温度敏感突变株的分离课件

温度敏感突变株的分离生工（2）班第一小组定义:在诱变处理后的群体中能分离到这样一类突变株:它们在许可的温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别，在非许可温度条件下不能生长或微弱生长，表型与野生型不同，这种条件致死突变株即温度敏感突变株温敏突变株的特性TS突变株主要由必需基因的突变导致某些基因产物（某种酶）的结构发生改变而引起的，即突变体的酶蛋白一级结构氨基酸序列发生了改变，而酶的活性中心并未发生改变。有时非必需基因的突变也可产生温敏突变株。温敏突变株的突变位置，就谷氨酸而言，据推测，发生在与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构基因上。这种基因突变，最常见的事错义突变，主要是结构上的碱基发生转换或颠换引起氨基酸序列的改变。其次，还有二次移码突变、结构基因末端缺失突变等。温敏突变株的筛选方法（1）温敏突变株的诱发（2）富集（3）分离筛选（二）富集TS突变株的出现频率极低，仅有0.1%左右。为了提高筛选概率，诱变后的菌悬液先要进行富集。富集方法有抗生素法、物理方法、H3-前体法等。1.抗生素法这是常用的方法，其原理与营养缺陷型抗生素浓缩法相同。细菌类采用青霉素法,真菌类采用制霉菌素法。方法是：将诱变后的菌体在非许可温度下，培养一定时间后，加入抗菌素，此时可杀死或杀伤在该温度下生长的野生菌，不可能杀死在同样温度条件下未曾生长的TS突变株，离心去除抗生素，进行分离。2.过滤或离心法某些TS突变株是DNA复制缺损或孢子萌发缺损的突变株，它们在非许可温度下培养到一定时期，细胞伸长成丝状，或芽枝不脱离母细胞，致使比重增加，因而可用薄膜过滤或密度梯度离心等方法富集达到与野生菌株分开的目的。3.H3-前体法如果要富集某种大分子合成缺损的TS突变株，可以加入相应的H3-前体物质即可达到目的。（三）分离筛选菌体经过富集以后，可以制成一定的稀释度，分离于平板。TS突变株的筛选方法比较简单，主要根据菌体在高于或低于最适生长温度5—15℃的生长状态。各类微生物突变株的温度范围大约为：细菌为30—40℃（30℃为许可温度，40℃为非许可温度，下同）。放线菌为30—38℃，酵母菌为23—36℃。可用常规法和特殊法进行筛选。1.常规法2.特殊分离筛选方法分离筛选的方法经过富集后的菌体细胞分离在完全培养基上，置于许可温度下培养，当长出菌落之后，用平板影印法（见图6.17）将菌落分别复印到一个完全培养基上和两个基本培养基各一皿，置于非许可温度下培养，另一组取完全培养基和基本培养基各一皿，置于非许可温度下培养，培养后根据菌落生长情况，可以分为两大类：1.常规法一类是非必需基因突变形成的温敏突变株，在许可温度下的基本培养基上生长，说明该类突变株从完全培养基中补充了某种生长因子后才得以生长，是一类突变引起失去单一酶但可以补偿功能的TS突变株。另一类是由必需基因突变引起的TS突变株，在许可温度的基本培养基上生长，而非许可温度的基本培养基上都不生长，说明该类突变株即使从完全培养基内提供了某种生长因子也无法补偿失去的功能。通常TS突变株是指后一类。假如在许可与非许可温度下基本培养基和完全培养基上全部生长，则为野生菌株。将诱变处理后的菌体直接涂布于，先在非许可温度下培养，长出菌落作记号，即为野生型菌株，然后再置于许可温度下培养，长出新的菌落，即为TS突变株。通过以上方法检出的TS突变株要进一步复征，然后纯化。2.特殊分离筛选方法

如要具体获得具有特定性能TS突变株，要灵活巧妙的设计富集方法和平板培养基组成。例如:1要获得由甲醇和甘氨酸合成高产的丝氨酸菌株，先通过诱变因子处理，从中筛选出丝氨酸降解代谢障碍的TS突变株，但要排除C4二羧酸分解代谢障碍TS突变株。为此，Moringga先用甲醇为碳源，筛选得到有关的TS突变株，然后从中进一步筛选丝氨酸突变菌株，即把以上温敏突变株移接到含有琥珀酸的培养基上培养，淘汰在琥珀酸上生长良好的突变株，以提高筛选效率。

2造成单细胞蛋白质中蛋氨酸含量高的TS突变株的主要原因：第一是遗传密码翻译期间发生错误的内在因素；第二是高温引起碱基错配的外界因素。因此，筛选这种突变株时，可以在分离培养基中增加蛋氨酸的浓度，增加错误转译机会。

具体方法:把菌体涂布于基本培养基上，限置于许可温度下培养，而后在转移到0.2%蛋氨酸的基本培养基上,放置于非许可温度下培养