PCR反应原理及应用基础

分子生物与基础－PCR反应原理及应用基础PCR反应原理

Polymerasechainreaction（聚合酶链式反应），简称PCR。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。

DNA的复制克隆

克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。克隆也可以理解为复制、拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。

转基因

将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgenetechnology）。杂交

遗传学中经典的也是常用的实验方法。通过不同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新

组合的个体的方法。一般情况下，把通过生殖细胞相互融合而达到这一目的过程称为杂交；而把由体细胞相互融合达到这一结果的过程称为体细胞杂交。

多莉羊的克隆分为4个步骤

步骤一：从一只6岁芬兰多塞特白面母绵羊（姑且称为A）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为“供体细胞”；

步骤二：从一头苏格兰黑面母绵羊（B）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”；步骤三：利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。电

脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成“胚胎细胞”；步骤四：将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（C）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊--多莉。

换言之，多莉有3个母亲：它的“基因母亲”是芬兰多塞特白面母绵羊（A）；科学家取这头绵羊的乳腺细胞，将其细胞核移植到第二个母亲（借卵母亲）--一个剔除细胞核的苏格兰黑脸羊（B）的卵子中，使之融合、分裂、发育成胚胎；然后移植到第三头羊（C）--“代孕母亲”子宫内发育形成多莉。多莉没有父亲，它是通过无性繁殖--或者说克隆而来。

聚合酶链反应：（polymerasechainreaction,PCR）原理：1）引物的设计：合成2个与目的DNA序列两侧互补的寡核苷酸，一般长约15-25bp。

2）基本条件：引物、DNA前提物质、含有一定离子（Mg）的反应体系、DNA聚合酶、模板。

3）三段循环：变性：93-95；复性：50-70

延伸：70-75。n个周期，2n个DNA

聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）

PCR原理PCR原理１变性PCR原理１复性PCR原理１延伸PCR原理２变性PCR原理２复性PCR原理２延伸PCR原理３变性PCR原理３复性PCR原理３延伸预变性(93-95C,2-5m)变性(93-95C,30s)复性(50-70C,30s)延伸

(75C,30-60s)总延伸

(75C,7m)(25-35)PCR的一般过程：经过30次的循环,扩增的DNA片段可达100万倍以上。凝胶电泳检测PCR产物琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是D半乳糖3，6-脱水-L半乳糖。许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在pH4．0－9．0的缓冲液中是稳定的。由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度

大于0.05时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如DNA分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为零，而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于零。

电泳图

荧光PCR反应原理

RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation水解探针（TaqmanProbe）(A)在变性之后，引物和探针退火结合到目标片段上，由于荧光报告基团和荧光淬灭基团靠的非常近，不产生荧光。(B)PCR延伸时，探针被DNATaq酶5’3’外切酶活性水解，荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，荧光报告基