DB37-T 3375-2018 小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒的检测方法技术

ICS 65.020B01

DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T3375—2018小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒检测技术规程DetectionandidentificationofwheatyellowmosaicvirusandChinesewheatDetectionandidentificationofwheatyellowmosaicvirusandChinesewheatmosaicvirus2018071920180819山东省质量技术监督局发布前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：吴斌、辛相启、姜珊珊、张眉、王升吉、辛志梅。小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒检测技术规程范围ELISADot-ELISART-PCRGB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14926.50实验动物酶联免疫吸附试验SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T2964植物病毒检测规范SN/T1666RT-PCRRT-PCR3术语和定义3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1小麦黄花叶病毒wheatyellowmosaicvirus（WYMV）马铃薯Y病毒科（Potyviridae），大麦黄花叶病毒属（Bympvirus），病毒粒子、传播途径及危害：RNA（PolymyxagraminisL.）3.2中国小麦花叶病毒Chinesewheatmosaicvirus（CWMV）真菌传杆状病毒属（Furovirus），病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒体杆状，病毒基因组由两RNA（PolymyxagraminisL.）3.3酶联免疫吸附测定enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA具体描述参照GB/T14926.50。3.4间接联疫附定 indirectenzymelinkedimmunosorbentassay，IELISA简称：IELISA，首先用样品中抗原包被于固相载体，经洗涤，加入相应病毒的抗体，形成待测抗原-抗体复合物，再经孵育洗涤后，加入酶标记二抗，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。3.5斑点联疫附定 dotenzymelinkedimmunosorbentassay，Dot-ELISAELISADot-ELISAELISA3.6逆转-合链反应 reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR简称RT-PCR。具体描述参照SN/T1666。简称RT-PCR。具体描述参照SN/T1666。4方法原理小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒的血清学特性与分子生物学特性是该病毒检测方法的主要依据。两种病毒都具有很强的免疫原性，同时都是RNA病毒，因此可利用间接ELISA、Dot-ELISA和RT-PCR方法确定样品中是否带有上述两种病毒。5主要仪器设备、用具和试剂0.001g）；PCRj)样品冷藏柜（2℃～8℃）；k)低温冰箱（-20℃）；l)超低温冰箱（-80℃）；（10μL、100μL、200μL、1000μL）。用具：RNase（10μL100μL、200μL、1000μL）；96（NC）；RNasePCR研钵；标签；镊子。WYMVCWMVWYMVCWMVTrizolM-MLVRTRNATaqDNADNAGelred、琼A。2g～10g（2℃～8℃）2d2℃～82-80检测℃冰箱放置4h～5r/min离心3的健康小麦植株叶片，阳性样品为分别感染WYMV和CWMV的小麦植株叶片，阴性样品及阳性样品皆通过RT-PCR加样在96100μL，4洗板孵育结束后，用PBST清洗酶标板3次～5次。每孔每次加PBST洗液700μL，每次停留1min～2min。用抗体稀释缓冲液按照相应病毒抗血清的使用浓度进行稀释，每孔加入稀释好的抗体液100μL，加盖，37℃孵育1.5h。洗板同7.1.3。00μL37℃孵育1.5。洗板同7.1.3。将现配的底物缓冲液按100μL/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育1h。读数每孔加100μL3MNaOH终止剂终止反应，用酶标仪在405nm波长下测定各孔的吸光值（OD405）。NC剪裁7cm×7cmNC7mm×7mm用。PBSrpm/min3min，WYMV和CWMVRT-PCR加样分别取2μL制备好的待检测样品、阴性对照、阳性对照、空白对照，点到NC膜的相应格子中，室温干燥10min。每个样品平行在膜上重复一次。封闭在平皿（9cm）中加入20mL封闭液，并将干燥好的NC膜浸入，室温下封闭30min。用封闭液按照相应病毒抗血清的工作浓度进行稀释，并将NC膜浸入，室温孵育30min～60min。洗膜将平皿中抗体液倒出，加入PBST20mL洗膜3次～4次，每次3min。用抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并将NC膜浸入，室温孵育30min～60min。洗膜同7.2.6。显色NBT66μLBCIP33μL10mL（5min～20min）RNA干燥5min～10min30μLRNase的ddH2O-80WYMVCWMV7.3.2引物合成引物合成按照表1。表1引物合成逆转录20μLRNase的PCR3μLμM），8干燥5min～10min30μLRNase的ddH2O-80WYMVCWMV7.3.2引物合成引物合成按照表1。表1引物合成逆转录20μLRNase的PCR3μLμM），8μL无RNase的ddH2O，在65℃温浴5min。迅速置于冰上5min。再向PCR管中加入下μLμL5×RT4μLmmol/L）2μLPCR421h，70℃反应5min成的cDNA-20PCR检测病毒引物名称及序列扩增片段大小小麦黄花叶病毒WYMV-F:5′-CAGAAGGAGGAAGCTCGACT-3′375bpWYMV-R:5′-CGTGCTTGTTTCGCAACTTC-3′中国小麦花叶病毒CWMV-F:5′-GGCCGTGAAATCTGGTTATAC-3′740bpCWMV-R:5′-TCTGTTTCTATCTGGCCAGC-3′PCRddH2O14.8μL10×PCR2.5μL、MgCl2（25mmol/L）2.5μL、dNTP（10mmol/L）2μL、10pmol/μL1μL、10pmol/μL1μL、Taq（5μLcDNA1PCR℃595℃30℃30s，721min，357210min。4PCR7.3.5琼脂糖凝胶电泳检测制备1PCR10μL1μLDNA12030minOD405）OD4050.15OD405<0.050.05OD405/OD405OD405阴性对照OD4052OD405OD405验证；OD405阴性对照OD405<2证。检出结果表述如下：附录A（规范性附录）试剂配制（pH9.6）碳酸钠（Na2CO3）1.59g，碳酸氢钠（NaHCO3）2.93g，溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至9.6，用蒸馏水定容至1000mL。PBST（pH7.4）（NaCl）8.0（KH2PO4）0.2（Na2HPO4）1.15（KCl）0.2g，0.5mLTween-20，溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.4，蒸馏水定容至1000mL。PVP（MW24～4000）（聚乙烯吡络烷酮）2g，脱脂奶粉1g，溶解于100mLPBST中。（pH9.8）二乙醇胺9.7mL，氯化镁（MgCl二乙醇胺9.7mL，氯化镁（MgCl2）0.01g，溶解于80mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至9.8，用蒸馏水定容至100mL。）1mgPNPP（对-硝基苯磷酸二钠）溶于1mL底物缓冲液中。抗血清碱性磷酸酶标记抗体。A.2斑点酶联免疫吸附测定A.2.1PBS（pH7.2）（NaCl）8.0（KH2PO4）0.2（Na2HPO4）1.15（KCl）0.2g，溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.2，蒸馏水定容至1000mL。A.2.2PBST（pH7.4）（NaCl）8.0（KH2PO4）0.2（Na2HPO4）1.15（KCl）0.2g，0.5mLTween-20，溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.4，蒸馏水定容至1000mL。封闭液取脱脂奶粉5g加入到100mLPBST，充分溶解，4℃保存。（pH9.5）Tris·Cl12.11g，氯化镁（MgCl2）2.38g，氯化钠（NaCl）5.85g，溶解于900mL蒸馏水中，用氢氧化钠调节pH至9.5，用蒸馏水定容