动物生物技术(课件)

动物生物技术

动物科技学院

1超级细菌用抗生素使得细菌的抗药性越来越强，还指耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌，是皮肤细菌的一种英国科学家发明了一种电子鼻，它能够嗅出患者是否感染了抗药性极强的“超级细菌”，准确率很高。通常的培养基检测，需要2到3天才能确定“超级细菌”的存在。比利时布鲁塞尔大学附属医院宣布，在这家医院接受治疗的一名巴基斯坦裔比利时男子因为感染了“超级病菌”，在2010年6月底不治身亡21、绪论2、分子生物学基础3、动物基因工程基础4、动物细胞工程5、动物胚胎工程6、动物细胞核移植7、干细胞技术8、转基因动物技术9、基因敲除和RNA干涉10、动物分子标记辅助育种技术11、动物分子诊断及免疫技术12、动物营养生物技术3第一章绪论一、动物生物技术概述二、动物生物技术的发展历程及其应用三、动物生物技术发展趋势四、前景五、生物技术与中国六、面临问题41982年，国际合作及发展组织对生物技术这一名词进行了重新定义：生物技术是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术。5动物生物技术：以动物为主要研究对象，采用基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程、发酵（微生物）工程等现代生物技术对动物品质和性状进行改造的生物技术，包括获得新型生物制品或饲料添加剂，培育高产、优质、抗逆的畜禽品种，是生物技术的重要组成部分。6

基因工程(DNA重组技术)细胞工程(细胞杂交技术、细胞组织培养和体细胞杂交技术)酶工程微生物工程蛋白质工程生物技术7基因工程

应用人工方法把不同生物的遗传物质从细胞中分离出来，在体外进行切割和拼接，并将重组后的DNA导入某种宿主或个体，从而改变它们的遗传特征，育成新的品种或使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）

细胞工程：

指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培育、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特征按照人们的意愿改良和创造新品种，加速繁殖动植物个体，获得某种有用的物质的技术。8单细胞藻类培养

细胞工程一些单细胞低等植物如单细胞藻类的大规模培养成为细胞工程的重要组成部分获得蛋白质资源、营养食品、精细化工产品等等9高等植物细胞培养

细胞工程高等植物细胞具有全能性。从高等植物的幼胚、根、茎、叶、花和果实等不同器官的组织中分离的单个细胞，经过特殊培养形成愈伤组织，并可进一步诱导生成完整的植株10利用动物细胞工程生产一些药品，如红细胞生成素、抗血友病因子、组织纤溶酶原激活物（tPA）等等

细胞工程动物细胞培养11细胞融合、细胞重组、杂交瘤技术

细胞工程细胞融合是将不同种类的两种细胞经过特殊处理后放在一起，在某些促融因子作用下发生融合，形成杂种细胞细胞重组是把不同种类的细胞的部件重新组合装配，包括核的移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等杂交瘤技术是通过细胞融合产生特异杂交瘤细胞12酶工程：

指利用酶、细胞器或细胞所具有的催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一种技术。13发酵工程：

利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程中的特殊性等特点，在合适的条件下，通过现代化工程技术手段，利用微生物特定功能生产出人类所需产品的一种技术。14蛋白质工程

指在基因工程的基础上，结合蛋白质晶体学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科知识，通过基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质的一种技术15几点说明——任何一个高等动物的细胞或个体都有两套独立的遗传系统：一套是我们所熟知的由细胞核里的全部基因所组成的遗传系统，这是主要的遗传系统，负责生物体结构和细胞绝大部分的生命活动；另一套是由细胞质里的线粒体和叶绿体的DNA所组成的细胞质遗传系统，植物的细胞质遗传系统有线粒体和叶绿体两种，动物的细胞质遗传系统只有线粒体一种。

（1）多利并不是与母体完全一样的克隆16细胞质遗传系统与细胞核遗传系统有着密切的关系，但线粒体和叶绿体DNA上的基因是细胞核的染色体上所没有的，因此，细胞质遗传系统的功能不能由细胞核遗传系统来代行。由于动物的精子不为后代提供细胞质，所以高等动物的线粒体是通过母系的细胞质来遗传的，即其后代的所有线粒体都来自于母亲，与父亲无关。多利的细胞核来自芬兰母羊，但线粒体DNA分析确认了多利的线粒体来自苏格兰黑面母羊，由于线粒体在细胞生命活动中具有极其重要的功能，与许多生理活动密切相关，因此多利在生理上与其母体也会有明显的差异。17多利的诞生显示了用生物技术复制与母体完全一样的个体的可能性：如果接受体细胞的去核卵与体细胞是来自于同一个个体，则所得的复制体的细胞质与细胞核里的基因都与母体是完全一样的，这样的克隆才是母体真实的复制品。女性有可能用自身的体细胞和自身的去核卵细胞克隆出与自己的遗传组成、生理特征完全一样的个体；而克隆技术不可能用男性的体细胞复制出与原来个体在遗传上完全相同的克隆。18（2）即使是女性，也不可能复制出

与自身心理完全一样的个体心理的形成不仅与个人的遗传相关，而且与个人的社会经历和社会环境密切相关。（因此，对于人这种以心智和社会性为其本质特征的生物，用克隆技术复制不会有任何进步的意义。）19（3）通过体细胞克隆所得到的生物体与通过正常两性生殖产生的生物体在生存能力上可能会存在差别动物的体细胞的最多分裂次数是有限制的，而且每一次分裂都会在其染色体上留下年龄的标记，这种母体的真实复制品的生理年龄也可能与它的实际出生年龄会不一致，即克隆动物个体可能会出现早衰现象,对多利所进行的生理监测似乎也表明正是如此。20克隆羊的意义——理论意义：证明已分化的高等动物的体细胞仍然具有潜在的遗传表达全能性，也证明了用现代生物技术复制或克隆高等动物甚至人类的可能性。12生肖已经克隆了一半21三、趋势：基因操作技术日新月异；基因工程药物和疫苗研究和开发突飞猛进；转基因植物和动物取得重大突破；阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向；基因治疗、细胞核移植克隆、胚胎干细胞等技术取得重大研究进展；蛋白质工程；信息技术飞速发展。22最终目标:生产商业产品典型的技术密集型产业；市场迅速扩张；世界各国政府高度重视；生物制药是现代生物技术产业的支柱；现代生物技术产品不断增加；经营现代生物技术产品的公司竞争强烈；研究目标日趋集中，生产产品更加专一；医学生物技术产业化进程最快。23四、现代生物技术的前景1、对人类生活的影响更加准确的诊断、预防或治愈传染病和遗传疾病；有效地提高作物的产量，获得具有抗虫、抗真菌、抗病毒、抗逆境等优良性状的植物；开发制造可以生产化学药物、生物多聚体、氨基酸、酶类和各种食品添加剂的微生物和动物细胞；创造带有更多优良性状的家畜和其他动物；简化从环境中清除污染物和废弃物的程序。242、对人类社会及环境的影响经过基因改造的生物体是否会对其他生物体或环境造成危害；使用和开发基因工程生物是否会降低自然界的遗传多样性；人是否可以成为基因工程操作的对象；基因诊断的程序会不会侵犯个人隐私；农业生物技术是否会彻底改变传统的耕作方式；用现代生物技术生产的药物进行治疗是否会压抑同样有效的传统的治疗方式发展中国家的生物多样性资源如何得到保护。等等25中国科学家参与了人类基因组计划中1％人类基因组序列的测定，成为人类基因组计划的唯一的发展中国家；参与了新近启动的人类基因单核苷酸多态性（SNP）的国际项目，承担10％的任务；率先完成了籼稻品种基因组的框架图以及粳稻品种第四条染色体的精细序列分析。五、现代生物技术与中国262008年7月9日，一个值得注意的日子——中国国务院常务会议通过，投资240亿元人民币巨资，以期：获得一批具有重要应用价值和自主知识产权的基因培育一批抗病虫、抗逆、优质、高产、高效的重大转基因生物新品种转基因技术的发展从1983年首例转基因植物(烟草和马铃薯)培育成功开始，已经经历了技术成熟期(1983—1993年)、以首例转基因作物延熟保鲜番茄在美国批准上市为标志的产业发展期(1994—2005年)、从2006年商业化种植面积超过1亿公顷开始的战略机遇期(2006—2016年)271、农业生物技术：

⑴转基因水稻、大豆、小麦、棉花、番茄、烟草等；转基因植物种植面积排在世界第4位，转基因抗虫棉占棉花种植面积的40％，是转基因植物种植增长率最高的国家；28遗传标记遗传育种生长激素生产能力转基因动物生物反应器体细胞克隆基因工程疫苗动物胚胎工程动物营养（2）、动物生物技术动物基因工程育种29优点：1、产量高；

2、质量好；生物活性最高

3、纯化工艺相对简单；

4、生产成本低。30获得供器官移植的纯种猪需要：

去掉猪抗原性

移入人抗凝血因子

近交20代约需20年克隆技术使纯种猪培育时间大为缩短。31转基因动物研究还存在不少技术问题：1、基因的内在作用了解尚不够深刻，难以构建具有可调控的高效表达的转化基因；2、外源DNA在动物细胞染色体上的整合机制尚不清楚；3、有效性低；4、病毒基因可能从整合点脱离，成为染色体外的独立复制成分，恢复病毒特性，从而造成细胞功能紊乱或死亡；325、动物模型与预期不符；6、检测方法限制；7、转基因动物的生产性能不尽人意；8、克隆繁殖出现基因异常比例超过40％。33胚胎工程技术：冷冻保存技术胚胎移植体外生产胚胎胚胎克隆性别鉴定34动物营养1、酶制剂纤维素分解酶、植酸酶、戊聚糖酶2、甘露寡糖（替代抗生素）3、氨基酸微量元素螯合物4、合成氨基酸（赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸）352、医药生物技术（1）基因药物：中国已成功生产了重组乙肝疫苗，人干扰素α1b(rhuIFNα1b)

、人干扰素α2a(rhuIFNα2a)、人干扰素γ(rhuIFNγ)、重组腺病毒－p53抗癌注射液、白细胞介素2（rhuIL-2）、人红细胞生成素（rhuEPO）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、链激酶（rSK）等20种药物。36（2）基因治疗实验室研究阶段临床试验和应用阶段肥胖病基因治疗、血液替器官代品开发、人基因转化的猪器官移植61％基因治疗病例为恶性肿瘤，24％为艾滋病37六、面临的问题：创新能力不足而造成的过多的仿制；研究和开发投入严重不足；生物技术开发与产业化的机制不很完善；低水平的重复；专业和管理顶尖人才紧缺。38第二章

动物生物技术的分子生物学基础39一、遗传信息传递的方向―――中心法则蛋白质的生物活性氨基酸顺序特定的三维结构的完整性40遗传信息从基因转变成具有生物活性的功能蛋白质是通过两种“密码”介导：遗传密码，通过遗传密码将mRNA多核苷酸顺序译成线性多肽链；折叠密码（foldingcode）,其决定存在于氨基酸顺序中一维结构信息向蛋白质特定的三维结构的转变。RNA多肽链蛋白质41二、DNA的复制1、DNA复制从特定的位点开始酵母的自主复制序列（ARS）

ATTTATPuTTTATAAATAPyAAAT2、半保留复制3、半不连续复制

4、DNA复制具有高度的忠实性DNA聚合酶的自我校正功能

5、多种酶和蛋白因子协同作用DNA复制的特点：421，复制起点43θ

复制或重新起始（denovoinitiation

）或复制叉式（replicationfork

）

双链环状DNA的复制眼可以形成一种θ结构，形状像希腊字母θ单向复制双向复制44D环复制（Displacementform

）又称置换式线粒体和叶绿体DNA的复制方式45

σ复制或滚环式复制（rollingcirclereplication）或共价延伸方式（covalenceelongation）由于复制时产生的滚环结构形状象σ，称σ复制

病毒、细菌因子，如含有单链环状DNA的φX174、G4、M1346线性DNA双链的复制单一起点、单向，如：腺病毒单一起点、双向，如：T7噬菌体多个起点、双向472、半保留复制1958年，Meselson和Stahl证明DNA半保留复制。半保留复制是遗传消息能准确传代的保证。是物质稳定性的分子基础。

StahlMeselson48

3、冈崎片段与半不连续复制（okazaki1968年）49（OriCinE.colichromosomalDNA)大肠杆菌的DNA复制♦四个9bp的重复序列

dnaA结合位点♦三个13bp的重复序列若干GATC位点50

*

转录激活*DnaA识别并结合复制起点，DnaB－DnaC六聚体与oriC形成预引发体

*

DnaG加入形成引发体（oriC引发体），合成引物RNA*引物合成后，DNApol组装到引发的RNA上，完成复制体的组装简单复制过程5152复制终止a、终止序列

E.coli有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白序列一：terEterDterA

序列二：terFterBterC

每个区域只对一个方向的复制叉起作用53b.专一性终止蛋白

E.coli中由tusgene编码通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用ter54554、DNA损伤与修复光复活切除修复重组修复SOS修复56phR471aa（一）photoreactivation（光复活）----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----可见光激活可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。57（二）切除修复（excisionrepair）即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使DNA恢复正常。这是一种比较普遍的修复机制。细胞的修复功能对于保护遗传物质DNA不受破坏有重要意义。58（三）重组修复（recombinationrepair）又称复制后修复（post-replicationrepair）受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。59（四）SOS修复允许子链DNA复制合成时越过亲链上受损伤的片段而不形成缺口旁路系统是DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error-ProneRepair）60三、原核和真核生物基因结构的特征原核基因：

1、功能相关的基因大多是以操纵子结构出现；

2、蛋白质基因通常以单拷贝的形式存在；3、编码RNA的基因通常是多拷贝的；4、位于DNA上的各种调控元件的DNA顺序是多种多样的，为基因表达调控的多样性和精确性提供了结构基础。61真核基因：1、复杂的染色体结构：着丝点、端粒，与DNA复制起点一起构成染色体不可缺少的三要素。2、DNA重复顺序重复序列的存在是真核生物DNA区别于原核生物DNA的一个重要特征。623、基因的不连续性（外显子、内含子）４、真核生物基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因组成为单一的基因簇或基因家族（genefamily）Alu序列家族；5、存在串联重复基因。63四、RNA的转录和RNA的加工发生在细胞核中，以DNA分子为模板，按照碱基互补的原则，合成一条单链的RNA即mRNA，DNA分子携带的遗传信息被转移到RNA分子中。其过程与DNA的复制基本相同。转录的起始转录的延伸转录的终止

1、RNA转录64RNA聚合酶（RNA-pol）

1、不需要引物，能发动新链，也能延长多核苷酸链

2、合成方向5‘→3’，按碱基配对原则（A-U,C-G）

3、要求有完整的DNA双链或单链为模板4、需要4种三磷酸核苷酸----ATP,GTP,UTP及CTP为反应底物5、能识别DNA链上起始点特点：转录的起始65大肠杆菌RNA聚合酶------a2bb′s

a2bb′+s=a2bb′s核心酶+s=全酶分子量功能a36512决定转录的基因b150618催化转录b′155613结合DNA模板(开链)s70263辨认起始点66真核生物的RNA聚合酶RNA聚合酶ⅠⅡⅢ别名rRNA聚合酶不均一RNA聚合酶小分子RNA聚合酶定位核仁核质核质转录产物tRNAmRNAtRNA.5srRNAα-鹅膏蕈碱的影响不敏感高度敏感中度敏感67σ因子辨认起始点RNA聚合酶全酶结合到起始点

打开双链RNA链合成开始σ因子脱落，RNA链延长转录的起始681）与转录调控有关的DNA序列－10区pribnow框（TATAAT）：RNA聚合酶的牢固结合位点；－35区Sextama框（TTGACA）：RNA聚合酶的识别位点。一般来说，对于给定的启动子，其特异性序列趋于启动子共有序列时－10与－35区之间的间距趋于17bp时，启动子的转录效率可能就高。天然启动子中这段距离多为15－20bp.69编码链AACTGTATATTA模板链TTGACATATAAT3’5’DNA转录起始点Pribnow盒子启动子35

10

+1转录区5’3’RNA转录起点与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基。●原核生物启动子结构70典型启动子的结构-35-10转录起点16-19bpTTGACATATAAT5-9bp71真核生物的启动子：①帽子位点及转录的起始位点，其碱基大多是A②TATA框：转录起始点上游－30区到－25区段，框内任何碱基的替代突变都使转录活性降低，是绝大多数真核基因正确表达所必需的

③在起始位点的上游－50、－75、－100左右都存在与基因转录起始有关的序列：－75区附近的CAAT框可能控制着转录起始的频率④增强子

⑤负控制序列72真核生物启动子的结构核心启动子（corepromoter）上游启动子元件（upstreampromoterelement，UPE）73上游启动子元件●包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等●作用：控制转录起始频率CAAT：-70--80bpGGGCGG：-80--110bp74转录的延伸在转录泡上进行7553DNA原核生物转录过程中的羽毛状现象核糖体RNARNA聚合酶76出现延宕

∞减少DNA序列中的G·C碱基对的含量∞RNA聚合酶没有校对能力，转录过程没有校对机制

∞转录的精确性必须依靠RNA聚合酶在选取互补核苷酸或拒绝非互补核苷酸的立体化学特性真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。77转录的终止

RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来，就是转录终止。强终止子－内部终止子弱终止子－需要ρ因子（rhofactor）又称为ρ依赖性终止子（Rho-dependentterminator）不依赖Rho(ρ)因子的转录终止依赖Rho(ρ)因子的转录终止78ATPA.依赖Rho因子的转录终止因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。79RNA聚合酶ρ因子附在RNA链上ρ因子RNA链形成一个发夹结构，转录停止，ρ因子利用ATP能滑行ρ因子发挥解螺旋酶活性，解开发夹和RNA-DNA依赖Rho因子的转录终止80B.非依赖Rho因子的转录终止DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。81

终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度效率82茎环结构使转录终止的机理使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。5´pppG5335RNA-pol83原核生物和真核生物初级转录产物都需经一定程度的加工才具有活性。原核生物RNA加工、真核生物RNA加工2、RNA加工84原核生物中rRNA前体的加工

甲基化作用专一核酸外切酶30S前体17StRNA25S专一核酸外切酶16SrRNAtRNA23SrRNA5S

rRNA专一核酸外切酶855pppGp…5GpppGp…pppG

ppi鸟苷酸转移酶5

m7GpppGp…甲基转移酶SAM帽子结构的生成5ppGp…磷酸酶

Pi86帽子结构功能：①能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合；②m7Gppp结构能有效地封闭mRNA5’末端，以保护mRNA免受5’核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。87

特异内切酶识别AAUAAA及随后的GUGUGUG并在其间酶切，在3‘端聚合50-200poly(A)I.协助成熟的mRNA从细胞核向细胞质转运；II.提高mRNA在细胞质中的稳定性；III.作为核糖体的识别信号，使mRNA得以有效翻译；

加尾883、RNA剪接剪接：剪接体与处于内含子5ˊ端的5ˊ剪接位点和3ˊ端的3ˊ剪接位点相互作用而完成。89剪接体：一类复杂的核糖核蛋白颗粒，由核小RNA（smallnuclearRNAs,snRNA）和各种蛋白质组成。snRNA:分子内富含尿嘧啶核苷酸，称为U1、U2、U4、U5、U6。snRNP:snRNA与特定的蛋白质结合，组成特定的核小RNA蛋白体。完整的剪接体就是通过UsnRNP之间RNA同蛋白质、RNA同RNA以及蛋白质与蛋白质相互作用组装而成。904、RNA的编辑编辑（editing）是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。91尿苷酸的缺失和添加1986.R.Benne在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸，1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。92原核生物与真核生物mRNA的特征比较

1、原核生物mRNA的特征●半衰期短●多以多顺反子的形式存在

多顺反子mRNA：编码多个蛋白质的mRNA。单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA。●5’

端无“帽子”结构，3’

端没有或只有较短的poly（A）结构。SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。

932、真核生物mRNA的特征●5’

端存在“帽子”结构●多数mRNA

3’

端具有poly（A）尾巴（组蛋白除外）●以单顺反子的形式存在“基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。94原核生物和真核生物mRNA结构的比较95五、翻译－蛋白质的生物合成1、遗传密码：UAA、UGA、UAG＋61个密码子特点：①通用性；②兼并性；摇摆假说③遗传密码使用的偏倚性：蛋白质生物合成时对兼并密码子使用的频率不同，对于一个给定的氨基酸而言，有的密码子使用频率明显高于其它密码子。→在基因的化学合成过程中，可通过选择性的使用“高频”密码，改善基因在宿主细胞中的表达水平。96④

密码子的不重叠性和阅读方向。⑤酵母、无脊椎动物、脊椎动物的线粒体以及在支原体中的遗传密码出现了一些偏离。UGA→色氨酸AGA、AGG（精氨酸）→终止密码AUA（异亮氨酸）→甲硫氨酸CUA（亮氨酸）→苏氨酸

AGA（精氨酸）→丝氨酸972、蛋白质生物合成的过程蛋白质的生物合成过程是由肽链的氨基端到羧基端依次加氨基酸的肽链成长过程，每次在已有肽链的羧基端加上一个氨基酸。以mRNA为模板，氨基酸经活化获得的氨酰tRNA为原料，GTP、ATP供能，在核糖体中完成。98翻译过程中，由于每一个氨基酸是严格按照mRNA模板的密码序列被逐个合成到肽链上，因此，mRNA上的遗传信息被准确地翻译成特定的氨基酸序列。细胞质中，翻译是一个快速过程，一段mRNA可以相继与多个核糖体相结合，同时连续进行多条同一种新肽链的合成。遗传信息流由DNARNA蛋白质流动。RNA的自我复制，反转录99保证蛋白质合成正确性的机制：很多氨基酰tRNA合成酶有两个活性位点：

Ж一个负责氨基酰tRNA的形成

Ж另一个位点负责识别连接在tRNA上的氨基酸是否正确。如果发现连接在tRNA上的氨基酸不正确，则其通过水解去除错连的氨基酸，从而防止了氨基酸的错误掺入。100动力学校对机制：氨基酰tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子的结合和肽链形成不是同时进行，而是有一个时间差。只有那些具有正确反密码子的tRNA才能同它们在mRNA上相应的密码子之间保持足够长的时间，使新的肽链得以形成。如果进入的tRNA不正确，由于上述的时间差，在肽链没有形成之前，错配的tRNA就从核糖体复合物上除去，从而减少了不正确氨基酸错误掺入到新生肽链中去的几率。1013、蛋白翻译后的修饰和加工及折叠

N－端的Met和fMet(甲酰甲硫氨酸)的去除去除功能蛋白质不再需要的肽段对多肽链氨基酸侧链的各种修饰：磷酰化、甲基化、羟基化、乙酰化、糖基化等硫－硫键的形成分子伴侣102新生蛋白质经蛋白酶切后变成有功能的成熟蛋白质1035、蛋白质的剪接

1994年Perler等人对与蛋白质剪接有关的成分进行了规范化的定义和命名：将按正确阅读框插入到前体蛋白质序列中，并在蛋白剪接或成熟过程中切出的蛋白序列称为蛋白内含子（intein）,而处于intein旁侧，相互首尾相连以形成成熟蛋白产物的蛋白质序列，称为蛋白外显子（extein）.104蛋白质剪接是在前体蛋白水平上，而不是在RNA水平上进行。蛋白质剪接是从前体蛋白内切除inteins,并将exteins以肽链相连，产生成熟的蛋白质的过程，切除inteins,连接exteins二者缺一不可。蛋白质剪接的结果是由一个单一的前体蛋白产生两个或多个蛋白质。105六、基因的表达调控1、原核基因表达调控操纵子：乳糖操纵子、色氨酸操纵子2、真核基因的表达调控（1）转录水平的调控（2）转录后调控（3）翻译水平的调控（4）无功能DNA与真核基因表达调控106一、原核基因的表达调控1、乳糖操纵子降解物基因活化蛋白(CAP)→特异的结合在启动基因上时，能促进RNA聚合酶与启动基因结合，并促进其进行转录；游离CAP不能与启动基因结合，必须当细胞内有足够的cAMP时，CAP首先与cAMP形成复合体，才能与启动基因结合，而葡萄糖的降解产物能降低cAMP的含量1072、Trp操纵子的阻遏系统低Trp时：阻遏物不结合操纵基因高Trp时：阻遏物+Trp结合操纵基因108衰减子：在转录水平上调节基因表达的衰减作用，用于终止和减弱转录，这种调节的作用部位叫衰减子——是一种位于结构基因上游前导区的终止子。109UUUU……UUUU……调节区结构基因trpROP前导序列衰减子区域UUUU……前导mRNA1234衰减子结构

第10、11密码子为trp密码子终止密码子14aa前导肽编码区:

包含序列1形成发夹结构能力强弱：序列1/2>序列2/3>序列3/4

trp密码子

UUUU……110UUUU……34UUUU3’34核糖体前导肽前导mRNA1.当色氨酸浓度高时转录衰减机制125’

trp密码子衰减子结构就是终止子可使转录前导DNAUUUU3’

RNA聚合酶终止111UUUU……342423UUUU……核糖体前导肽前导mRNA15’

trp密码子

结构基因前导DNA

RNA聚合酶2.当色氨酸浓度低时Trp合成酶系相关结构基因被转录序列3、4不能形成衰减子结构112细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少；弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少。它通过前导肽的翻译来控制转录的进行，在细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。113原核生物——操纵子，真核生物——？2、真核生物基因的表达和调控真核生物基因表达与调控的复杂性：（1）真核生物具有由核膜包被的细胞核，其基因的转录发生在细胞核中，而翻译则发生在细胞质中（2）真核生物基因数目比原核生物多，大多数基因除了有不起表达作用的内含子，另外还有更多调节基因表达的非编码序列，真核生物所转录的前体mRNA必须经过加工成熟后才进入表达阶段。114真核生物基因表达与调控的复杂性：(3)真核生物染色质由DNA与5种组蛋白结合组成，它们折叠和缠绕形成核小体，核小体及染色质进一步折叠缠绕形成超级结构状态的细胞分裂中期染色体。染色质的结构对基因的表达起总体控制作用。115（4）化学信号包括某些激素的诱导控制作用。（5）基因组内DNA的化学修饰（6）发育过程中高度分化的机制116（1）转录水平的调控调控区（顺式作用因子）：转录起始位点上游的GC盒（GGGCGGG）、CAAT盒（GGCCAATCT）、octamer(八聚体基序)以及增强子序列。蛋白因子（反式作用因子）：通用（或基础）转录因子、启动子特异转录激活蛋白、辅助激活蛋白因子。

117（2）转录后调控转录衰减：RNA分子转录提前终止

RNA的可变剪接：由于存在“内含子序列的不确定性或多义性”RNA的编辑：校正基因的移码突变；可以在mRNA上重新构建或去除起始密码区，控制蛋白质合成；可以在基因原来的起始密码前构建新的AUG起始密码，扩充遗传信息。118（3）翻译水平的调控：i、原核和真核细胞利用不同的策略去确定在mRNA分子上的翻译起始位点：原核：SD序列真核：由AUG密码子同mRNA分子的5’端帽子结构的接近程度而决定的

119ii、5’非翻译区二级结构对翻译起始既可表现出负控制又可表现出正控制效应：当5’UTR的序列中存在着碱基配对时，就可形成发夹式或茎环二级结构，这种结构阻止核糖体小亚基的迁移，对翻译起始具有顺式阻抑作用。作用的强弱取决于发夹结构的稳定性及其在5’UTR的位置

碱基配对区越长／或G+C含量愈高，发夹结构就愈稳定；当发夹结构位于AUG下游14个核苷酸距离时，增强了原来的起始效率

120iii、起始密码子（AUG）先导序列的长度影响翻译起始效率：先导序列长度：mRNA分子中第一AUG到其帽子间的距离。

长度≤12个核苷酸时，即使AUG置于理想旁侧序列中，仍一半以上的核糖体40S亚基滑过第一个AUG，从其下游的AUG启始翻译；长度＝20核苷酸，可以防止滑过现象；长度在17－18个核苷酸之间，其翻译效率与其长度成正比；加长先导序列的长度还可以减弱AUG5’端的二级结构对翻译的抑制作用。一般而言，一个适当长度、无高级结构和上游AUG密码的5’非翻译区对RNA的有效起始是必需的；相反，一个富含高级结构、G＋C含量高或含多个AUG的5’非翻译区可对翻译起始有阻抑作用。121iv、3’非翻译区的结构对翻译起始的影响：3’非翻译区含有UA序列，常有几个相间分布的UUAUUUAU八核苷酸序列组成，去除这段序列可明显提高mRNA的稳定性，推断UA序列是对翻译起阻抑作用的元件；阻抑活性随其在3’非翻译区的拷贝数增加而提高；可能是通过抑制起始阶段即80S核糖体复合体形成之前的第一过程。122v、poly(A)尾对mRNA稳定性及翻译效率有调控作用：poly(A)通过其结合蛋白（PABP）与60S大亚基相互作用而实现其对翻译起始的促进作用。123vi、mRNA／蛋白质相互作用与翻译水平的调控：负翻译调控：某些mRNA分子的翻译能被结合到mRNA5’端的特定的翻译阻遏蛋白所阻断5‘AUGstop3’mRNA

COOHH2NAUGstop5’3‘翻译阻遏蛋白细胞内贮铁蛋白ferritin的合成

:ferritinmRNA5’端的先导序列（大约30个核苷酸）作为铁效应元件折叠成茎环结构，这个元件是一个翻译阻遏蛋白－顺乌头酸酶的结合位点。顺乌头酸又是一个铁结合蛋白，当细胞暴露到铁溶液中引起顺乌头酸酶从ferritin的mRNA上解离，从而使ferritinmRNA翻译起始，使ferritin的合成增加100倍。124（4）无功能DNA与真核基因表达调控“无功能基因”（junkDNA）：指基因组中尚未发现任何功能的DNA，实际上这些所谓的junkDNA序列对研究包括癌症在内的人类疾病，正常基因组的修复、调控乃至多细胞有机体的进化等都是至关重要的。i、参与基因表达调控序列可能就处于所谓的junkDNA中；ii、真核基因组中含有大量的重复序列（小卫星）参与基因组结构的保持；iii、内含子。125作业

一、名词解释半保留复制、半不连续复制、RNA转录、蛋白质的剪接二、填空1、真核生物的启动子包括

、

。2、帽子结构一般为

。3、加尾识别信号为

。三、简答题1、真核基因结构特征。2、原核生物、真核生物mRNA的特征。3、遗传密码的特征。4、乳糖操纵子的双调控模式。5、衰减子的弱化机制。126第三章动物基因工程基础限制性内切酶

克隆载体重组基因的导入和筛选获得真核生物目的基因的方法127基因工程研究的理论依据不同基因具有相同的物质基础基因是可以切割的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代128DNA重组技术要有四个必要条件：工具酶、基因、载体、受体细胞129DNA限制性内切酶可分为三类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

Ⅰ、Ⅲ酶在基因工程中基本不用,why?第一节限制性内切酶限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。130Ⅰ、Ⅲ限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖于ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的、特异性切割末端。Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA，然后从底物上解离下来。131核酸内切限制酶的类型及其主要特性特性I型II型III型限制和修饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶

具有一种共同亚基的双功能的酶核酸内切限制酶的蛋白质结构3种不同的亚基单一的成份

2种不同的亚基

切割位点在距寄主特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割位于寄主特异性位点或其附近

距寄主特异性位点3，端24~26bp处甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割

能

能能序列特异的切割不是是是DNA克隆中的用处无用十分有用用处不大132一、II类限制性内切酶的特点识别特定的核苷酸序列，其长度一般为4、5或6个核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序列或兼并序列；具有特定的酶切位点，产生出特定的酶切末端→5’突出粘末端、3’突出粘末端、平末端；Ⅱ类限制－修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统；限制性内切酶、独立的甲基化酶。

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做粘性末端。133二、使用限制性内切酶时应注意的问题1、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限制性内切酶。同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，但切割后DNA分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不同酶切位点的DNA片段重组提供了方便，但要注意，往往相容的粘性末端再用DNA连接酶连接后，都不能再被其切割了。1342、注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶解DNA样品。3、注意说明书中所列出的comments的内容，会提供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基化的信息以及引起酶产生staractivity的原因。staractivity：指当酶的反应条件改变时，其在识别序列中的酶切位点发生改变。产生的原因：反应体系中甘油的浓度>12％；酶：DNA比率>25u/μg

；缺少Nacl和存在Mn2＋。1354、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。一般以在20μl反应体积中，37℃，每小时水解1微克DNA的酶量定为一个酶单位。5、注意酶在保温过程中的活性变化。ACCⅠ在5小时内具有全部活力BamHⅠ在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部分活力，而在2小时以后就无活力了。CfoⅠ仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没有活力了。136三、连接酶定义：用于将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。用途：（1）连接带匹配粘末端的DNA分子；（2）使平末端的双链DNA分子相互连接或与合成的寡核苷酸接头相连接。→这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子（150-200mmol/LNacl）或低浓度的聚乙二醇（PEG）可提高连接效率。137DNA连接酶连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）138四、修饰酶1、DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I：3种催化活性klenow大片段酶：2种催化活性T4噬菌体DNA聚合酶：2种催化活性T7噬菌体DNA聚合酶：2种催化活性耐高温DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）反转录酶：3种催化活性末端脱氧核苷酸转移酶等1392、依赖于DNA的RNA聚合酶：SP6噬菌体及T7和T3噬菌体RNA聚合酶用途

:在invitro条件，合成单链RNA作为杂交探针1403、T4噬菌体多核苷酸激酶：催化ATP的γ－磷酸基转移至DNA或RNA片段的5’末端。用途：标记DNA片段的5’端

，制备杂交探针；基因化学合成中，寡核苷酸片段5’－磷酸化；用于测序引物的5’标记。5’HOOH3’HOOH3’5’5’突出末端5’隐蔽末端5’32POH3’HO32P3’5’γ32PATP1414、碱性磷酸酶：用途：去除DNA片段5’末端的磷酸，以防止在重组中自身环化，从而提高重组效率；在用［γ－32p］ATP标记DNA或RNA的5’末端前，去除DNA或RNA片段的非标记的5’磷酸。5’POH3’HOP3’5’5’突出末端5’隐蔽末端OHHO5’HOOH3’3’5’142第二节克隆载体基因工程载体应具备的条件：能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制；具有合适的限制性内切酶位点：

在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后的外源DNA片段方便的插入载体；在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增；载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源DNA插入片段：在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失；应该有一个或多个选择标记。143大肠杆菌表达载体应具备：强的启动子，一个强的可诱导的启动子可使外源基因有效的转录；在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD）；在外源基因插入序列的下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。144一、质粒(plasmid)定义：质粒是能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。AOCSCL145质粒载体的基本要求具有复制起点应包含一个可供选择的标记基因具有多克隆位点具有较小的分子量和较高的拷贝数146F质粒：有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息的质粒。R质粒：表达对一种抗生素的抗性的质粒。降解质粒：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因的质粒。穿梭载体：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制。1471、质粒载体pBR322特点1）大小为4363bp2）含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）3）有单一的BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ的识别位点（在四环素抗性基因内）、PstⅠ识别位点（在氨苄青霉素抗性基因内）

外源片段在BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ位点插入时，可引起抗生素失活来筛选重组体4）带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复制功能，在大肠杆菌里pBR322以高拷贝数存在1482、质粒载体pUC191）特征大小为2686bp；乳糖操纵子β－半乳糖苷酶带有pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因；一个大肠杆菌乳糖操纵子β－半乳糖苷酶基因的调节片段（lacZ’）,一个调节lacZ’基因表达的阻遏蛋白的基因lacI；含有多个单克隆位点。1492）pUC19的筛选：培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTG，lac操纵子的一个诱导物）时，lacI的产物就不能与lacZ’的启动子区域结合，质粒pUC19的lacZ’就可以转录，进而翻译，lacZ蛋白会与染色体DNA编码的一个蛋白形成具有活性的杂合β－半乳糖苷酶；在底物5－溴－4氯－3吲哚－β－半乳糖苷酶（X-gal）存在下，X-gal会被杂合β－半乳糖苷酶水解成蓝色的产物，没有插入外源DNA序列的pUC19质粒克隆就呈蓝色；由于pUC19的单克隆位点的序列是整合在lacZ’之中的，若pUC19质粒中插入有目的DNA片段，就会破环lacZ’的结构，导致细胞无法产生功能性的lacZ蛋白，也就无法形成杂合的β－半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。150α－互补原理载体：含有β－半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和N－端146个氨基酸的编码序列，并在编码序列中插入了一个MCS受体菌：为β－半乳糖苷酶C端序列编码互补：宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补151穿梭质粒:人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。152二、λ噬菌体①λ噬菌体可以进入裂解循环，20分钟后就可使宿主细胞发生裂解，同时释放出大约100个噬菌体颗粒。②λ噬菌体也可以进入溶源循环，即注入的DNA整合到大肠杆菌的染色体中，以前噬菌体的形式潜伏起来，永久保留。153③λ噬菌体DNA大约长50kb，其中大约20kb对于整合／切割过程极为关键，称为整合／切割（I/E）区域。对于构建文库，可将这20kbDNA片段去掉，强迫重组的λ噬菌体进入裂解循环。整合／切割区域尾部基因头部基因粘性末端粘性末端负责DNA复制的基因细胞裂解基因λ噬菌体的DNA示意图左臂右臂154④λ噬菌体头的大小足以装下50kb单元的线性DNA，DNA<38kb，噬菌体没有侵染性DNA>52kb,则无法包装进头部⑤cos位点（cossite）就是保证在超长线性DNA分子上每两个cos位点之间为50kb,使DNA分子能正确的装配进噬菌体在头的入口处有一种酶，它能识别双链线性DNA分子上的cos序列，并在cos序列处切断DNA分子，使适当大小的DNA进入噬菌体的头部155三、柯斯质粒（cosmid）可携带40kb大小的DNA片段，并在大肠杆菌中复制保存，→综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优势。柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个cos位点、DNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个cos位点之间含有一个限制性内切酶位点（RE）。156四、YAC载体1、目前能容纳最大外源DNA片段的载体是YAC（酵母人工染色体，yeastartificialchromosome）。2、真核生物染色体三个关键部分：着丝粒（centromere,CEN）,它主管染色体在细胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中；端粒（telomere,TEL）,位于染色体的末端，对染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶切断具有重要的意义；自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequence,ARS）,即在染色体上的多处DNA复制起始位点。1573、作为真核基因表达载体应具备如下条件：①含有原核基因的复制起始序列（如ColE1起始序列ori）筛选标记；②含有真核基因的复制起始序列（如SV40病毒的复制序列、酵母的2μ质粒的复制起始序列ARS、以及真核细胞筛选标记（如氨基糖苷G148抗性基因、在酵母细胞中与自养有关的基因））；③含有有效的启动子序列（可包含增强子序列等各种顺式作用元件）；④RNA聚合酶所需的转录终止和poly(A)加入的信号序列；⑤合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点。1584、YAC的主要功能成份有三：

1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减数分裂同源染色体分离之必需2）端粒3）自主复制序列（ARS）元件4）构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，选择标记，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆159第三节受体细胞接受遗传物质的细胞能摄取外源DNA并使其稳定存在，具有重要的应用价值和理论价值160一、原核生物细胞表达系统优点大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA导入没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质基因组小，遗传背景简单繁殖迅速，实验周期短，重复实验快161一、原核生物细胞表达系统问题真核基因修饰DNA与细胞分裂的关系细胞的特异性分化热源、内毒素不易除去、产品难纯化包涵体提纯繁琐蛋白质复性困难，易出现肽链的不正确折叠162二、真核生物细胞表达系统真核生物由多细胞组成，有明显的细胞分化和细胞核真核细胞的一条成熟的mRNA只能翻译出一条多肽存在大量的重复序列和内含子1631、真菌细胞表达系统基因结构相对简单培养简单，适于大规模发酵生产表达产物能分泌到培养基中，便于产物的提取和加工不产生毒素酵母菌1642、哺乳动物细胞表达系统表达水平仅为细菌表达量的5%能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N端糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能1653、昆虫细胞及其幼体表达系统良好的翻译后修饰功能表达产物接近天然的蛋白质构型166三、受体细胞的选择避免外源DNA被修饰和降解无重组能力，重组DNA分子能稳定维持和表达具有较高的可转化性含有与载体的选择性标记相匹配的基因型，便于重组子的筛选感染寄生缺陷型，无致病性，不会对外界环境造成生物污染167第四节重组基因的导入和筛选168DNA克隆的基本过程分：分离目的基因切：对目的基因和载体适当切割接：目的基因与载体连接转：重组DNA转入受体菌筛：筛选出含有重组体的受菌体169基因工程技术策略分：

基因载体

目的基因

质粒噬菌体病毒直接分离cDNA人工合成基因文库切：

限制性内切酶有缺口的载体目的基因接：

连接酶粘端连接平端连接尾接法重组体转：转化转染体外包装带重组体的宿主筛：表型筛选电泳法核酸杂交1701、细胞内总DNA的提取分离细胞内总DNA的提取分离程序紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度1712、基因重组的方法：1）根据外源DNA片段末端的性质同载体上适当的酶切位点相连实现基因的体外重组。172外源DNA片段所具末端克隆所需条件注明平端需高浓度的DNA和连接酶1)非重组体克隆的背景可能较高2)外源DNA与载体DNA结合处的酶切位点可能消失3)重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝不同的突出端用限制性酶酶解后，需纯化载体去除小片段，以提高有效连接效率1)载体与外源DNA结合处的酶切位点常可保留2)非重组克隆的背景较低3)外源DNA只以一个方向插入到重组质粒中相同的突出端酶切后的线状载体DNA常用磷酸酶处理去磷酸化1)载体与外源DNA结合处的酶切位点常可保留2)外源DNA会以两个方向插入3)重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝外源DNA片段与载体的连接1732）当在载体的以及外源DNA片段两端的限制酶切位点之间，不可能找到恰当的匹配时，可采用下述方法解决：

①在线状质粒的末端／或外源DNA片段的末端用DNA连接酶接上接头或衔接头，这种接头可以是含单一的或多个限制性酶切位点，然后通过适当的限制酶解后进行重组。174②使用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段部分补平3’凹端。→3’凹端转变成粘端。5’TCGAAGCT5’xhoI5’GATCCTAG5’Sau3AI5’TCGAAGCT5’CTTC5’GATCCTAG5’AGGCdCTP、dTTP、dATP、dGTPKlenow酶175③使用Klenow酶在4种dNTP存在下，将3’凹端完全补平或用S1核酸酶、绿豆核酸酶、Klenow酶、T4DNA聚合酶去除3’－突出端产生平端DNA分子，可与任何其他平端DNA分子相连。3）可以利用末端转移酶分别在载体酶切位点处和外源DNA片段的3’端加上相互补的同聚尾→同聚物加尾法，常用于双链cDNA的分子克隆。1764）多聚酶链反应（PCR）为基因定向重组和构建外源基因高效表达治理提供了一个通用方法。

根据载体上的克隆位点设计PCR引物，使引物上带有与载体克隆位点相匹配的限制性内切酶识别序列。1773、重组DNA分子导入受体细胞1)转化：由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率1782)转导：通过噬菌体或病毒的感染作用将一个细胞的遗传信息传递到另一个细胞的过程用噬菌体活病毒作载体，以其DNA与目的序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖1793)转染：重组的噬菌体DNA也可像质粒DNA的方式进入宿主菌，即宿主菌先经过CaCl2等处理成感受态细菌再接受DNA，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖也可用人工脂质膜包裹DNA，形成的脂质体可以通过与细胞膜融合而将DNA导入细胞180具体方法：①氯化钙法②电穿孔：将宿主细胞置于一个高强电场中，通过电场脉冲在细胞壁上打孔，DNA分子随即进入细胞③聚乙二醇介导的原生质体转化法：常用于转化酵母以及其他真菌细胞→活跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理变成球形后，在适当浓度的聚乙二醇6000（PEG-6000）的介导下将外源DNA转化入受体细胞中181④磷酸钙或DEAE－葡聚糖介导的转染：

¤将外源基因导入哺乳类细胞中瞬时表达的常规方法

¤磷酸钙和DNA共沉淀：将被转染的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后可能通过内吞作用进入受体细胞

¤DEAE－葡聚糖作用：可能是其与DNA结合从而抑制核酸酶的作用或与细胞结合从而促进DNA的内吞作用182⑤原生质体融合：通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合⑥脂质体法：将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜融合将基因导入⑧细胞核的显微注射法：即将目的基因重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中1834、一般克隆基因的检查和鉴定方法琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力

——不同迁移率分子量标准参照物酶切和电泳方法1841）重组质粒的快速鉴定：根据有外源基因插入的重组质粒同载体DNA之间大小的差异区分。2）重组质粒的限制酶解分析。3）通过α互补使菌落产生的颜色反应来筛选重组体。185

标志补救（markerrescue）

若目的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对营养素的依赖表型来筛选。

宿主生长——依赖Leu重组体+目的基因

———→能够合成Leu在没有Leu存在时——→能生长（已转化）

重组体转化的细菌中

在没有Leu存在时——→不生长（没有转化）1864)外源DNA片段插入失活如果载体带有两个或多个抗生素抗性基因并在其上分布适宜的可供外源DNA插入的限制性内切酶位点时，当外源DNA片段插入到一个抗性基因中去时可导致此抗性基因失活。5)分子杂交筛选法：①原位杂交②点杂交和southern杂交187A.核酸的分子杂交技术

在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上的常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）188（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析Southern杂交

A.DNA体外重组实验

B.抗生素筛选转化子细胞

C.培养突变株细胞

D.Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中Southern杂交分析示例1896)表达文库的免疫学筛选：绝大多数构建λ噬菌体的cDNA文库选用λgt11、λZAP或λORF8作为表达载体这些噬菌体带有一拷贝的大肠杆菌LacZ基因，克隆位点位于翻译终止密码子上游53bp处cDNA插入方向和阅读框正确时，可以表达氨基端为β－半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融合蛋白，其中一些外源序列将暴露出可用特异抗体检测的抗原表位1907)利用PCR方法来确定基因的重组体克隆PCR产物；通用引物：pUC/M13