6.蛋白酶幻灯片

第六章蛋白酶地位蛋白酶是食品工业中最重要的一类酶。应用广泛，如干酪生产、肉类嫩化、植物蛋白质改性等大量使用。存在广泛植物：菠萝、木瓜、无花果动物：消化道---胃蛋白酶、胰凝乳酶、羧肽酶、氨肽酶等。微生物：细菌、霉菌、酵母、放线菌。蛋白酶

水解蛋白质中肽键。

2、氨基酸的构型

蛋白酶的底物---蛋白质和多肽是由L-氨基酸构成的。3、底物分子的大小一般没有要求。但酸性蛋白酶有严格要求。4、X和Y的性质要求X、Y可以分别是-H、-OH，也可以继续衍生出去。肽链内切酶：X和Y必须继续衍生出去，X可以是酰基或氨基酸残基，Y可以是酰胺基或酯基或氨基酸残基。肽链端解酶：X和Y分别是-H或-OH

羧肽酶：要求Y是-OH，特异性表现在R2侧链结构的要求上，在X不是-H时，才表现出高的活力。氨肽酶：要求X是-H，并不优先选择Y不是-OH的底物，特异性表现在R1侧链结构的要求上。5、对肽键的要求多数蛋白酶不仅能水解肽键，还能作用于酰胺（-CONH2）、酯（-COOR）、硫羟酸酯（-COSR）和异羟污酸（-CONHOH）等。胃蛋白酶和其它一些酸性蛋白酶对水解键有较高识别能力。如肽键→酯键，即使R2满足要求也不能作为底物。二、蛋白酶的分类1、根据水解蛋白质的方式分类（1）肽链内切酶：与蛋白质内部的肽键反应，水解蛋白质为多肽类或肽类。

（2）肽链端解酶：从肽链的一个末端开始将氨基酸水解下来。羧肽酶：从肽链的羧基末端开始。

氨肽酶：从肽链的氨基末端开始。（3）水解蛋白质或多肽酯键的酶（4）水解蛋白质或多肽酰胺键的酶2、根据来源分类（1）植物：菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶（2）动物：胃蛋白酶、凝乳酶（胃）、胰蛋白酶（3）微生物：1398枯草杆菌蛋白酶、3942栖土曲霉蛋白酶、放线菌蛋白酶酸性蛋白酶：

pH2.5-5.0胃蛋白酶、凝乳酶和许多霉菌蛋白酶中性蛋白酶：pH7~8

胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、细菌性中性蛋白酶（枯草芽孢杆菌产生的）碱性蛋白酶：

pH9~11

枯草芽孢杆菌蛋白酶3、最适作用条件4、根据活性中心分类（1）、丝氨酸蛋白酶

活性部位含有丝氨酸残基。丝氨酸羟基抑制剂：DFP（二异丙基氟磷酸）肽链内切酶。

胰蛋白酶、胰凝乳酶、弹性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等都属于此类。2、巯基蛋白酶

活性部位含有一个或多个巯基。

抑制剂：氧化剂、烷化剂和重金属离子。

植物蛋白酶和某些链球菌蛋白酶属于此类。3、金属蛋白酶

活性中心：含有镁、锌、锰、钴、铁、汞、镉、铜或镍等金属离子。在EDTA溶液中透析可以分离出金属离子，使酶失活。

抑制剂：氰化物

羧肽酶A、某些氨肽酶和细菌蛋白酶属于此类。4、羧基蛋白酶（酸性蛋白酶）

活性中心：有2个羧基。

抑制剂：对-溴苯甲酰甲基溴或重氮试剂。

胃蛋白酶、凝乳酶和许多霉菌蛋白酶在酸性范围内具有活性。最适pH在2~4。三、常用蛋白酶及其特性1、酸性蛋白酶羧基蛋白酶，活性中心含有2个天冬氨酸残基最适pH：2.5~5.0最适作用温度：45~75℃。分子量：30000-40000等电点低：3-5

热稳定性：pH2.0~4.0，40℃以下比较稳定，超过50℃酶活力损失较严重，60℃以上很快失活。

pH稳定性：pH2.0~6.0稳定，超此范围失活严重。金属离子稳定性：可被Mn2+

、Ca2+

、Mg2+激活，Cu2+

、Hg2+

、Al3+抑制。

抑制剂：对-溴苯甲酰甲基溴或重氮试剂。应用：

皮毛软化，啤酒、果酒澄清，动、植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收，饲料添加等。2、碱性蛋白酶枯草芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶研究最为深入和广泛。应用：皮革脱毛、丝绸脱胶、加酶洗涤剂、加酶洗衣粉有效温度范围：20~65℃最适作用温度：40~50℃有效pH范围：7~11最适作用pH：9.5~10.5金属离子：可被Ca2+激活，Hg2+、Ag+

、Cu2+

、Zn2+

抑制。分子量：20000-34000等电点高：8-93、中性蛋白酶最早用于工业生产的蛋白酶。大多数微生物中性蛋白酶是金属酶，一部分酶蛋白总含有一原子锌，分子量为35000-40000，等电点8-9。最不稳定，易自溶。最适温度：50℃左右。最适pH：7-8热稳定性：pH7.0~8.0，37℃以下比较稳定，作用2h酶活保存80%，超过45℃酶活力不稳定，60℃以上很快失活。pH稳定性：pH6~7稳定，低于5.0或高于9.0很快失活。金属离子稳定性：可被Mn2+

、Ca2+

、Mg2+激活，Cu2+

、Hg2+

、Al3+抑制。4、丝氨酸蛋白酶共性与特性：主要有胰蛋白酶、α-凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶等。共同特征：内切酶，活性中心含有丝氨酸残基，此外活性中心还有咪唑基和羧基，并且在一些蛋白酶活性中心部分的氨基酸连接顺序相似。（1）α-胰凝乳蛋白酶由3条多肽链组成，以2个链间二硫键连接在一起。还含有3个链内二硫键，分子量25000左右。牛胰脏可产生两种没有活性的胰凝乳蛋白酶酶原A和B，氨基酸组成不同，等电点为8.5和4.5，当转变为活性酶时，物理性质仍有差别，但特异性相同。最适pH为7~9（2）胰蛋白酶是消化系统中重要的蛋白质消化酶，在机体内不仅可以自激活，还要激活其他的蛋白酶。来自不同动物的胰蛋白酶氨基酸数目和顺序有差异，但活性中心均有丝氨酸，均由一条单肽链组成，并且作用机制相同。胰蛋白酶的最适pH为7~9，较高时自我催化分解。钙离子有保护和激活作用。（3）弹性蛋白酶肽链内切酶，专一性的水解不溶性的弹性蛋白动物胰脏中提纯的弹性蛋白酶由240个氨基酸残基组成，分子量25000，等电点9.5，最适pH为8.1-8.9。是一种单体酶，无辅酶，不含辅基和金属离子。弹性蛋白酶至少有两个活性中心一个是水解活性中心，使弹性蛋白某些键断裂，弹性蛋白结构松弛，亲水基团大量暴露出来而溶于水；一个是蛋白水解活性中心，表现出广谱蛋白水解活性5、巯基蛋白酶木瓜蛋白酶其酶活性部位中含有巯基，属巯基蛋白酶。木瓜蛋白酶存在于木瓜汁液中，分子量23900，至少有3个氨基酸残基存在于酶的活性部位，它们是Cys25（半胱）、His159（组）和Asp158（天冬）。当Cys25被氧化剂氧化或与重金属离子结合时，酶活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力。还原剂作用：从-S-S-——-SH，EDTA螯合重金属离子。木瓜蛋白酶在pH5时，有良好稳定性，如pH<3或>11时酶很快失活，最适pH随底物改变。木瓜蛋白酶具有较高的耐热性，酶液在pH7和70度下加热30分钟，而使牛乳凝结的活力仅下降20%。木瓜蛋白酶对酯和酰胺类底物表现出很高的活力。6、金属蛋白酶这类蛋白酶为肽链端切酶。金属蛋白酶中的金属离子大多是二价金属离子，这些金属离子是否发挥相似的作用还不清楚，酶活性均能被金属螯合剂所抑制。常见的金属蛋白酶（1）羧肽酶牛体内，羧肽酶以酶原形式从胰脏中分泌出来，由三个多肽链组成，在胰蛋白酶的作用下，酶原转化为羧肽酶。羧肽酶A和B的催化作用机制相同，但专一性有很大差异，A要求碳端氨基酸是除了精氨酸、赖氨酸或羟脯氨酸以外的氨基酸，而B要求碳端氨基酸为精氨酸或赖氨酸。（2）氨肽酶亮氨酸氨肽酶，有较宽广的底物特异性首先发现它能水解N-末端氨基酸是亮氨酸的二肽或三肽。还能水解许多N-末端氨基酸的酰胺、酯和肽最适pH在8左右。四、蛋白酶水解蛋白质的苦味来源

蛋白质中的疏水性氨基酸是导致蛋白质经水解后产生苦肽的重要原因。当蛋白质处于天然状态时，这些氨基酸埋藏在蛋白质结构的内部，因而对蛋白质的味道不会产生明显的影响。在酶水解过程中，小肽的数量将增加，从而暴露了这些疏水性氨基酸，当它们同味蕾相作用时就产生了苦味。

如果采取有控制的酶水解，使蛋白质的水解反应停止在某一个阶段，使肽链具有足够的长度将疏水性氨基酸埋藏在它的结构的内部，就能减少水解蛋白质的苦味。五、蛋白酶作为食品添加剂的应用1、作为肉类嫩化剂

用于肉类嫩化剂的蛋白酶必须具有较高的耐热性。因为嫩化剂的作用主要发生在当肉类被烧煮，温度逐渐升高，而酶尚未失活之前的这个阶段。