单克隆抗体与杂交瘤技术课件

单克隆抗体与杂交瘤技术抗体攻击病毒凝集细菌整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术

基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术

噬菌体抗体库技术

Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术单克隆抗体与杂交瘤技术（MonoclonalAntibody,McAb&HybridomaTechnique)抗原（antigen,Ag）凡能诱导免疫系统发生免疫应答，并能与其诱导产生的抗体或效应细胞在体内或体外发生特异性反应的物质，就称为抗原。抗原的特性：免疫原性（immunogenicity）或抗原性（antigenicity）抗原能刺激特定的免疫活性细胞，使之活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质（抗体或效应细胞）。反应原性（reactogenicity）或免疫反应性（immunoreacticity）抗原可在体内外与相应的免疫反应产物发生特异性结合。完全抗原（completeantigen）:凡是具有免疫原性和反应原性的物质称为完全抗原。如大多数蛋白质、细菌、病毒等。半抗原（hapten）或不完全抗原（incompleteantigen）:只具有反应原性而无免疫原性的物质称为半抗原。半抗原可与相应抗体结合，具有反应原性。半抗原+载体→完全抗原半抗原多为简单的小分子物质，分子量小于4KD，如多糖、类脂、某些药物。基本概念Epitope，Antigenicdeterminant，AD抗原决定簇●一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇●

每个抗原决定簇至少诱生一种专一性抗体●

蛋白质性抗原决定簇含有六个以上氨基酸●抗原分子中决定抗原特异性的化学基团被称为

抗原决定簇或抗原表位免疫球蛋白的基本结构

基本结构：四肽对称结构

1、重链和轻链

重链（heavychain,H链）：

分子量50,000Da,由440个氨基酸残基组成；根据重链化学结构和抗原性的差异,将Ig分为G、M、A、D、E五类。

轻链（LightChain，L链）：

分子量25,000Da，由214个氨基酸残基组成；根据轻链化学结构和抗原性的差异将Ig分为K型和λ型。3、铰链区（hingeregion）:介于CH1和CH2功能区之间。特点：

富含脯氨酸，易于伸展弯曲；易被蛋白酶水解；不易形成a螺旋。

作用：

有利于抗原抗体结合暴露补体结合部位

功能区的作用：VL和VH——抗原特异性结合部位IgG的CH2IgM的CH3

补体（Clq）的结合部位IgG的CH3IgE的CH4

亲细胞调理活性，能与多种细胞表面相应受体（Fc受体）结合，发挥免疫作用IgG的CH2主动穿过胎盘，发挥被动免疫IgA的CH2完成粘膜细胞的主动运输和分泌多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb）：用传统的抗体制备方法,将抗原物质注入动物体内获得的免疫血清,是机体多个B淋巴细胞克隆针对抗原分子上的不同抗原决定簇产生的混合抗体,这种用体内免疫法制备的免疫血清称为多克隆抗体。单克隆抗体（MonoclonalAntibody，McAb）定义：由单个B淋巴细胞克隆产生的针对抗原上某一抗

原决定簇的同源抗体称为单克隆抗体。

抗原1234免疫传统抗血清多克隆抗体12341234脾脏B淋巴细胞Polyclonalantibodyproduction

传统抗血清的交叉反应专一性反应没有反应交叉反应+-?123AgA

xyzAgB1’20AgA’1231231231234杂交瘤细胞细胞融合1234克隆化1234脾细胞取出脾细胞+mmmm骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞单克隆抗体Monoclonalantibodyproduction1234经抗原免疫的B淋巴细胞能够产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖；骨髓瘤细胞——一种浆细胞肿瘤——易于建立细胞系，在体外培养中能够无限繁殖，不分泌特异性抗体；将这两种细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特点，既保存了骨髓瘤细胞无限迅速增殖的特性，又继承免疫淋巴细胞合成、分泌特异性抗体的能力。一、单克隆抗体产生的原理可生产有用抗体的

淋巴细胞若与

瘤细胞

融合，则形成稳定而可培养的细胞株。瘤细胞可培养生长B淋巴细胞可分泌抗体杂交瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起体外无限增殖分泌特异抗体一个Bcell只产生一种抗体单克隆杂交瘤的制备三、研制单克隆抗体的工艺流程与步骤

McAb的研制包括：抗原制备；用研究对象为抗原对小鼠免疫；免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；细胞融合；以HAT培养基选择性培养生长的融合细胞（杂交瘤细胞）；对融合细胞产生的抗体进行筛选；将理想的融合细胞进行克隆→筛选→再克隆；单克隆抗体的检定；分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；单克隆抗体的大量制备。-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤细胞（Subcloning）

(确定只有一种细胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌细胞Bcell脾细胞分株培养筛选筛选单抗传统抗体(抗血清)试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d’新的抗原四、制备单克隆抗体的关键技术

动物免疫

目的：

B淋巴细胞在目的抗原刺激下分化、增殖、形成致敏B淋巴细胞，有利于细胞融合形成杂交瘤细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的频率。免疫方案的确定原则：

抗原的性质和纯度

抗原量

免疫的途径

次数及间隔的时间

佐剂的应用

动物对该抗原的免疫应答抗原的纯度：要求并不严格细胞性抗原：免疫原性高，可不使用佐剂可溶性抗原：免疫原性差，用佐剂佐剂：某些物质若先于抗原或与抗原一起注入人体，可增强机体对抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂（Immunoadjuvant），简称佐剂（adjuvant）。一般分为以下几类：无机佐剂：如氢氧化铝、明矾等有机佐剂：微生物及其代谢产物，如分枝杆菌（结核杆菌、卡介苗）、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰氏阴性杆菌的内毒素（脂多糖）等合成佐剂：包括人工合成的双链多聚核苷酸，如双链多聚肌苷酸，胞苷酸（polyI:c）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸(polyA:U)等。油剂：如弗氏佐剂、花生油佐剂、矿物油、植物油等。动物免疫佐剂的作用机制，尚未完全清楚。改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，有利于抗原缓慢释放，延长抗原在体内停留时间。被佐剂吸附的抗原尤其是可溶性抗原，易被巨噬细胞吞噬，促进对抗原的处理，在局部形成炎症反应。刺激淋巴细胞增殖和分化，从而增强和扩大免疫应答的能力动物品系的选择一般常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和Lou大鼠，故免疫动物原则上也应采用相应的种系；考虑动物对抗原的免疫应答反应；8-12周龄雌性小鼠。B细胞在何阶段最易与骨髓瘤细胞融合增生、分化中的B细胞较易于融合。为达到最大数量的杂交细胞，需要最大数量的浆母细胞。采用何种动物免疫方法能提高阳性杂交瘤的形成率在多数情况下，短的免疫程序（数天）较成功。此时，脾中淋巴细胞——浆母细胞比例较大，融合成功率高。免疫途径与融合后杂交瘤分泌的Ig类也有关系，例如：一般免疫法产生的IgA类McAb发生率很低（<1%），但采用胃内接种法免疫小鼠，分泌的IgA类McAb占60%左右。体内免疫：皮下腹腔尾静脉脾内免疫动物免疫体外免疫：近年来也有直接将正常淋巴细胞在体外用抗原刺激后与骨髓瘤细胞融合，成功获得了分泌特异性的McAb。体外免疫法具有以下优点：a.所需抗原少，只需几微克b.免疫时存在的抗原量，在免疫中可保持一定的抗原浓度c.免疫期短，只需4-5天。d.使用于难以或不能采用体内免疫法（如制造人的McAb时）的免疫e.体内免疫时免疫原性不好或无应答反应的抗原，在体外致敏时可诱导抗体的产生。动物免疫选择要点：1.小鼠的骨髓瘤细胞系均来自→BALB/c小鼠系大鼠的骨髓瘤细胞系均来自→Lou大鼠系，该系大鼠有高的自发骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞应与免疫动物为同一种系原因：由于免疫动物品系与所采用的骨髓瘤细胞在种系发生上的差距越远，所产生的杂交瘤的稳定性越差（染色体容易丢失）；以后用杂交瘤接种动物形成肿瘤，通过腹水制备大量的McAb时，若不是同一种系，则会发生免疫排异反应，杂交瘤在体内生长有困难，进而给McAb的制备带来困难。骨髓瘤细胞的选择骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体骨髓瘤细胞很容易发生突变，有可能导致自身不分泌Ig（分泌Ig的染色体丢失），我们筛选这种骨髓瘤细胞系，与脾细胞进行融合后，则杂种只表达亲代脾细胞提供的Ig，产生特异性抗体的比率大大提高。选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）和胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）。可用8-AG定期处理，避免细胞返祖。骨髓瘤细胞的生长状态是杂交成功的关键。两个亲代细胞的融合必须具有相似的分化期，均处于分化活跃的对数生长期。细胞培养液也非常关键，尤其是牛血清的质量。骨髓瘤细胞的选择细胞融合技术融合剂：

除生殖细胞（精子和卵子）和破骨细胞外，其它细胞发生自发性融合是相当少见的。但任何2个细胞均可在某些融合剂的作用下，发生融合。如仙台病毒、溶血卵磷脂、胰蛋白酶、PEG（聚乙二醇）。

1975年，Kohler和Milstein第一次报告的杂交瘤技术所用的融合剂就是仙台病毒。1974年PEG作为融合剂用于高等植物细胞的融合，这是最初用于细胞融合。1975年，用于人的成纤维细胞。1977年，用于骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合，至今世界各国均采用PEG代替仙台病毒。PEG较仙台病毒：融合率可提高300倍。化学产品，来源充足。实验条件也比较容易控制。PEG4000效果最好，一般使用浓度30%-50%。低于30%，融合率低；高于50%，对细胞毒性太大。细胞融合机理及稳定性：

在PEG作用下，两个细胞突起间发生细胞膜的融合，随后可见两个或多个核的细胞。细胞继续分裂，形成两个含单一细胞核的子细胞，具有从亲代细胞来的大部分染色体（在分裂过程中，可能导致部分染色体丢失）这种细胞称为杂交细胞。

杂交细胞有的是稳定的，但在进一步分裂时一般有丧失染色体的迹象。应筛选稳定的克隆。细胞融合技术骨髓瘤细胞与免疫脾细胞间的融合率：5×107个骨髓瘤细胞与108个脾细胞融合后，能存活下来并无限生长的杂种细胞只有100-200个，以脾细胞计算约为百万分之一或五十万分之一。细胞融合过程（举例）：制备107骨髓瘤细胞悬液制备108免疫脾细胞悬液混匀→离心→去上清→37℃水浴保温下→缓慢加入预热的50%PEG→搅拌1分钟→缓慢加入培养液→多孔板上加入饲养细胞→细胞融合液接种于多孔板上→培育2-4天，加入HAT选择培养基以替代部分原培养液→培养5-6天，可见小克隆→培养至9-10天，可见大克隆。细胞融合技术饲养细胞及其作用：

在细胞融合后的选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，因此必须加入其它活细胞使之繁殖，这种细胞被称为饲养细胞。

作用：提高杂交瘤细胞的成活率；释放生长刺激因子，为杂交瘤提供必要的生长条件；吞噬清除死亡的非融合细胞；增加密度，满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的要求。

一般采用小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。1.检测方法：

①直接测定杂交瘤的培养物上清液中的抗体。

如：采用放射性同位素，酶或荧光色素标记的第二抗体进行测定。②直接测定抗体分泌细胞

如空斑形成试验：将杂交瘤细胞、红细胞、一定浓度琼脂混合，若杂交瘤细胞分泌抗SRBC的抗体，就形成空斑。也可将抗原包被红细胞，即可检测杂交瘤细胞是否分泌相应的抗体。2.HAT选择性培养

HAT培养基：能使融合后的杂交瘤细胞得以生长，而使未融合的、生长迅速的骨髓瘤细胞死亡的选择性培养基。

主要含次黄嘌呤（H）、氨基碟呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）。杂交瘤细胞的筛选核苷酸从头合成途径（denovosynthesis）核苷酸补救合成途径（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基喋呤（A）次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）HGPRTTKHAT选择性培养原理

小鼠脾细胞小鼠骨髓瘤细胞

未融合的相互融合的脾细胞与相互融合未融合的脾细胞脾细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HAT选择性培养液中培养

HGPRT+TK+HGPRT+TK+HGPRT-TK–代谢完整

代谢完整

代谢缺陷培养不适应培养适应培养适应

细胞死亡细胞存活、增殖细胞死亡

筛选HGPRT-或TK-的骨髓瘤细胞作为融合一方，在存在A和HT时,不能合成完整的DNA,因而未融合的骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能繁殖而死亡.一般淋巴细胞是HGPRT+和TK+的正常基因,但在体外培养条件下不能长期存活、繁殖，最后也死亡。杂种细胞及杂种经过有丝分裂所产生的全部后代细胞由于从脾细胞中获得了正常功能的HGPRT和TK基因及其产物，且从骨髓瘤细胞获得了肿瘤生长特性（即无限繁殖能力），因此能在HAT的组织培养液中存活。

HGPRT-株的筛选是通过毒性药物选择产生的。硫鸟嘌呤TG8-氮鸟嘌呤8-AG→通过HGPRT掺入DNA中，使细胞死亡。HGPRTˉ的细胞则存活下来，成为8-AG的抗性株。HGPRT基因在X染色体上，一般哺乳动物只有一个活化X染色体。∴单一突变→HGPRTˉTK基因突变需两个罕有的突变同时发生，比较困难。克隆与再克隆在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。克隆化—即把培养孔中的细胞分离成单个细胞进行培养繁殖，形成细胞群体，以达到纯化细胞的目的。原则：尽快进行早期克隆抗体的检测，克隆长大后会减少克隆化时获得的阳性克隆的机率。用24孔板，每孔中常有2-3个不同性质克隆生长，来自特异性克隆细胞相对减少。由于染色体易丢失，即不稳定性，一旦抗体检测为阳性且有可能是目标抗体，就应立即克隆，同时双份传代，液氮保存。此外还因为非分泌克隆（无抗体的染色体）往往比分泌克隆生长迅速，因此也应抗体检测为阳性，就立即克隆。否则分泌性克隆丢失。融合后待骨髓瘤细胞死亡，可将HAT换以HT（即去掉A，氨基碟呤，恢复DNA从头合成途径），但抑制作用不能马上解除，尚需HT存在，若突然换上普通培养液，可导致细胞死亡。应用有限稀释法一次克隆难以保证为单克隆，因此应进行两次以上克隆，即克隆与再克隆。细胞培养物应定期测试，某些可能慢慢变成阴性，在任何一步，如发现有意义的抗体消失了，就应开启原始冻存的细胞管。克隆与再克隆

获得单克隆的克隆化方法显微操作法：在倒置显微镜下，用毛细管将单个细胞逐个吸出，分别放入已加有饲养细胞的96孔板中继续培养。本法特点是借助显微镜选择形态好的细胞，准确性强。软琼脂法：琼脂与细胞悬液混合后倾注入平皿中，4-5天，可见其中的克隆，可在显微镜下挑出。有限稀释法：一般实验室最常用的克隆化方法。将细胞悬液连续稀释，到一定程度时，就有可能得到含单个细胞的悬液，将其接种到培养板中，由此得到单个细胞增殖形成同源性的细胞克隆。但工作量大，有一定的盲目性。一步一步稀释→1个细胞/ml或2个细胞/ml五、单克隆抗体的大规模生产及保存

（一）单克隆抗体的大规模生产

1、动物体内诱生法预处理:腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷。接种杂交瘤细胞:腹腔内注射杂交瘤细胞液。

采集腹水:约1-2周,可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。

有关问题经产雌鼠的腹水产量高,1-5ml。降植烷，液体石蜡和福氏不完全佐剂预处理小鼠的效果相同，降植烷与不完全佐剂混合使用，腹水产生快,收获量多，IgG含量及效价高,1-5mg/ml。接种量5×105/只小鼠,过多往往未及收集腹水，小鼠已死亡，过少则诱生腹水所需的时间较长。混杂有鼠Ig。2、静置培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养；收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。有关问题静止细胞培养是最简单的培养方法，细胞所需要的O2、养分排出的CO2、代谢产物，通过扩散方法与培养液交换。由于扩散速度慢，限制了细胞生长，mAb产生效率低，得率为1～100μg/106细胞/24h。无鼠Ig,有血清蛋白。3、杂交瘤细胞的体外高密度培养悬浮培养即采用转瓶或发酵罐式的生物反应器，其中包括利用微载体、纤维片等生物反应器主要特点是：工程结构较为简单，动力学方面如搅拌功率、通气量可按比例地放大，剪切力低和高氧传递等气升式生物反应器

搅拌式生物反应器

细胞固定化培养是另一种容积相对小的、高密度细胞培养系统。如中空纤维的灌流培养固定床巨载体灌流培养微囊化细胞培养系统中空纤维培养系统中空纤维培养系统1.纯批式（batch）:一次性将培养液全部加入培养装

置，培养过程中只通气，不补充培养液，待细胞增殖

到一定密度，营养成分耗尽，有害代谢产物累积到一

定程度时终止培养，收获培养上清，提取mAb。

2.流加式（Fed－batch):也称半批式，即在接种杂交瘤

细胞时先加入一定量的培养液，在培养过程中定时定

量添加新培养液，整个培养过程没有流出或回收。培养模式3.半连续式（semi-continuousculture）：在培养过程中，定时定量从培养装置中取出培养上清，并加入等量培养液，最后将收获的上清合并，取mAb。

4.

连续式（continuousculture）：

在培养过程中使新鲜培养液和陈旧的培养液以一定的比例和速度不断地加入和流出，这样培养条件均衡一致，可以稳定地供给细胞新的营养，并除去有害的代谢产物，但培养液消耗大。5、灌流式培养（perfusionculture）：细胞和培养基一起加入反应器后，当细胞达到一定密度后，在随后的培养过程中，不断地将部分培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。它与半连续式操作的不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内，而半连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。悬浮培养的优点：增加了细胞生长空间；培养液利用率高；高时空效率；易于自动化检测和监控。（二）单克隆抗体贮存无菌样品可于4℃贮存几个月，一般加入0.1%NaN3作为防腐剂。大部分应放在-20℃，最好-70℃。避免反复冻融。

六、单克隆抗体的优点和存在的问题（一）优点：

a.特异性高，它可以只与抗原分子上的一个决定簇起反应。b.抗体成分，性质及结构上具有纯一性。c.实验结果的高度可重复性

多克隆抗体可能在前一次制备过程中，产生针对某抗原决定簇的抗体含量高，而下一次同一抗体的水平可能比较低。如果分别用两次制备的抗体进行检测或治疗，那么结果就可能会有出入。

d.工业化生产特异性单克隆抗体，可无限供应。效价高。e.可应用于非常敏感的免疫学试验，一般无假阳性反应。特异性强。（二）存在的问题：鼠源性mAb作为一种异种蛋白，应用于人体容易能刺激机体产生抗抗体反应，不仅可使鼠源性mAb很快失去活性，严重时还可以引起变态反应，因此鼠源性mAb应用于人类疾病的治疗，有一定的局限性。细胞融合（一）定义：两个或多个细胞相互接触后，细胞膜发生分子重排，导致细胞合并，染色体等遗传物质重组的过程，称为细胞融合。主要过程制备原生质体：植物用。诱导细胞融合：一般1∶1制备杂合细胞：将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让杂合细胞有选择地生长，其它未融合的细胞无法生长，藉此获得具有双遗传性状的杂合细胞。细胞融合是研究细胞间遗传信息的转移，基因在染色体上的定位，创造新细胞株的有效途径。（二）细胞融合的途径：病毒诱导融合：主要动物细胞病毒表面有促进细胞融合的蛋白

①1958年，冈田善雄发现已灭活的仙台病毒（副粘病毒一种），可诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合形成多核体细胞。以后科学家证实其它的副粘病毒、天花病毒、疱疹病毒也能诱导细胞融合。

②方法：如亲本细胞都呈单层贴壁生长，可以混合培养后直接加入灭活的仙台病毒诱导融合即可。缺点

a.病毒的致病性与寄生性，制备困难；

b.细胞融合率低，重复性不高。近年已不多用。化学诱导融合——尤其PEG融合，是动植物细胞融合的主要手段1974年高国楠用聚乙二醇（PEG）成功诱导植物细胞融合

1975年Pontecorvo即用该法成功融合动物细胞。方法：以PEG诱导植物细胞为例植物细胞原生质体融合：按比例混合原生质体→滴加PEG溶液，摇匀，静置→滴加高钙高PH溶液，摇匀，静置→滴加原生质体培养液洗涤数次→离心获得原生质体细胞团→筛选，再生杂合细胞。通常，在PEG处理阶段，原生质体间只发生凝集现象，加入高钙，高PH值溶液稀释后，紧挨着的原生质体间才出现大量的细胞融合。融合率可达10%-50%非选择性融合，即可发生于同种细胞之间，也可能在异种细胞中出现。处理时间要适中处理短，融合率低处理长，由于PEG结合高钙高PH溶液对原生质体有一定毒性，原