微生物实验(第三节课)课件

微生物学实验微生物学实验微生物实验的意义、研究进展和实验内容一、研究内容研究微生物的形态、结构、生理生化遗传变异、微生物与其他生物、与自然界之间的关系

机理研究：微生物适应环境的机制鞭毛运动的机理等是生化和分子生物学研究的重要内容

微生物实验的意义、研究进展和实验内容一、研究内容2.微生物与实际应用微生物与发酵工程微生物与环境工程微生物与农业微生物与医学领域微生物与食品工业2.微生物与实际应用微生物与发酵工程二、微生物学研究进展微生物基因组学研究（MicrobialGenomics）不可培养微生物（UnculturedMicroorganisms）DNA芯片（DNAChip）三域学说（Bacteria,Archae,Eucaryote）二、微生物学研究进展三、微生物学与Nobel奖

到目前为止，几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖都与微生物学有关参考：沈萍教授《微生物学》绪论部分

Nobel获奖者全书三、微生物学与Nobel奖四、如何进行微生物学实验

严肃认真科学态度分析问题搞清原理四、如何进行微生物学实验五、微生物实验安排与考核基础实验：4次大实验设计实验方案实验操作总结汇报五、微生物实验安排与考核基础实验：4次大实验课堂纪律严格遵守实验室规章制度严肃课堂纪律不允许无故旷课、早退（1次）迟到（3次）工作服课堂纪律严格遵守实验室规章制度实验室安全和卫生安全实验室严禁吸烟。注意用水、防电和防火正确使用化学试剂和仪器卫生每次实验需留下6位同学值日，协助保持实验室清洁实验室安全和卫生安全卫生实验一实验室环境和人体体表微生物的检测实验目的实验原理实验材料实验步骤实验结果思考题实验一实验室环境和人体体表微生物的检测实验目的一、实验目的通过实验验证在实验室内的空气、器、物和人体表面上存在着微生物。观察不同微生物的菌落形态特征。比较不同取样处微生物的类型和数量。学习从自然环境中采集微生物的方法，了解并掌握无菌操作技术。一、实验目的通过实验验证在实验室内的空气、器、物和人体表面上二、实验原理空气中的微生物菌体和霉菌孢子→无处不在接种于含有丰富营养，不带有任何其它微生物的琼脂固体培养基上，在适宜条件下，微生物吸收各种营养，可形成肉眼可见的群体——菌落。不同微生物形成的菌落差异很大。二、实验原理空气中的微生物菌体和霉菌孢子→无处不在三、实验材料培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂平板用具：接种环、酒精灯、无菌水、灭菌棉签、试管架、记号笔、废物缸、吸水纸等。三、实验材料培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂平板四、实验步骤一、平板皿底标记姓名、日期、组别、样品来

源等，字体要小。二、实验室空气及空气传播微生物的检查：（1）空气（2）口腔（3）头发四、实验步骤一、平板皿底标记姓名、日期、组别、样品来四、实验步骤三、人体体表及钱币上微生物的检查（1）无菌操作技术各种培养基、玻璃器皿等进行高压蒸汽灭菌；接种环、接种针用火焰灼烧灭菌。实验台用0.25%新洁尔灭溶液擦拭。火焰3cm区是无菌区，无菌操作均需在此范围内。四、实验步骤三、人体体表及钱币上微生物的检查四、实验步骤三、人体体表及钱币上微生物的检查（2）人体体表和钱币上微生物的检查平板标注；无菌操作法取无菌水、皮肤表面、手指、鼻腔、钱币上微生物，划线培养。四、实验步骤三、人体体表及钱币上微生物的检查四、实验步骤四、记录结果菌落计数；菌落形态观察。四、实验步骤四、记录结果五、实验报告一、按下表所列各项将实验结果填入二、与其它同学所做的结果进行比较五、实验报告一、按下表所列各项将实验结果填入六、思考题比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多：实验室空气与飞沫的样品有无类型相同的菌落？为什么？通过本次实验，你对环境中的微生物分布有何认识？为什么在进行微生物学时要严格按照无菌操作进行？六、思考题比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类实验二细菌形态的观察实验目的实验原理实验材料实验步骤实验结果思考题实验二细菌形态的观察实验目的一、实验目的认识细菌的基本形态；学习掌握细菌压滴片和悬滴片的制作方法。一、实验目的认识细菌的基本形态；二、实验原理压滴法：将细菌悬液滴于载玻片中央，加上盖玻片，置于显微镜下观察。——研究微生物形态最简单、最基本的方法之一。悬滴法：将细菌悬液滴于盖玻片中央，翻转，置于凹玻片的凹窝中央。——用于观察并区别细菌运动的方式，也可观察细菌的繁殖方式、孢子萌发等。二、实验原理压滴法：将细菌悬液滴于载玻片中央，加上盖玻片，置三、实验材料菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、福氏志贺氏菌。用具：显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、纱布、镜头纸、镊子、特种铅笔、无菌水、凡士林油、打火机、火柴、酒精灯、玻片架、香柏油、二甲苯、0.85%NaCl。三、实验材料菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、福四、实验步骤一、压滴标本制作（1）记号笔标记载玻片；（2）点燃酒精灯，无菌水滴于拨片中央；（3）无菌操作取菌，与无菌水中，涂匀；（4）用镊子取盖玻片，由一端与载玻片菌液

接触，轻轻放下，注意不要有气泡；（5）置于显微镜下观察。四、实验步骤一、压滴标本制作四、实验步骤二、悬滴标本制作（1）取清洁的凹玻片和盖玻片各一枚；（2）用火柴去少许凡士林涂于盖玻片的四角；（3）在盖玻片的中央用接种环蘸取一小滴无

菌水，然后无

菌操作去少许菌苔在水滴上轻沾一下，注意水滴大小要

适宜，放菌苔时不要使水滴破散；（4）将凹玻片翻转向下，使凹窝中央对准盖玻片中央液滴，然后轻压，使凹玻片与盖玻片粘合紧密，避免蒸发，然后很快将凹玻片翻转，使盖片向上；（5）置于显微镜下观察。四、实验步骤二、悬滴标本制作五、实验报告一、试述油镜的使用方法；二、描述所观察的细菌菌苔形态；三、绘图表示细菌的形态。五、实验报告一、试述油镜的使用方法；六、思考题一、怎样观察细菌形态？细菌未染色时，用油

镜观察有何困难？二、试述无菌操作的步骤和要领。六、思考题一、怎样观察细菌形态？细菌未染色时，用油本次实验课结束

请确保油镜头擦拭干净！

请值日生留下值日

下次课再见！本次实验课结束

请确保油镜头擦拭干净！

请值日生留下值日

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料．如伊红美蓝、伊红天青等。

实验二

细菌染色法及微生物的观察

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于辨别细菌细胞的构造。

简单染色法简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于荚膜染色法的原理是因为荚膜和染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90％以上，固染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。

荚膜染色法荚膜染色法的原理是因为荚膜和染料间的亲和力弱，不易着色，芽胞染色法:

细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状)。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。芽胞染色法:细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着细菌的鞭毛极细，直径一般为10~20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多．但其基本原理相同，即在染色前充用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上．使鞭毛直径加粗。然后再进行染色。鞭毛染色法细菌的鞭毛极细，直径一般为10~20nm，只有用电子显微革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G－)和革兰氏阴性菌(G＋)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G－菌和G＋菌。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

革兰氏染色法革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G－)和革一、实验目的和内容目的：巩固无菌操作技求，掌握细菌及其结

构的染色技术。内容：1、学习细菌单染色操作技术。

2、学习革兰氏染色技术。3、学习细菌的荚膜、芽孢及鞭毛染色

方法。

一、实验目的和内容

二、实验材料和用具

1、单染色法：（1）菌种：细菌：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌放线菌：真菌：酵母霉菌：黑曲霉、黑根霉菌（2）染料：吕氏美蓝染色液、齐氏石炭酸复红染色液、乳酸石碳酸棉兰、香柏油、二甲苯、无菌水（3）显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。

二、实验材料和用具2、荚膜染色：

(1)菌种：褐球固氮菌

(2)硼酸钠美兰染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液；绘图墨水(3)载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜。2、荚膜染色：3、芽孢染色：(1)菌种：培养24~36小时的枯草芽孢杆菌(2)染料：

孔雀绿染色液、蕃红染色液(3)载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、镊子、显微镜(4)香柏油、二甲苯、擦镜纸。3、芽孢染色：4、鞭毛染色：(1)菌种：

培养19-24小时的大肠杆菌；普通变形菌(2)染料：

新配制的费氏及康氏鞭毛染色液A和B。(3)无菌水、无菌空试管、凹玻片。盖玻片、洁净载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜4、鞭毛染色：

5、革兰氏染色：（1）菌种：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌（E.coli）菌液，待测菌菌液l~2种；（2）染料：革兰氏染色试剂盒(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、（3）香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。5、革兰氏染色：三、操作步骤

1、单染色法

（1）涂片

在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水（图4-10a），用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2。

（2）干燥

将涂片于室温中自然干燥。

（3）固定

手执载片—端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2~3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图4-10c)。三、操作步骤

（4）染色

将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min(图4-10d)。

（5）水洗

倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图4-10e)。

（6）干燥

自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体(图4-10f)。（7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。（4）染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，

图4－10单染色方法

图4（二）荚膜染色法1．石炭酸复红染色(1)取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(荚膜是多糖类物质，不可用火焰烘干)。(2)滴入1~2滴95％乙醇固定(不可加热固定)。(3)加石炭酸复红染液染色1～2min，水洗，自然干燥。(4)在载玻片一端加一滴墨汁，另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，在以匀速推向另一端，涂成均匀的一薄层，自然干燥。(5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。

（二）荚膜染色法2．荚膜背景染色法(1)先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。(2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。(3)干燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗．在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。

2．荚膜背景染色法（三）

革兰氏染色法

1、制片

（1）

涂菌

用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。

（2）干燥

于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。

（3）固定

目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片面向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。（三）革兰氏染色法2、染色（1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。（2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗：（3）滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。（4）复染

滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。（5）用滤纸吸干，油镜镜检。

2、染色3、结果革兰氏阳性菌染成篮紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。4、检测未知菌用以上方法对未知面进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。

3、结果（四）鞭毛染色法

1．方法一：（1）用接种环由培养18～20h的平板上取大肠杆菌菌体少许，用菌滴制片法检查细菌的运动性。如果菌体的运动性很强，则可作鞭毛染色。（2）用3~4mL无菌水，将培养体洗下，移入另一无菌试管中，适温培养10min，再检查运动性。（四）鞭毛染色法（3）用无菌吸管由悬液上部取一小滴，置于一清洁载玻片的一端，将玻片倾斜。使菌液由一端流向另外一端。于是在玻片上做成2～3条菌液带。待水膜自然干燥（切勿用火焰烘）。（4）用刚刚过滤的鞭毛染色液A染色5min(不要加热)。（5）倾去A液，加鞭毛染色液B染色10min。用蒸馏水轻轻冲洗，晾干。（6）用齐氏石炭酸复红染色2～3min。轻轻冲洗，晾干(不能用吸水纸吸干)。（7）先用低倍镜，再用高倍镜，最后用油镜检查。

（3）用无菌吸管由悬液上部取一小滴，置于一清洁载玻片的一端，2．方法二：（1）制涂片：先加少量无菌蒸馏水于凹载玻片的凹窝中．再从培养10h左右的斜面菌苔上取菌一环，轻放在凹窝水面上(不要搅动)，放30度温箱静置5～10min．取出，从凹窝水面上轻轻取菌液一环，轻放在干净的载玻片上(不要涂抹)，放回温箱，让其自然干燥(不要加热固定)。（2）染色：在自然干燥的涂片上，滴加含石炭酸的鞭毛染色液一滴，染色5min，用水轻轻冲洗，让其自然干燥。（3）镜检：用油镜观察。

2．方法二：五）芽孢染色法1．方法一：(1)取37℃培养18~24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。(2)于载片上滴人3~5滴5％孔雀绿水溶液。(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(5)用0.5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)复染1min，水洗。(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。五）芽孢染色法2．方法二：(1)加1～2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环培养18～24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分均匀打散，制成浓稠的菌液。

(2)加5％孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中．用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

(3)将此试管浸干沸水浴(烧杯)中，加热15～20min。(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片经过微火3次固定。(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。(6)加番红水溶液，染2～3min后，倾去染液，不用水洗。(7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。

2．方法二：四、注意事项1．载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌过厚。2．在染色过程中，不可使染液干涸。3．在革兰氏染色过程中脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌，另外，老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。3．

荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。4．

鞭毛染色液最好当日配置，次日使用则鞭毛染色浅，观察效果差。染色时一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景不清晰。5．供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。

四、注意事项五、实验报告(一)绘图1．单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。2．大肠杆菌革兰氏染色视野图。3．金黄色葡萄球菌革兰氏染色视野图。4．褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。4．绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况。6．枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。(二)单染色法操作要点。(三)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。

五、实验报告六、问题和思考1．涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题?2．制备染色装片时应注意哪些事项，为什么?制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？3．什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么?4．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。5．组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?6．鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代，并且要采用幼龄菌种?7．根据你的实验体会，哪些因素影响鞭毛染色的效果?如何控制?六、问题和思考一、实验目标与基本要求学习并掌握酵母菌观察方法。二、实验内容制作酵母菌常规涂片，染色并用油镜观察菌体。实验三酵母菌的形态观察

一、实验目标与基本要求实验三酵母菌的形态观察个体形态与出芽生殖用水浸片法观察，根据酵母菌是否染上兰色可以区别细胞的死活（这里的利用美蓝是一种弱的氧化剂，还原后变为无色的特性，活细胞具有还原力，故将其还原变为无色）。酵母菌的芽殖过程1．泡；2．小管；3．核；4．液泡

三、实验步骤：个体形态与出芽生殖酵母菌的芽殖过程1．泡；2．小管；3．核四、实验报告绘图数个酵母菌细胞，示观察到的结构。四、实验报告一、实验教学目标基本与要求

1、明确培养基的配制原理。

2、掌握配制培养基的一般方法和步骤。二、实验内容

1、介绍培养基的配制原理和方法步骤

2、动手称量试剂、配制牛肉蛋白胨培养基等。实验四微生物培养基的制备一、实验教学目标基本与要求实验四微生物培养基的制备三、实验材料每组准备：试管：14个(8个制备斜面培养基)(6个各装9mL纯净水高压)三角烧瓶：4个(1个装90mL纯净水高压,其它三个分别装三种培养基高压)平板：9个(营养琼脂，高氏一号，马丁氏培养基平板各三个)

吸管：5支(顶部塞好棉花，用牛皮纸包好高压)三角涂棒：3支(牛皮纸包好高压)三、实验材料每组准备：培养基配方：四、实验内容牛肉膏蛋白胨培养基（营养琼脂）：培养细菌用取样品3.8g加蒸馏水至100mL加热溶解，分装斜面，剩下的高压倒平板。（共配液体100mL）倒3个平板（每个平板倒20mL，共60mL）剩下的制备斜面培养基（每管5mL）。培养基配方：四、实验内容牛肉膏蛋白胨培养基（营养琼脂）：培高氏一号平板：培养放线菌

取样品3.53g

加蒸馏水至100mL加热溶解，分装斜面，剩下的高压倒平板。（共配液体100mL）倒3个平板（每个平板倒20mL，共60mL）剩下的制备斜面培养基（每管5mL）。高氏一号平板：培养放线菌马丁氏培养基：培养霉菌用取样品4.17g

加蒸馏水至100mL加热溶解，分装斜面，剩下的高压倒平板。（共配液体100ml）倒3个平板（每个平板倒20mL，共60mL）剩下的制备斜面培养基（每管5mL）。马丁氏培养基：培养霉菌用四、实验内容（一）、培养基的配制：同学们先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。

操作图示：四、实验内容（一）、培养基的配制：

1.称量

按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。2.配调

向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。称量--配置--调节pH值--过滤--分装--灭菌

1.称量

按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。Tips：如是配制固体培养基，在琼脂的熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。Tips：3.调节pH值

培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1MHcl和1MNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。（我们使用的是合成的干粉培养基，无需调ph）

4.过滤

用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。（合成干粉培养基无需过滤）

3.调节pH值

培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸5.分装

将制好的培养基分装入试管内、平板或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为下面几方面：

（1）斜面：装量为管长的1/4-1/5（8mL）。

（2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管长的1/3。

（3）三角瓶：装量不超过容积1/2。5.分装

将制好的培养基分装入试管内、平板或三角瓶内6.灭菌

塞棉塞，包扎，灭菌。

高压蒸汽灭菌法：是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100度的蒸汽温度（一般采用121℃20min灭菌）。6.灭菌

塞棉塞，包扎，灭菌。

高压蒸汽灭菌法：是在3．注意事项：

本实验使用调配好的“干燥培养基”，这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法，真空干燥法，低温干燥法或蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉；或将培养基内的各种固形成分，经适当处理，充分混匀，便成干燥粉末而成。使用时只要按比例加入一定量的水，经溶解，无需调pH，分装，高压蒸汽灭菌，即可使用。“干燥培养基”成品很容易吸潮，在称量时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再取另一种药品。瓶盖也不要盖错。在烧杯融化琼脂的过程中，人要在电炉旁看着，以免培养基因沸腾而溢出烧杯。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。注意带上棉纱手套防止烫伤。分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾污棉塞而引起污染。四、实验内容3．注意事项：四、实验内容（二）培养基灭菌

培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸，便可灭菌。灭菌的时间和温度按各培养基规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。培养基经灭菌后，可放在37恒温箱培养24小时，无菌者方可使用。在实验室里用得最多的加热灭菌法是高压蒸汽灭菌和干热灭菌。一般培养基和灭菌水等用高压蒸汽灭菌，而玻璃器皿常用干热灭菌。蒸汽灭菌为105-121℃，15-20分钟，干热灭菌为160-170℃，1-2小时。目的都是使细菌体内蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时湿热穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。四、实验内容（二）培养基灭菌四、实验内容（三）包扎1．培养皿：以牛皮纸包紧，一般以6套做一包，待灭菌。2．吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60º角，并将右端多余的报纸打一小结。3．三角涂棒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端，与报纸约呈45º角，并将右端多余的报纸打一小结。四、实验内容（三）包扎四、实验内容四、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。五、问题和思考

l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?四、实验报告实验六消毒与灭菌一、实验教学目标与基本要求了解消毒和灭菌的原理，掌握各种灭菌方法的操作步骤。

二、实验内容：

1．干热灭菌法

2．高压蒸汽灭菌

3．紫外线灭菌法实验六消毒与灭菌一、实验教学目标与基本要求三、实验步骤（一）干热灭菌法1、原理利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。所需温度(160-170℃)，时间长(1-2h)。注：干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

2、步骤恒温降温开箱取物升温装入待灭菌物品三、实验步骤恒温降温开箱取物升温装入待灭菌物品（二）高压蒸汽灭菌

1、原理利用加热一个密闭的加压灭菌锅，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。一般培养基用0.1Mpa，121.5℃,15～30min2、步骤加水装待灭菌物品加盖加热灭菌时间到后断电源压力降为零开箱取物（二）高压蒸汽灭菌加水装待灭加盖加热灭菌时间到后压力降为零（三）紫外线灭菌法1、原理

紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧或使水氧化生成H2O2。O3和H2O2均有杀菌作用。

适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。（三）紫外线灭菌法2、步骤

1）单用紫外灯在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。

2）化学消毒剂与紫外线照射结合使用在无菌室内，先喷洒化学消毒剂溶液，再用紫外线灯照射15imn2、步骤四、实验报告记录无菌检查结果五、问题和思考

1.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？

2.过滤除菌应注意哪些问题?四、实验报告实验七微生物接种技术一、教学目标与基本要求：掌握各种微生物接种的基本操作技术。

二、实验内容

1．斜面接种

2．液体接种

3．穿刺接种

4．平板接种实验七微生物接种技术三、实验步骤将有菌的材料或纯粹的菌种转移到另一无菌的培养基上，这个过程就称为接种。常用的几种方法如下：斜面接种液体接种穿刺接种平板接种三、实验步骤1.斜面接种：从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。此法用于好气性微生物的接种。左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面划曲线或直线。1.斜面接种：斜面接种示意图斜面接种示意图2.液体接种：由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。微生物实验(第三节课)课件3.穿刺接种：用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。4.平板接种：将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：

3.穿刺接种：1)斜面接平板a.划线法：见平板划线分离法。b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）即可。

2)平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。

1)斜面接平板实验五微生物生长，数量及大小的检测

实验五微生物生长，数量及大小的检测一、目的要求

学会用血球计数器测定酵母菌细胞数学习和掌握用测微尺测量微生物细胞大小的方法一、目的要求学会用血球计数器测定酵母菌细胞数二、基本原理

微生物个体生长的时间较短，很快进入分裂繁殖阶段，个体生长难以测定。它们的生长一般以繁殖即群体生长作为微生物生长的指标。群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定数目的方法有显微镜直接计数法、平板计数法、光电比浊法等。显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具即测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。二、基本原理微生物个体生长的时间较短，很快进入分三、实验材料酵母菌液显微镜、血球计数器、目镜测微尺、镜台测微尺3.载玻片、盖玻片、接种环、胶头吸管等三、实验材料酵母菌液

图5-1Thoma血球计数板

A.正面图B.纵切面图

1.血球计数板2.盖玻片3.计数室图5-1Thoma血球计数板图5-2计数室的刻度形式16小格×25大格计数室图5-2计数室的刻度形式93四、实验内容一.酵母菌数量的检测1.显微镜直接计数法（每人1片）注意事项:

取样时先要摇匀菌液;加样时计数室不可有气泡产生。B.调节显微镜光线的强弱适当。1mL菌液中的总菌数=A/5*25*104*BA:为五个方格中的总菌数B:菌液的稀释倍数四、实验内容一.酵母菌数量的检测四、实验内容二.酵母菌大小的检测注意事项：观察时光线不宜过强,否则难以找到镜台测微尺的刻度;换高倍镜和油镜校正时,务必十分小心,防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。1.测微尺的校正（标定）：两重合线间镜台测微尺格数Ⅹ10目镜测微尺每格长度(μm)=

两重合线间目镜测微尺格数2．酵母菌大小的测定：利用制好的血球器浸片，用高倍镜测出宽和长各占目镜测微尺的格数，再将测到的格数乘以目镜测微尺（用高倍镜时标定的）每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。四、实验内容二.酵母菌大小的检测五、实验报告1、结果记录：(1)将计数结果记录下表。A表示五个中方格中的总菌数。B稀释倍数为102。注:1mL菌液总数=A/5×25×104×B五、实验报告1、结果记录：注:1mL菌液总数=A/5×25五、实验报告（2）将目镜测微尺校正结果填入下表:

接目镜放大倍数：-10×-五、实验报告（2）将目镜测微尺校正结果填入下表:五、实验报告(3)将酵母菌大小测定结果填入下表：五、实验报告(3)将酵母菌大小测定结果填入下表：五、实验报告2.思考题：根据你的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？某单位要求知道一种干酵母粉的活菌存活率，请设计1-2种可行的检测方法。比较平板菌落计算法和显微镜下直接计算法的优缺点几应用。在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？为什么更换不同放大倍率目镜和物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？五、实验报告2.思考题：五、实验报告思考题：培养基应具备哪些条件?

在培养基配制操作过程中应注意什么问题?为什么?

培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?

高压蒸汽灭菌的关键为什么是高温而不是高压?高压蒸汽灭菌前为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽?灭菌完毕后什么情况下才可以开锅盖取出灭菌物品?

玻璃器皿为什么在灭菌前要先行干燥?

对含糖(如含葡萄糖或乳糖等)培养基进行高压蒸汽灭菌时，应采用多大压力，多长时间灭菌为宜?

加热蒸汽灭菌为什么比干热灭菌所要求的温度低、时间短？干热灭菌完毕后，在什么情况下才可开箱取物？为什么？五、实验报告思考题：四、问题和思考1.稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50℃左右，才倒入装有菌液的培养皿内？2.接种时，为何要尽量使试管平放？微生物实验(第三节课)课件实验九微生物的分离纯化技术

实验九微生物的分离纯化技术一、目的要求

学习从混杂的微生物群体中分离与纯化微生物菌种的方法。综合练习微生物学实验的各种无菌操作技术一、目的要求学习从混杂的微生物群体中分离与纯化微生物二、基本原理

自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。微生物的分离、纯化技术是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。微生物的平板分离纯化技术自1880年被发明以来以有100多年的历史，该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动物细胞培养等方面的应用作出了巨大的贡献。平板稀释涂布、平板稀释混合、平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。分离纯化技术其实是进行平板接种，即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上，然后培养。平板接种的目的是观察菌落形态，分离纯化菌种，活菌计数及在平板上进行各种实验时采用的一种接种方法。本实验是利用分离纯化技术来获得三大类微生物的平板纯培养物，为下次实验微生物的形态观察提供菌落形态的部分（形态观察主要包括群体形态（菌落形态）和个体形态观察两个方面。

二、基本原理自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取三、实验材料2、平板的制备：

将融化的琼脂培养基,冷却至50℃左右(以手背能忍受的温度为准)温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于45℃时，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应在酒精灯火焰旁进行，右手掌心握住三角瓶的底部，左手打开三角瓶棉塞，以右手的无名指和末指夹持瓶塞，灼烧瓶口。左手拿培养皿，用左手的大拇子将皿盖掀开一缝，至瓶口刚好伸入，向皿内注入培养基（约15~20mL,厚度约0.5mL左右），迅速盖好皿盖。左手持培养皿稍加旋转摇动，使培养基均匀分布于整个培养皿底部，然后平置于桌面水平位置,待凝后即为平板。三、实验材料2、平板的制备：四、实验内容1.平板混合分离法：大肠杆菌，枯草杆菌，单球菌（3皿）

将菌液分离样品摇匀，用无菌移液管取1ml的菌液移至无菌培养皿中，然后将融化，凉至50℃左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15ml，摇匀，凝固，制成平板。图3-1混合倒平板操作法示意图四、实验内容1.平板混合分离法：大肠杆菌，枯草杆菌，单球菌四、实验内容2.平板划线分离法：（3皿）

将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙（约30℃）伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30-40℃，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。

图3-2平板划线分离操作法示意图四、实验内容2.平板划线分离法：（3皿）图3-2平板划图3-3平板划线菌落分离效果图图3-3平板划线菌落分离效果图3.平板涂布分离法(3皿)：土壤中的微生物

将经过不同稀释的菌液分离样品摇匀，将0.1ml菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置。右手拿无菌三角玻扒在平板培养基表面上,将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直来回推动,平板内边缘处可改变方向用三角玻扒再涂布几次。四、实验内容图3-4涂布平板操作法示意图四、实验内容图3-4涂布平板操作法示意图四、实验内容5.生物的培养技术：培养箱恒温培养法

将牛肉膏蛋白胨培养基于37℃恒温培养箱培养1-2d，平板倒置培养。高氏一号培养基和马丁氏培养基于28℃恒温培养箱培养2-3d，平板倒置培养。四、实验内容5.生物的培养技术：培养箱恒温培养法五、实验报告1、观察记录实验结果：土壤中微生物的菌落特征

注:菌落特征描写方法参考如下：大小：大，中,小,针尖状形态：圆形，不规则等干湿情况：干燥，湿润，粘稠高度：扁平，隆起，凹下透明度：透明度，半透明，不透明颜色：黄色，金黄色，灰色，乳白色，红色，粉红色，黑色等边缘：整齐，不整齐五、实验报告1、观察记录实验结果：土壤中微生物的菌落特征2、思考题:如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤.你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落?如果不是,请分析其原因。在恒温培养箱中培养微生物时为何培养皿需倒置?五、实验报告2、思考题:五、实验报告实验六微生物的生理生化反应

实验六微生物的生理生化反应一、目的要求

了解不同细菌对含氮及含碳化合物的分解和利用情况进一步掌握微生物的接种方法一、目的要求了解不同细菌对含氮及含碳化合物的分解和二、基本原理

微生物代谢与其他生物代谢有着许多相似之处，也有不同之处。微生物代谢重要特征之一，就是代谢类型的多样性，因此使得微生物在自然界的物质循环中起着重要的作用，同时也为人类开发利用微生物资源提供更多的机会与途径。人们在微生物的分类鉴定工作中，常利用其生理生化反应作用作为重要依据。本实验分别安排微生物对生物大分子的分解利用（淀粉水解实验水解试验、明胶液化试验），对含碳化合物的分解利用（糖发酵试验）以及对含氮化化合物的分解利用（吲哚试验），让同学们对微生物的代谢类型多样性有一个初步和感性的了解，同时学习利用微生物形态、结构以及生化反应的特征对某些细菌进行初步的分类。本实验进一步学习平板接种法、穿刺接种法、液体接种法。二、基本原理微生物代谢与其他生物代谢有着许多相三、实验材料

1．培养基：淀粉水解培养基：2皿明胶液化培养基：2支糖类发酵培养基：4支蛋白胨水培养基：2支2.接种用具：接种环（针、钩），酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，废物杯，一次性口罩，纸巾，油性笔。3.实验菌种：枯草杆菌、大肠杆菌、单球菌4.配置培养基的工具：1套三、实验材料1．培养基：四、实验内容四、实验内容图6-1糖类发酵试验

图6-1糖类发酵试验四、实验内容操作步骤：1.淀粉水解试验：（2皿）（1）翻转平板使底皿背面向上，用油性笔在其背面玻璃上画上三个圆圈。（2）用接种环在圆圈中间以点植的方式接上菌种。一皿接枯草杆菌，另一皿接大肠杆菌。（3）将接完种的平板倒置于37℃恒温培养箱，培养24h。（4）观察结果时，可打开皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻旋转，是碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外酶活力的高低。（以“+”、“—”表示有无透明圈）四、实验内容操作步骤：四、实验内容（1）以穿刺接种法分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于明胶培养基中。（2）接种后置于20℃恒温培养箱，培养2-5d。（3）观察结果时，注意培养基有无液化现象。（以“+”、“—”表示有无液化现象）

注意：如果细菌在20℃时不能生长，则必须培养在所需的最适温度下，观察结果时需将试管从恒温箱里取出，置于冰浴中，才能观察液化程度。2.明胶液化试验：（2支）四、实验内容2.明胶液化试验：（2支）四、实验内容（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于同种糖类培养基中，以作比较。（2）接种后置于37℃恒温培养箱，培养24h。（3）观察结果时，看各管颜色变化及杜氏小管有无气泡。产酸产气用“⊕”表示；只产酸不产气用“+”表示；不产酸也不产气用“—”表示。3.糖类发酵试验：（4支）四、实验内容3.糖类发酵试验：（4支）四、实验内容（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于蛋白胨水培养基中。（2）接种后置于37℃恒温培养箱，培养24h。（3）观察结果时，在培养液中加入乙醚约1毫升（使呈明显的乙醚层）。充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚试剂10滴。如吲哚存在，则乙醚层呈玫瑰红色（注意：加入吲哚试剂后，不可再摇动，否则红色不明显）。以“+”、“—”表示有无红色的玫瑰吲哚。4.吲哚试验：（2支）四、实验内容4.吲哚试验：（2支）四、实验内容

肉汤培养基：100mL，装在250mL三角瓶（加入1.5%琼脂）

乳糖胆盐发酵培养基：100mL分装10支大试管(加杜氏发酵管)，10mL/支

生理盐水：250mL,其中225mL装在500mL三角瓶(加适量玻珠)；18mL分装2支大试管，9mL/支，剩余的丢弃

吸管：2支10mL，5支1mL

培养皿：6皿准备实验七的培养基和玻璃器皿：四、实验内容准备实验七的培养基和玻璃器皿：五、实验报告1.细菌对各种生理生化试验反应的原理：五、实验报告1.细菌对各种生理生化试验反应的原理：五、实验报告2．细菌对各种生理生化试验反应的结果：五、实验报告2．细菌对各种生理生化试验反应的结果：五、实验报告（1）淀粉、明胶等生物大分子物质能否不经分解而直接被细菌吸收？为什么？（2）接种后的明胶试管可以置于37℃恒温培养箱箱中培养，在培养后你必须做什么才能证明水解的存在？（3）假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？（4）解释在细菌培养中吲哚试验的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？

2.思考题五、实验报告（1）淀粉、明胶等生物大分子物质能否不经分解而直实验七水和食品中微生物的检测

实验七水和食品中微生物的检测一、目的要求了解食品卫生微生物学的重要性及其原理学会水和食品中细菌菌落总数的测定方法和平板活菌计数法3.学会水和食品中大肠菌群数的测定方法一、目的要求了解食品卫生微生物学的重要性及其原理二、基本原理

水和食品中的微生物数量主要考虑到的是细菌特别是病原菌的数量。这些细菌主要来源于土壤、垃圾、粪便等，尤其是后者。若饮用水、酿造水和食品中发现有大肠群细菌，就有可能存在肠道病原菌，可能会危害人们的健康，因此，进行食品卫生的微生物学检验是十分重要的。一般情况下，主要是测定水和食品中细菌菌落总数和大肠菌群数。细菌菌落总数是指水中或食品检样经处理后，在一定条件培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数，其主要作为判定水和食品被污染程度的标志。大肠菌群是肠道最普遍存在和数量最多的一群细菌、常将其作为人畜粪便污染的标志。水和食品中大肠菌群数是以每100mL（g）检样中大肠菌群最可能数（MPN）表示的。二、基本原理水和食品中的微生物数量主要考虑到的是三、实验材料水样的采取：池水，河水或湖水应距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好,再从水中取出,最好立即检查,否则需放入冰箱保存,时间不要超过六小时。2.其他实验材料参考实验讲义P47三、实验材料水样的采取：四、实验内容（一）、食品中细菌菌落总数和大肠菌群数的检测食品中细菌总数：用平板菌落计数法测定（即菌种分离纯化技术的平板混合法）平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品的一个单细胞.统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以,长成的一个单菌落也可能来自样品中2-3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果,现在已倾向使用菌落形成的单位(colony-formingunits,cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。四、实验内容（一）、食品中细菌菌落总数和大肠菌群数的检测四、实验内容2．食品中大肠菌群数:用多管发酵法测定.包括初(步)发酵试验,平板分离和复发酵试验三个部分(略)

发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基,并倒置一杜氏发酵小管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖,而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气.为便于观察细菌产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂,细菌产酸后,培养基即由原来的紫色变为黄色.溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。

四、实验内容2．食品中大肠菌群数:用多管发酵法测定.包括初图7-1食品检样稀释及倾注平板示意图图7-1食品检样稀释及倾注平板示意图四、实验内容操作图示：四、实验内容操作图示：四、实验内容（二）、准备下次实验培养基（P30-31）(1)肉汤琼脂培养基：100mL，装在250mL三角瓶(加2%琼脂)(2)肉汤上层培养基：50mL，分装8小试管，每支5mL（1/4试管）（加0.8%琼脂）(3)蛋白胨水：30mL分装5支小试管,每支4.5mL(4)吸管：1mL6支(5)培养皿：12皿，包成两包，6个/包（三）、观察上次实验结果记录四、实验内容（二）、准备下次实验培养基（P30-31）五、实验报告1．食品微生物学检测结果的报告(格式)：

微生物学检测结果的报告送检单位:×××有限公司送检样品:×××检测项目:细菌总数和大肠菌群数检测方法:(1)食品中细菌总数:用平板菌落计数法测定.(根据国标GB4789．2-94)(2)食品中大肠菌群数:用多管发酵法测定.(根据国标GB4789．3-94)检测结果:(1)食品中细菌总数检测结果:(2)食品中大肠菌群数检测结果:阳性结果记“+”;阴性结果记“_”。一支管一个记号。结论:

检测单位:华工生物工程××××级检测人(报告人):×××

日期:200×-××-××五、实验报告1．食品微生物学检测结果的报告(格式)：五、实验报告2.思考题为什么融化后培养基要冷却至50℃左右才能倒平板？要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？试比较平板菌落计数法和显微镜直接计数法的优缺点及应用。当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题在哪里？用倾注平板法和涂布平板法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（48小时）后观察结果？大肠菌群的定义是什么？大肠菌群中的细菌种类，一般并非是病原菌，为什么要选用大肠菌群作为食品被污染的指标？五、实验报告2.思考题实验八噬菌体效价的测定

实验八噬菌体效价的测定一、目的要求

学会噬菌体的检查及其效价测定方法学会观察识别噬菌斑一、目的要求学会噬菌体的检查及其效价测定方法二、基本原理

噬菌体的效价就是1mL培养液中所含活噬菌体的数量。效加测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体长生肉眼可见的噬菌斑。因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实效率难以接近100%（一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染），所以为了准确地表达病毒菌悬液的浓度（效价）一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位（plague-formingunits，简写成pfu）二、基本原理噬菌体的效价就是1mL培养液中所三、实验材料菌种（1）噬菌体待检液的制备：参照实验讲义P35（2）指示菌液的制备：参照实验讲义P35培养基及玻璃器皿

已在实验七预先准备其它器材

水浴锅、电炉、酒精灯、接种环等三、实验材料菌种四、实验内容图8-1平板点滴法噬检操作过程四、实验内容图8-1平板点滴法噬检操作过程四、实验内容图8-2单层琼脂法噬检操作过程四、实验内容图8-2单层琼脂法噬检操作过程四、实验内容图8-3双层琼脂法测定噬菌体效价操作过程四、实验内容图8-3双层琼脂法测定噬菌体效价操作过程四、实验内容1、噬菌体的效价双层法：

(每组做3个稀释度，每个稀释度做2皿；另加对照1皿，共7皿)注意事项：噬菌体对温度极其敏感，一般噬菌体60℃下5分钟绝大部分失活.因此加入上层培养基的温度要严格保持50℃以下，为防止琼脂凝固,此步操作要快,均匀铺满，不能出气泡。为保证获得单一，彼此分离的噬菌斑，培养皿盖上和培养基表面不得有凝结水滴。正置培养，不能倒置。每皿噬菌体数量不能太多，维持100-300个为宜,否则噬菌斑不能分开而连成一片。同组同学分工合作协调好，一位稀释噬菌体同时移噬菌体液以及移指示菌液；一位倒制底层平板同时拿上层试管接好移液。四、实验内容1、噬菌体的效价四、实验内容噬菌体效价测定操作图示:四、实验内容噬菌体效价测定操作图示:四、实验内容2、准备下次实验配培养基和玻璃器皿(每实验台)1）完全培养基2）再生培养基3）生理盐水4）缓冲液

A.0.1mol/L,PH6.0磷酸缓冲液.B.高渗缓冲液,于上述缓冲液中加入0.8mol/L甘露醇5）原生质体稳定液(SMM)5mol/L蔗糖,20mol/LMgCl20.02mol/L顺丁烯二酸,调PH6.56）促融合剂

40%聚乙二醇(PEG-4000)SMM溶液

7）玻璃器皿包扎：

A．培养皿：18皿，6皿/包，包成3包

B．小试管：20支

C．吸嘴：1盒（约60个）3、观察上次实验结果四、实验内容2、准备下次实验配培养基和玻璃器皿(每实验台)五、实验报告1、记录双层平板上的噬菌斑数目，计算噬菌体效价注:噬菌体校价=pfu数×稀释倍数×10五、实验报告1、记录双层平板上的噬菌斑数目，计算噬菌体效价注五、实验报告2、思考题：

测定噬菌体的效价，操作时要注意些什么才能测定准确？计算噬菌体效价时，选择30-300个pfu的平板计数较好，为什么？如果在你的测定平板上，偶尔出现其他细菌的菌落，是否影响你的噬菌体效价测定？五、实验报告2、思考题：微生物学实验微生物学实验微生物实验的意义、研究进展和实验内容一、研究内容研究微生物的形态、结构、生理生化遗传变异、微生物与其他生物、与自然界之间的关系

机理研究：微生物适应环境的机制鞭毛运动的机理等是生化和分子生物学研究的重要内容

微生物实验的意义、研究进展和实验内容一、研究内容2.微生物与实际应用微生物与发酵工程微生物与环境工程微生物与农业微生物与医学领域微生物与食品工业2.微生物与实际应用微生物与发酵工程二、微生物学研究进展微生物基因组学研究（MicrobialGenomics）不可培养微生物（UnculturedMicroorganisms）DNA芯片（DNAChip）三域学说（Bacteria,Archae,Eucaryote）二、微生物学研究进展三、微生物学与Nobel奖

到目前为止，几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖都与微生物学有关参考：沈萍教授《微生物学》绪论部分

Nobel获奖者全书三、微生物学与Nobel奖四、如何进行微生物学实验

严肃认真科学态度分析问题搞清原理四、如何进行微生物学实验五、微生物实验安排与考核基础实验：4次大实验设计实验方案实验操作总结汇报五、微生物实验安排与考核基础实验：4次大实验课堂纪律严格遵守实验室规章制度严肃课堂纪律不允许无故旷课、早退（1次）迟到（3次）工作服课堂纪律严格遵守实验室规章制度实验室安全和卫生安全实验室严禁吸烟。注意用水、防电和防火正确使用化学试剂和仪器卫生每次实验需留下6位同学值日，协助保持实验室清洁实验室安全和卫生安全卫生实验一实验室环境和人体体表微生物的检测实验目的实验原理实验材料实验步骤实验结果思考题实验一实验室环境和人体体表微生物的检测实验目的一、实验目的通过实验验证在实验室内的空气、器、物和人体表面上存在着微生物。观察不同微生物的菌落形态特征。比较不同取样处微生物的类型和数量。学习从自然环境中采集微生物的方法，了解并掌握无菌操作技术。一、实验目的通过实验验证在实验室内的空气、器、物和人体表面上二、实验原理空气中的微生物菌体和霉菌孢子→无处不在接种于含有丰富营养，不带有任何其它微生物的琼脂固体培养基上，在适宜条件下，微生物吸收各种营养，可形成肉眼可见的群体——菌落。不同微生物形成的菌落差异很大。二、实验原理空气中的微生物菌体和霉菌孢子→无处不在三、实验材料培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂平板用具：接种环、酒精灯、无菌水、灭菌棉签、试管架、记号笔、废物缸、吸水纸等。三、实验材料培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂平板四、实验步骤一、平板皿底标记姓名、日期、组别、样品来

源等，字体要小。二、实验室空气及空气传播微生物的检查：（1）空气（2）口腔（3）头发四、实验步骤一、平板皿底标记姓名、日期、组别、样品来四、实验步骤三、人体体表及钱币上微生物的检查（1）无菌操作技术各