min，（100U/mL）PBS500g15min1mL15mLPBS重悬，500g5min，1mL培养向细胞层中加入5mL完全培养液，接种于T25细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔48h换液。待细胞形成单克隆后，原瓶胰酶消化，长至80%汇集时，传代培养。80PBS；T251mL37℃消化10min200μL300g5min，1:337℃、5CO24880冻存离心52×106/mL，用吸管轻轻吹打，令细胞处于重1mL8024h复苏401min375CO2808818β根据NCBI上公布的牛基因序列设计引物，引物序列符合附录A。RT-PCR80RNARNADNADNAPCRPCR95℃，5min；95℃，30s；62℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；30个循环。扩增体系符合附录B。细胞免疫荧光染色法鉴定角蛋白8固定细胞复苏培养，生长到80%汇集时，吸弃培养液并用PBS清洗细胞2～3次，常温下多聚甲醛固定30min，用PBS清洗细胞3次，每次5min～10min。封闭TritonX－100处理5min，用PBS清洗细胞3次，每次5min～10min；山羊血清封闭30min。100PBS于37℃下振荡孵育1或4PBS35min～10min（50FITCIgG）30minPBS35min～10min。6.6.4鉴定加入DAPI10C。复苏步骤同6.3.2，生长到80%汇集时，向培养液中加入秋水仙素使其终浓度为0.1μg/mL，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养3h～4h；消化步骤同6.2。缓缓加入5mL低渗KCl（0.075M，37℃预热），并轻吹细胞使其悬浮，37℃孵育30min，加入1mL新鲜配制的核型分析固定液预固定3min，300g离心5min，弃上清，加入新鲜配制的核型分析固定液6mL，并轻吹细胞使其悬浮，室温孵育30min，重复固定细胞2次并离心后，小心吸除大部分上清液，余下0.5mL固定液，轻吹细胞使其悬浮。用滴管吸取少量细胞悬液，从1m高处滴落在洁净载玻片上（-20℃预冷），迅速于酒精灯上过火烤干，将制作的标本浸入Giemsa染色液浸染10min，流水冲洗至水流无色并自然风干。用滴管吸取少量细胞悬液，从1m高处滴落在洁净载玻片上（-20℃预冷），迅速于酒精灯上过火烤干，将制作的标本浸入Giemsa染色液浸染10min，流水冲洗至水流无色并自然风干。29。附录A（规范性）PCR扩增反应引物牛基因序列设计引物见表A.1。表A.1PCRGeneBank序列号基因引物序列(5’-3’)产物长度NM_001033610.1角蛋白8F:TGGAAGGGCTGACTGATGAG540bpR:GCTTCCTGTAGGTGGCAATCNM_001192095.1角蛋白18F:CAGGGCGAGAAGGAGACCAT504bpR:TAAGGTCCTGAGGTTTGGGGNM_181008.2β-酪蛋白F:ATCCCTAACAGCCTCCCAC303bpR:AGAAAGGGACAGCACGGAC附录B（规范性）PCR扩增反应体系PCR扩增反应体系见表B.1。表B.1PCR无酶水7.2μL上游引物（10μmol/L）0.4μL下游引物（10μmol/L）0.4μLSYBRPremixExTaqＴＭⅡ(2×)10μLcDNA模板2μL总计20μL附录C（资料性）奶牛乳腺上皮细胞CK-8鉴定及染色体组型分析参照图AACDC.1。图C.1细胞免疫荧光组化鉴定奶牛乳腺上皮细胞角蛋白8A：镜下染色体原图；B：染色体组型的排列见图C.2。图C.2奶牛乳腺上皮细胞染色体组型分析参考文献JingjingWang,ChangmingGuo,ZhengkaiWei,etal.Morinsuppressesinflammatorycytokineexpressionbydownregulationofnuclearfactor-κB