RNAi及其在植物遗传改良中的应用

RNAi及其在植物遗传改良中的应用123RNAi即RNA干涉(或RNA干扰)是指双链RNA导入细胞后并被切割成21〜23个核苷酸长度的短核苷酸双链，在其它作用因子的参与下能够特异地与其同源的mRNA结合并导致其降解，从而使得内源基因不能表达，导致内源基因的沉默。自1998年Fire等首次在线虫中发现并阐明以来，RNAi已经在其它动物、植物和真菌中被证实。研究表明参与该过程的许多基因具有高度的保守性，这可能是生物调控基因表达及抵御病毒侵染或转座子诱导DNA突变的一种共有的古老生理机制。RNAi所具有的特异性、稳定性、高效、快速以及不改变基因组的遗传组成等特性为人们研究未知功能的基因提供了新的反向遗传学手段。在拟南芥和水稻等基因组测序完成后，RNAi这一新技术在植物功能基因组学研究及植物的遗传改良等方面提供了一个强有力的手段。植物的转基因沉默Napoli等将1个查尔酮合成酶基因(chs)置于1个强启动子后导人矮牵牛(Petuniahybrida)，试图加深花朵的紫颜色。结果部分花的颜色并非期待中的深紫色，而是形成了花斑状甚至白色，而且这种性状可以遗传。因为导入的基因和其同源的内源基因同时都被抑制，他们将这种现象命名为共抑制(co-suppression)。类似的结果同样在真菌脉胞菌(Neurosporacrassa)中和其它转基因植物中存在。对于部分转基因植物来说，基因沉默可能是因为特异基因的甲基化而导致，这被称为转录水平基因沉默。但确实部分植物中的基因沉默是在转录后发生的，这被称为转录后基因沉默。实验表明在发生PTGS的个体中同源转录确实存在，但是很快在胞浆中被降解，没有积聚。Palauqui等进一步证实，在植物中将出现转基因沉默的植株嫁接到另一没有基因沉默的转基因植株中同样可以导致PTGS，但对非转基因植株却无效。Cogoni等证实PTGS由一种可扩散的反式作用分子所介导。RNAi及其机制RNAi的发现Guo等在对线虫基因par-1进行功能研究时发现：当他们给线虫注射par-1的反义RNA以阻断该基因的表达时，发现作为正对照的正义RNA和反义RNA得到的结果相似，即两者都阻断了par-1基因的表达。Fire等分别将正义RNA、反义RNA和双链RNA注射进线虫中来研究unc22，fem1,unc54和hlh1等基因的功能。他们发现双链RNA比任一单链单独使用所产生的基因沉默效果要好的多，双链RNA能产生高效和特异的效果，并且每个细胞只需要几个双链分子，这种干涉的效果还可以持续到其子代，他们将这种现象称为RNA干涉。Timmons等在随后的研究中发现RNAi具有扩散性，将双链RNA注射到线虫的某一部位后可以在全身其它细胞中看到干涉现象，并且他们通过喂食的方法将双链RNA导人线虫体内也获得了类似的结果。RNAi的产生机制Hamilton等和Ketting等分别在发生共抑制的烟草和西红柿中鉴定了一些大约25个碱基大小的RNA,这些RNA分别与沉默基因的正义链和反义链互补。Zamore等在果蝇细胞中发现被注射进入的双链RNA被切割为21〜23碱基长短的双链RNA片段。同时与双链RNA同源的内源基因的mRNA，只在和双链RNA对应的部位被切割成为21〜23核苷酸长的片段，造成mRNA在细胞中的含量大大降低，因此他们认为这些siRNA在RNAi过程中起着重要作用。生化鉴定表明这些siRNA具有一些共性：一般为长21〜23个碱基对的双链；3'端具有2个突出的碱基，多为尿嘧啶，也可以是胸腺嘧啶且具有羟基；5'端被磷酸化。这些特点可能是其与别的RNA相区别，能被特异地识别。而这一特点也是RNaseIII酶切后的特征。研究表明mRNA被特异性切割发生在细胞质中。当双链RNA进入细胞后，能与类似RNaseIII的Dicer结合，随即被切割成21〜23个碱基的siRNA。siRNA与RISC（RNAinducedsilencingcomplex）结合，若双链5'端未被磷酸化，则会启动其磷酸激酶活性，将其磷酸化并被解螺旋。反义链RNA与RISC结合后将其内切酶活性激活，激活的RISC在细胞质中寻找能与反义RNA同源的mRNA，并在双链的中心部位、距双链RNA5'端第10个碱基处将其切割，从而使mRNA降解。在对RNAi的研究中，往往一个细胞中含有几个双链RNA分子就可以将靶基因沉默，即使是沉默高丰度表达基因也是如此。因此人们推测在RNAi过程中还应包括一个双链RNA的复制过程。Sijen等认为双链RNA在RNAi初期的作用是为RdRP（RNAdependentRNAPolymerase）提供引物，并以靶mRNA为模板合成更多的双链RNA。这一假设在其它物种中得到证实。目前人们已经在线虫、果蝇、拟南芥及脉胞菌等物种中鉴定了多个与RNAi过程相关的基因，如线虫基因ego-1，rde-1和rde-4，脉胞菌的qde-2,拟南芥的ago1基因等。RNAi在生物体的进化与发育过程中具有相当的保守性。AGO1，QDE2,和RDE1在植物的转基因沉默、真菌的压抑现象和动物的RNAi中起着相似的作用。Boutla等从产生基因沉默的植物中提取RNA,在注射到线虫后引起了特异基因的沉默。但不同物种间在RNAi上仍有较大的差异。在哺乳动物细胞中用21个碱基对的双链RNA可以引起特异的抑制反应，而较长的双链RNA（超过30个碱基对）转染哺乳动物细胞会引起非特异的基因抑制，这和在其他生物中的特异抑制不同。这种抑制可能是由于一种抗病毒应答反应造成。长的双链RNA激活蛋白激酶PKR,激活的PKR通过一系列的磷酸化使翻译起始因子eIF2a失活，导致翻译抑制或者长dsRNAs激活RNaseL,导致非特异的RNA降解。2.3RNAi的特点RNAi所产生的基因沉默具有如下特点：1） 高效性。Elbashir等在研究中发现分别为25nmol/L与100nmol/L的起始双链RNA产生的结果是一样的，只是高浓度起始的更有效些。将双链RNA浓度降低到1.5nmol/L时产生的基因沉默效果变化不大，只有当浓度降低到0.05nmol/L时，沉默的效果才消失。Holen等也证实1〜100nmol/L的双链RNA浓度对基因沉默的效果是一致的。这说明双链RNA介导的基因沉默效率是相当高的。2） 需要ATP。Zamore等认为RNAi过程中至少有2个步骤需要能量的供给：一是长的双链RNA被Dicer所酶切产生双链RNA；二是在双链RNA与RISC结合解链后形成有活性的RISC。3） 特异性。Elbashir等和Brummelkamp等发现在21〜23个碱基对中有1〜2个碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。4） 位置效应。Holen等根据人TF（tissuefactor）不同的位置各合成了4组双链RNA来检测不同位置的双链RNA对基因沉默效率的影响。在不同浓度和不同类型的细胞中，hTF167i和hTF372i能够抑制85%〜90%的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i则几乎没有抑制基因的活性。他们还以hTF167为中心依次相差3个碱基对在其左右各合成了几组双链RNA,有趣的是它们所能抑制该基因活性的能力以hTF167为中心依次递减。特别是hTF158i和hTF161i只与hTF167i相距9个和6个碱基，但它们几乎没有抑制该基因活性的能力。结果还表明双链RNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC含量较低的mRNA被沉默效果较好。5） 竞争效应。Hoten等将10nmol/L和30nmol/L的hTF167i相比，两者的沉默基因效果无差异，但将20nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i产生的抑制效果明显降低。6） 可传播性。在线虫中，双链RNA可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。Feinberg和Hunter在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白SID1，它可以将双链RNA转运出细胞，因此系统性的RNAi包括了SID1介导的双链RNA在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物，因此在果蝇上通过注射产生的RNAi不能扩散。2.4RNAi的生物学功能从低等的真菌到高等的哺乳动物都有RNAi,在不同的物种间既有差异，又有很高的保守性，这说明RNAi应该出现在生命出现的早期，它的存在是生物进化与发育的重要组成部分。目前来看，RNAi的生物学功能主要表现在如下3个方面：1） 一种抗病毒的应答反应。真核生物也编码类似RdRPs的酶，它们与病毒的RdRPs没有同源性，但两者在功能上却有很多相似的地方。rde-2，rde-3和mut-7对于线虫PTGS是必须的，它们同时在RNAi中起着关键作用，因此对RNAi和PTGS来说，这是两者在功能上的相似之处。烟草的RdRPs基因NtRdRP1能被病毒侵染和水杨酸所诱导，在它被反义RNA沉默后，突变株系中病毒RNA的积累很快，并且产生了很严重的感病反应。2） 基因组的免疫系统。在复杂的基因组中存在着许多重复因子，包括数目众多的转座子。研究中发现，RNAi经常由重复转座因子引起，并能抑制转座子活性。在线虫的研究中，缺失RNAi的虫体表现出了高频的转座子活性。在植物细胞中发现双链RNA能够诱导同源的基因序列甲基化，Pelissier等在用番茄的类病毒载体侵染烟草时发现，在侵染过程中，与类病毒互补的大约30个碱基对的基因组序列发生甲基化。在PTGS中常常伴随有基因组的甲基化，当双链RNA与启动子而非表达序列区域有同源性时，常常表现为基因的甲基化，基因在转录水平被抑制。Schramke等和Zilberman等分别在酵母和拟南芥中鉴定了几个参与RNAi的基因，并证实这些基因主要是甲基化酶，它们的主要功能是由长的双链RNA诱导相应的基因组甲基化，使其在转录水平沉默。Kovalchuk等也证实病菌的侵染能诱使植物的DNA发生重排，这个过程中有与RNAi相关基因的参与。3） 调节基因的时空表达。许多在RNAi的过程中起着关键作用的基因在生物的发育过程中同样起着重要作用，它们的突变往往造成发育的变异，如拟南芥中的ago1突变体表现为共抑制缺陷的同时也表现为叶发育缺陷，因此人们认为与RNAi相关的一些酶或者过程可能也参与了发育调控过程。VOlpe等发现酵母参与RNAi的Dicer和RdRPs的基因同源序列的去除会导致一系列的生理异常，主要表现为着丝粒的异染色质重复序列的转录本异常积累，同时插入着丝粒区的外源基因开始不受抑制地表达，并且伴随着组蛋白H3赖氨酸-9的去甲基化和着丝粒不能进行配对。因此RNAi在保持着丝粒区重复序列的异染色质状态，保证细胞的正常分裂中起着重要作用。此外Glazov在拟南芥中鉴别到1个与PTGS和RNAi相关的基因（WernerSyndrome-likeexonuclease（WEX）gene），这个基因与人的WernerSyndromeprotein（WRN）相似，具有RNaseD的结构域，但缺乏双链RNA解链的结构域，它可以与RNA解旋酶互作来参与PTGS和RNAi它的缺失可以造成拟南芥提前开花。3RNAi在植物遗传改良中的应用3.1双链RNA的合成对于线虫而言，双链RNA在生物体中的表达通过注射或者喂食的方法都可以产生很好的效果。但这种简单有效的方法对于其它生物来说并不可行。对于植物和哺乳动物来说，要有稳定的抑制效果就必须有稳定表达双链RNA的合适方法，这还得要借助遗传转化的方法。目前已经建立了多种适合产生双链RNA的方法。1） 化学合成。早期的RNAi研究中主要是在体外分别合成2条RNA单链，然后经过退火后形成双链RNA。这种方法产生的双链RNA成本高，且对操作要求严格。2） 体外生物合成。可以通过单启动子或双启动子借助于原核生物的体外高效表达大量合成单链或双链RNA。这种方法简单、快速，而且不受量的限制。3） 体内生物合成。将序列构建在合适的表达载体上后，通过遗传转化的方法导人生物体内，可以组成型表达，也可以通过启动子的调控来控制双链RNA的合成。对于大多数生物来说，注射双链RNA产生的抑制效果是暂时性的，随着细胞的增殖，RNAi产生的沉默效果逐渐减弱直至消失。因此人们目前研究基因的表达与调控时主要还是选择了第3种产生双链RNA的方法。根据研究的对象和要求，人们已经设计出了不同的方法在哺乳动物和植物上应用。植物的功能基因学研究除了对RNAi的产生机制及生物学功能研究外，人们更关心的是它广泛的应用前景。在老鼠、拟南芥、水稻和人等的基因组测序完成后，生物学研究进入后基因组时代。人们研究的重点放在基因的功能注释，基因的表达调控及改造以及基因间的相互联系研究上。RNAi为大规模高效及复杂的功能基因组学研究提供了一个便捷的平台。Kamath等构建了一个可重复利用的线虫RNAi文库，通过对线虫19427个候选基因进行功能研究，86%的基因功能被抑制，其中只有1722个基因能在形态上看到变异。他们同时发现一些具有相似功能的基因成簇地分布在不同的染色体上，有的区域甚至跨跃了几百万个碱基，这些基因具有相同的表达谱。Kaveh等同样利用该技术对线虫的16757个基因进行沉默，他们得到了305个失活后导致身体脂肪减少的基因和112个失活后导致身体脂肪增加的基因，其中部分基因与脂肪代谢调节基因同源。Waterhouse等认为RNAi对于植物的全基因组基因的高通量分析同样应该有效。在水稻和拟南芥的基因组测序完成后，人们获得了众多的候选基因，RNAi为注释和认识这些基因在植物体中所起的作用提供了一种快速、高效的鉴定方法。对小麦、棉花等异源多倍体基因组测序是一项艰巨的工作。生物之间由于进化的关系或多或少在某些方面具有一定的同源性，因此在比较接近的物种可以通过比较基因组来加快其研究进展。但有时通过传统的基因敲除或反义RNA的方法来使基因沉默以研究基因家族的功能往往并不能达到效果。Lawrence等在Arabidopsissuecica使用RNAi的方法证实了通过合理设计双链RNA就可以有效地同时沉默1个基因家族，这为多倍体物种的功能基因组学研究指明了方向。利用RNAi在水稻、芸薑属和油菜以及烟草上已经进行了一些基因功能验证的相关研究。植物的品质改良植物产品为人们的生产生活提供了必要的物质基础，随着生活水平的提高，人们对品质的要求也日益提高。例如油料产品中的硫甙含量、不饱和脂肪酸的含量，咖啡中的咖啡因的含量等。传统育种很难同时改变作物多个品质性状，如营养成分的组成比例等。人们对一些生化物质代谢途径的认识使得分子改良成为可能。Liu等利用RNAi技术对棉籽油的成份进行了改良，提高了棉花籽油中硬脂酸与油酸的比例。普通棉籽油含26%的棕榈酸、15%油酸及58%亚麻油酸。加工过的棉籽油会产生反式脂肪酸，生成胆固醇，增加人体的心血管疾病发病几率。因此目前倾向于使用低棕榈酸、高油酸及硬脂酸的油类。棉花种子的硬脂酸经棕榈酸合成后，经由&9去饱和酶形成油酸，再由&12去饱和酶作用形成亚麻油酸，最后形成次亚麻油酸，各脂肪酸的含量比例会因参与酶活性的不同而有所差异。其中ghSAD-1与ghFAD2-1