藏药丹珍头痛胶囊研制课题的汇报(完成)

藏药‘‘丹珍头痛胶囊”研制课题的汇报报告人：陈寒杰1立项背景本方剂以传统藏药“八珍颗粒”为基础，由青海省人民医院临床中医师、药师在积累多年临床实践基础上拟定的加减经验方，经二十多年的临床应用、具有疗效显著，标本兼治、安全无毒、综合效果优于国内同类的中、藏药产品的复方胶囊制剂。2项目来源自行选题，按照国家新药研发GLP、GCP标准及卫生部《新药(中药)临床研究指导原则》制订的标准进行工作、GMP管理规范进行工艺验证和药品生产。3研究方案设计按卫生部《新药审批办法》三类新药申报要求进行本项目的研究方案设计。I期临床研究→生产工艺研究→质量标准研究→临床研究申报→II→III期临床研究→生产申报→试生产→生产→销售4课题组主要成员及分工(一）5课题组主要成员及分工(二）6研究内容及主要技术指标7研究内容临床前期的毒理学试验研究：（统计学使用X2检验）生产工艺研究及产业化的生产工艺验证：（统计学方法使用正交试验法及方法学研究）质量标准及其研究：（统计学使用方法学研究）主要药效学研究：（统计学使用X2检验）

临床研究：（统计学使用X2检验）药品的稳定性和有效期研究：(室温考察）

8一、临床前期的毒理学试验研究（统计学使用X2检验）9选用健康昆明种小鼠40只，雌雄各半，于7小时内分3次灌服丹珍头痛胶囊的水溶液，限于药物浓度和给药的体积不能再增大，测得其最大耐受量（g/kg）体重，相当于成年人日服剂量X倍；观察毒性反应和死亡现象（LD50，ED50）。急性毒性试验方法10急性毒性试验结果经大鼠急性毒性实验，结果表明测得其最大耐受量为247.8（生药）g/kg体重，相当于成年人日服剂量的1034.5倍未发现任何毒性反应和死亡现象。11长期毒性试验选用SD大鼠（体重70—100g）雌雄各半，按性别及体重随机分为四组，每组30只，前三组做为给药组，灌服的剂量分别为成人日服剂量的160倍，112倍，85倍，第四组为对照组，灌服等体积的纯化水，于灌服45天，90天及停药10天，各组随机取杀10只，进行血常规，肝，肾功能检测，并对心，肝，脾，肾，脑，肾上腺，胸腺，性腺等重要器官进行组织形态学检查。12将健康SD大鼠，按体重，性别随机非为4组，每组30只，前三组份未、高、中、低剂量给药组，分别灌服丹珍头痛胶囊30.0、25.0、20.0g/kg(分别相当于临床承认拟日服剂量的160倍、112倍、85倍)，每日灌服药物一次，连续90天，第四组未空白对照组灌服对等体积纯化水。各组动物均于20±2℃室内常规饲养，各组动物分别于给药前及给药期间每隔10天称动物体重一次，并按各组动物的体重增长调整一次给药量，连续给药45天，于最后一次给药后24小时，各组分别随机取杀大鼠10只，进行血常规（HGB、RBC、WBC、WBC分类计数）以及肝功能（ALT、AST、TTT、Fpro、A）和肾功能（BUN、Cr）等项目的检查。13技术指标（一）丹珍头痛胶囊对大鼠肝功能影响的实验（x±s,n=10）检验指标:ALT(u/L)、AST(u/L)、TTT单位、Fpro（g/L)、A（g/L)；与空白对照组相比较，经统计学处理，计算p值。丹珍头痛胶囊对大鼠肾功能的影响实验（x±s,n=10）检验指标:BUN（mmol/L）、Cr(mmol/L）；与空白对照组相比较，经统计学处理，计算p值。丹珍头痛胶囊对大鼠血常规的影响实验（x±s,n=10）检验指标:RBC（X10/L）、HGB(g/L)、WBC)(X10/L)、WBC分类计数（%）LYM、MO、GRAN；与空白对照组相比较，经统计学处理，计算p值。14丹珍头痛胶囊对大鼠重要器官组织形态学之幼年大鼠体重增长的影响实验（x±s,n=10）检验指标:体重W（g）;与空白对照组相比较，经统计学处理，计算p值。丹珍头痛胶囊对大鼠重要器官组织形态学之幼年大鼠饲料消耗量的影响实验（x±s,n=24）检验指标:体重W（g）;与空白对照组相比较，经统计学处理，计算p值。丹珍头痛胶囊对大鼠重要器官组织形态学之大鼠每100g体重的脏器比重量的影响实验（x±s,n=30）检验指标:每100g体重的脏器比重量W（g）；与空白对照组相比较，经统计学处理，计算p值。

15毒理学研究结果（一）丹珍头痛胶囊对大鼠肝功能影响的实验

时间组别nALT(u/L)AST(u/L)TTT单位Fpro（g/L)A（g/L)45天高剂量组中剂量组低剂量组空白对照组1010101035.40±9.8036.21±7.0037.30±6.5038.40±9.1092.80±11.8082.40±10.8096.40±9.0194.30±11.001.32±0.601.20±0.420.92±0.171.02±1.1290.2±9.0293.40±8.7086.10±9.2788.40±22.6034.60±2.9035.10±2.3034.40±3.0536.70±3.1090天高剂量组中剂量组低剂量组空白对照组1010101036.10±3.4037.80±11.0036.80±11.0036.80±7.21109.40±8.40111.40±18.40110.40±14.70110.40±17.300.87±0.250.90±0.100.87±0.260.87±0.3489.44±4.2190.10±4.6291.00±6.0491.00±6.4032.30±3.4334.60±3.0032.00±2.2732.00±3.25停药10

高剂量组中剂量组低剂量组空白对照组1010101047.20±8.0037.80±11.0036.80±11.0036.80±7.21110.40±41.00111.40±18.40110.40±14.70110.40±17.300.56±0.320.90±0.100.87±0.260.87±0.3487.20±3.2790.10±4.6291.00±6.0491.00±6.4027.40±3.2729.00±2.3228.20±5.2728.70±2.61由表可见，给大鼠灌服丹珍头痛胶囊45天，90天及停药10天各组动物的肝功能各项指标均在正常生理范围内。与空白对照组比较，均无显著性差异，（p＞0.05）。结果表明该药对大鼠肝功能无明显毒性损害。16毒理学研究结果（二）丹珍头痛胶囊对大鼠肾功能的影响实验

时间45天90天停药10天组别BUN（mmol/L）Cr(mmol/L）BUN（mmol/L）Cr(mmol/L）BUN（mmol/L）Cr(mmol/L）高剂量组中剂量组低剂量组空白对照组8.80±1.707.80±1.208.80±2.008.30±1.3063.80±7.0063.40±9.4065.60±8.6064.30±9.707.40±1.407.80±2.308.30±2.928.70±2.2787.40±13.2089.20±18.3084.60±11.4082.10±14.007.90±1.407.80±1.207.60±1.207.90±1.1073.40±7.7080.30±7.0478.20±8.1076.40±15.20由表可见，给大鼠灌服丹珍头痛胶囊45天，90天及停药10天，对动物的BUN和Cr无明显影响，与空白对照组比较，均无显著性差异，（p＞0.05）。结果表明该药对大鼠肾功能无明显毒性损害。17毒理学研究结果（三）丹珍头痛胶囊对大鼠血常规的影响实验组别天数RBCHGBWBC)WBC分类计数（%）（×10/L）(g/L)(×10/L)LYMMOGRAN45高剂量组中剂量组低剂量组空白对照组7.4±0.67.0±0.47.3±0.47.0±0.6159.7±10.4157.2±5.0150.3±9.4151.7±9.218.2±6.118.3±5.818.7±0.620.0±6.774.0±3.977.0±7.579.0±7.578.0±6.313.8±3.112.1±1.410.5±2.211.4±0.612.2±2.010.9±6.810.5±6.410.6±2.190高剂量组中剂量组低剂量组空白对照组9.96±0.629.80±0.809.73±0.409.64±0.72183.3±11.2176.4±10.0176.8±8.3175.70±12.420.5±7.818.2±4.921.4±4.6019.20±4.7075.0±6.978.5±7.977.0±7.278.2±5.112.0±2.68.7±3.210.5±2.49.75±2.013.0±6.712.8±7.312.5±9.212.1±3.0停药10

高剂量组中剂量组低剂量组空白对照组9.90±0.609.70±0.839.5±0.609.04±1.90178.60±42.30170.80±12.00176.7±15.4178.2±14.018.2±6.421.5±7.918.0±3.817.5±4.279.0±7.275.4±3.973.3±8.778.4±8.212.4±2.514.7±2.910.4±3.611.3±1.78.60±7.729.90±2.4010.1±8.79.3±6.9由表可见，连续给小鼠灌服丹珍头痛胶囊45天，90天和停药10天，实验组与对照组各项指标均在正常生理范围内，实验组与对照组比较无显著性差异（p>0.05），结果表明该药对大鼠血常规无明显毒性损害。18毒理学研究结果（四）丹珍头痛胶囊对幼年大鼠体重增长的影响实验组别给药时间（天）高剂量给药组中剂量给药组低剂量给药组空白对照组给药不同时间体重给药前88.3±19.087.9±20.087.0±19.587.1±19.410135.7±24.5175.1±22.0166.9±24.4134.3±22.020148.6±38.4181.7±28.0151.2±31.3142.3±36.830173.3±36.7184.3±25.0177.7±40.2167.9±35.440194.5±43.5199.1±28.0196.9±54.7188.3±39.050213.7±49.5233.1±41.022.3±39.8211.4±36.660213.5±43.75233.50±40.04240.8±38.8227.3±39.370242.6±60.8255.8±36.0252.4±50.2239.6±44.080253.7±60.8275.8±41.0267.7±53.3246.3±47.490270.5±53.8298.7±36.0279.6±70.2251.5±47.4停药10294.5±66.7305.4±44.06296.7±70.8277.4±97.6由表可见，给动物灌服丹珍头痛胶囊后高，中，低剂量对幼年大鼠的体重正常增长无明显影响，高，中，低剂量组动物长期服用该药物对体重无明显影响。

19毒理学研究结果（五）丹珍头痛胶囊对幼年大鼠饲料消耗量的影响实验组别次数饲料消耗量(g/24h/只）由表可见，给大鼠连续灌服丹珍头痛胶囊后，对高，中，剂量组动物24小时饲料消耗量无明显影响，与空白对照组向比较，经统计学处理，无显著性差异。

高剂量组中剂量组低剂量组空白对照组777717.7±2.019.2±2.120.4±3.418.3±2.5丹珍头痛胶囊对对大鼠每100g体重的脏器比重量的影响实验脏器（g）高剂量给药组中剂量给药组低剂量给药组空白对照组由表可见，连续灌服丹珍头痛胶囊后90天，各给药组大鼠的脏器比重量与空白对照组比较均无显著性差异（p>0.05）心0.63±0.140.52±0.080.68±0.240.63±0.14肝3.24±0.432.98±0.293.40±0.573.21±0.63脾0.38±0.100.32±0.070.36±0.080.39±0.06肺0.99±0.240.90±0.171.30±0.381.12±0.28肾0.73±0.050.69±0.050.79±0.120.81±0.14胸、腺0.14±0.040.15±0.060.09±0.020.08±0.04肾上腺23.74±6.8223.43±7.8424.07±8.7423.04±11.24脑0.82±0.160.74±0.130.87±0.240.86±0.2320毒理学研究结论（一）经大鼠长期毒性实验，结果表明，连续较大剂量（成人临床日服剂量的160倍，112倍，85倍）及较长疗程（90天）对幼年大鼠体重增长无明显影响；对大鼠肝，肾功能及血常规无毒性损害；对大鼠24小时饲料消耗亦无明显毒性影响；组织形态学检查结果表明，对重要的脏器亦无明显毒性损害，上述结果表明，较大剂量，较长疗程服用丹珍头痛胶囊毒性低，口服安全，可以提供临床使用。灌服丹珍头痛胶囊溶液后45天，95天及停药10天进行的血常规（Hb,WBC,RBC）测定，各组与对照组均无明显差异p>0.05.丹珍头痛胶囊高，中，低剂量连续给药90天取杀大鼠，剖取心，肝，脾，肺，肾，脑等组织块，常规固定，包埋，切片，HE染色，光镜检查，动物组织处理过程相同，实验大鼠各器官取材于同亦部位，检查结果如下：21心：心肌纤维横纹清晰，细胞分化良好，无肌凝，肌液及空泡变性。肝：肝小叶结构清晰，肝细胞呈索条状排列，细胞分化良好，无浊肿，空泡变性及坏死，肝窦扩张，亦无枯否细胞增生。肾：未见肾小管变性坏死，间质无出血或炎症，无浊肿及各种管形。肺：无充血，水肿，出血和炎症反应。脑：神经元，胶质，脑膜均无特殊变异。睾丸：曲细精管内精原细胞到初级精母，次级精母以至精虫的发生及间质细胞均无异常改变。毒理学研究结论（二）22毒理学研究结论（三）

对肝，肾功能，血常规无明显影响。组织形态学检查结果表明，大剂量，长期服用丹珍头痛胶囊与空白对照组向比较，未发现对大鼠心，肝，脾，肺，肾，脑，睾丸等重要的生命器官无毒性损害。结果表明：该药无明显毒副作用，可安全提供临床应用。23二、生产工艺及其研究（统计学研究应用正交法L34—三因素三水平进行方差统计分析及方法学研究）及产业化的生产工艺验证（依GMP管理规范进行）24生产工艺25制法以上十二味药材，加85％乙醇回流提取二次，每次1小时，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩成浸膏；药渣加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，浓缩成浸膏；合并上述浸膏，在60～80℃干燥，粉碎，加入淀粉，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。26工艺研究1工艺合理性研究2．胶囊规格的选择、稳定性试验、中试产品研究3．确定生产工艺流程。27工艺合理性研究1.剂型选择

2.提取工艺的设计及研究3．提取液浓缩工艺的确定4.制剂成型性研究5.胶囊规格的选择、成型工艺的确定28技术路线与技术指标(一）提取工艺设计方案(正交试验)技术指标：用85％乙醇，以浸膏得率和正丁醇浸出量为考察指标，采用正交试验对乙醇浓度、加醇量和提取时间进行考察。水提取,以浸膏得率为考察指标，采用正交试验对提取压力、提取时间和加水量进行考察。29技术路线与技术指标(二）浓缩工艺的确定技术指标：干燥方法（烘干法、真空干燥）对正丁醇浸出量的影响干燥温度（℃）、干燥时间（h）、正丁醇浸出量（g）、浸膏得率（%）30技术路线与技术指标(三）制剂成型、胶囊型号的工艺研究技术路线与技术指标：休止角测定方法：用固定漏斗法进行测定，计算休止角（tanα=H/R）。吸湿性测定方法：按下式计算吸湿百分率。吸湿率=（吸湿后药粉重量—吸湿前药粉重量）/吸湿前药粉重量×100%干粉粒的堆密度的测定堆密度=颗粒重量（g）/药粉所占体积（ml）31生产工艺研究方法及结果321.剂型选择本方剂源于以传统藏药“八珍颗粒”为基础，由青海省人民医院临床中医师、药师在积累多年临床实践基础上拟定的加减经验方，经二十多年的临床应用、效果显著。经系统的实验研究而创制的以中、藏、联合组方的具有补营血，散虚滞平肝熄风，散瘀通络，解痉止痛，扩张血管，降低血液粘度，改善微循环作用，主治血管性头痛，高血压和脑外伤后遗症引起的头痛等，用于肝阳上亢，瘀血阻络所致的头痛，背痛颈酸，烦燥易怒症状等效果为一体的中、藏药组方，具有疗效显著，标本兼治、安全无毒、综合效果优于国内同类西药、中药、藏药产品。临床因胶囊剂具有生物利用度高，稳定性好，携带、服用方便的优点，故制成胶囊剂。332.提取工艺的设计及研究根据各药材有效成分及本方中主要功能，为保证各药材有效成分的提取，丹珍头痛胶囊的制备工艺设计为：采用乙醇、水提取工艺。34醇提工艺的正交试验表（一）

因素水平乙醇浓度（%）加醇量（倍）提取时间（h）ABC1709、82.0、1.52857、61.0、1.03955、41.0、0.5因素水平表用L9(34)正交表安排试验，称取上述十二味药材混粉100g，按正交表试验，过滤，滤液合并，测量体积。试验编号ABCD浸膏正丁醇浸出量1234（%）（g）1111116.354.672122215.414.663133314.064.214212315.214.795223114.484.536231214.234.547313213.894.198321314.844.759332113.394.57K145.8245.4545.4244.22G=140.86CT=G²/9=2204.616SS=(K1²+K2²+K3²)/3-CT浸K243.9244.7344.0143.53K342.1241.6842.4344.11膏SS2.2822222.6704221.4916220.091622R3.703.772.990.69正K113.03813.92413.96013.768G=636.86CT=G²/9=45065.63丁K213.87113.94214.02213.667醇K313.77714.32014.20413.751浸SS1.9649568.35532213.827820.194956物R3.336.228.181.0135醇提工艺的正交试验表（二）

浸膏得率方差分析表

正丁醇浸出量方差分析表36提取工艺的研究根据处方分析，为达到十二味药材中药效成分的最大程度的抽提，选择用85％乙醇提取，以浸膏得率、正丁醇浸出量为考察指标，采用正交试验对乙醇浓度、提取时间和加水量进行试验及验证。结果取同批药材按A2B2C2工艺条件试验，测得浸膏得率分别为15.92、16.25、16.05%，平均值为16.07%，正丁醇浸出量分别为4.26、4.16、4.20g，平均值为4.21g。以上数据中正丁醇浸出量与正交考察试验中的最大值相近。故确定最佳工艺A2B2C2。2.1醇提工艺的正交试验

37水提工艺的正交试验表(一)因素水平压力A提取时间（h）B加液量（倍）C1常压1，15，420.5kg/m21.5，1.56，531kg/m22，27，6因素水平表用L9(34)正交表安排试验，称取上述十二味药材混粉的醇提药渣100g，按正交表试验，过滤，滤液合并，测量体积。38水提工艺的正交试验表(二)丹珍头痛出膏率（%）方差分析表由表中极差R值大小显示，以浸膏得率为考察指标时，各因素作用主次为B>C>A，方差结果表明，B因素的影响具有显著性的意义（P<0.05），A、C因素的影响没有显著性的差异（P>0.05），以A1B3C3组合为佳。故选择A1B3C3组合为最佳工艺，即常压下，提取时间2，2小时，加液倍数7，6倍。392.2水提工艺的正交试验在确定用水提取二次的前提下，以浸膏得率为考察指标，采用正交试验对提取压力、提取时间和加水量进行考察及验证。结果取同批药材按A1B3C3工艺条件试验，测得浸膏得率分别为7.02、6.87、7.11%，平均值为7.00%。以上数据中，浸膏得率为较高值。故确定最佳工艺A1B3C3。402.3醇提取液浓缩工艺的确定

醇提取液回收乙醇时的温度约为80℃，减压浓缩时，温度约为60℃，为了减少清膏的损失，不宜浓缩过稠，故确定浓缩至相对密度1.25~1.30（60℃）的清膏，备用。干燥方法烘干法真空干燥干燥温度（℃）607080607080干燥时间（h）48382416108正丁醇浸出量（g）4.373.773.335.035.635.55浸膏得率（%）15.9215.8616.0415.9815.8415.81412.4清膏干燥工艺的确定

由测定结果得知，真空干燥明显优于烘干法，70℃真空干燥时间较短，且正丁醇浸出量损失较少，故选择70℃真空干燥（-0.07~-0.08MPa）。422.5.1制剂成型性研究（一）应用休止角测定方法(用固定漏斗法进行测定)和吸湿性及干粉粒的堆密度的测定方法进行研究,结果表明，在改善流动性和降低吸湿性方面，加了辅料的粉末优于原浸膏药粉，加入含有微粉硅胶的辅料流动性略好，故选择淀粉+微粉硅胶（1∶1）作为辅料。432.5.1制剂成型性研究（二）吸湿百分率计算公式吸湿率=吸湿后药粉重量—吸湿前药粉重量×100%吸湿前药粉重量休止角及吸湿率测定结果样品名称休止角吸湿率（%）R（cm）α06（h）12（h）24（h）36（h）48（h）60（h）72（h）混合药粉1.0643.334.528.9512.1615.2417.2118.9219.14药粉-A（9∶1）1.2438.883.667.039.8111.6213.3714.8215.31药粉-B（9∶1）1.2239.343.957.8610.5412.0513.6415.5116.41药粉-C（9∶1）1.2438.883.847.4810.2811.8813.5415.5915.94A：淀粉+微粉硅胶（1：1）；B：淀粉：C：淀粉+微粉硅胶（1：2）吸湿性测定结果图1.药粉2.淀粉+微粉硅胶（1∶1）3.淀粉4.淀粉+微粉硅胶（1∶2）442.5.2胶囊型号的选择根据对浸膏的得率及辅料的用量，堆密度测定结果及胶囊试装结果，可灌入0号胶囊，每粒约0.5g，制成约9-12粒，可以满足临床要求的服用量，分3次服用，每次3粒）。452.5.3成型工艺的确定

根据12味药的混合浸膏粉量450g、淀粉25g、微粉硅胶25g、其量考察结果，可确定丹珍头痛胶囊的制剂处方如下：混合浸膏粉约450g、微粉硅胶约25g、淀粉约25g；总量共约500g。462.6中试研究

制定丹珍头痛胶囊的制备工艺，并进行放大20倍的中试研究。结果表明，三批样品的产品得率均在95%以上，主要工艺数据和质量检验数据较为接近，表明本生产工艺稳定，可行。472.7生产工艺流程图

48生产工艺研究结论依GMP管理规范进行的药品生产及产业化的生产工艺验证结果表明，本生产工艺适合药品大生产和保证药品质量及药品有效期的要求。49三、质量标准及其研究（统计学使用方法学研究）50采用先进的TLC（薄层色谱法）、HPLC（高效液相色谱法等分析方法进行研究。进行了样品处理、线性回归、精密度试验、重复性试验、稳定性及加样回收试验及样品测试试验的方法学研究。建立以芍药、丹参的薄层色谱法（TLC）；以测定有效成份芍药苷、内控指标成分丹参中丹参酮ⅡA含量的高效液相色谱法（HPLC）、以用正丁醇作溶剂，测定浸出物的含量

。51起草并制定了生产用药品的原料（药材）的质量标准。起草并制定了成品的质量标准并进行及中试产品、产品的药品质量检验，产品经检验符合规定。补充起草并制定了成品的内控质量标准并进行产品的药品质量检验，产品经检验符合规定。523.1药品的原料（药材）的质量标准研究

药品的原料（药材）的质量应符合《中国药典》2000年版一部、《青海省药品标准》各项下有关规定。533.2药品成品的质量标准研究按中国药典药品质量标准项目及格式进行试验及起草，其项目包括：名称、处方、制法、性状、鉴别、检查（包括水份、装量差异、崩解时限、重金属及砷盐）、浸出物、含量测定、功能与主治、用法与用量、规格、禁忌、注意事项、贮藏、有效期等。54技术路线与技术指标（一）

1）供试品溶液提取溶媒及方法的选择：甲醇超声处理、水超声处理、氯仿超声处理；过聚酰胺柱、D101大孔树脂柱、中性氧化铝柱等。2）供试品溶液提取时间及提取次数的选择：选择不同的超声时间（20、30、40、60分钟），用正丁醇振摇提取时选择不同的提取次数（3、4、5次，每次25ml），考察对含量的影响。55技术路线与技术指标（二）3）实验溶液配制精密称取五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得；取本品装置差异项下的内容物，混匀，取约0.4g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，置分液漏斗中，用正丁醇提取四次，每次25ml，合并正丁醇提取液，蒸干，用甲醇溶解，并转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；阴性对照溶液的制备取缺白芍的丹珍头痛胶囊阴性模拟制剂，同供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。56技术路线与技术指标（三）4）色谱条件与系统适用性试验色谱柱：KromasilKP100-5C18；柱温：35摄氏度；流速1.0ml/min；流动相：甲醇-水（25：75）；检测波长：230nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。；丹参酮ⅡA以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水（65：35）为流动相；柱温25℃；检测波长为270nm。理论板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于2000。5）线性范围测定计算回归方程：Y=aX+c，及r值。6）精密度试验：精密吸取对照品溶液，按上述色谱条件重复进样5次，每次10μl，测定芍药苷、丹参酮ⅡA峰面积积分值，以峰面积积分值计算。57技术路线与技术指标（四）7）稳定性试验：取同一供试品溶液，按上述色谱条件，每小时进样10μl，测定芍药苷、丹参酮ⅡA峰面积积分值，以峰面积积分值计算。8）重现性试验：取同一批号样品5份，分别制成供试品溶液进行测定，每份样品连续进样2次，测定并计算芍药苷、丹参酮ⅡA含量。9）回收率测定：取样品、芍药苷、丹参酮ⅡA对照品适量，照正文方法分别制备供试品溶液。在上述色谱条件下进行含量测定，计算加样回收率。10）样品测定58薄层色谱图（TLC）芍药药材的薄层特征鉴别注：从左至右依次为对照品－芍药苷阴性对照供试品20060308供试品20060704供试品20060705高原丹参药材的薄层特征鉴别注：从左至右依次为对照品－丹参酮Ⅱ阴性对照供试品20060308供试品20060704供试品2006070559高效液相色谱图一（HPLC）芍药苷色谱图丹珍头痛胶囊色谱图丹珍头痛胶囊阴性色谱图60高效液相色谱图二（HPLC）丹参酮ⅡA色谱图丹珍头痛胶囊色谱图丹珍头痛胶囊阴性色谱图61线性工作曲线

62质量标准研究结果（一）1采用先进的薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）浸出物测定等分析方法进行方法方法学系统研究。对样品进行样品处理、线性回归、精密度试验、重复性试验、稳定性及加样回收试验及样品测试等试验。2薄层色谱法（TLC）进行芍药、丹参的薄层色谱法鉴别试验，结果表明重现性好，灵敏度高，方法简单，阴性对照试验无干扰。3正丁醇浸出物试验结果表明：照水溶性浸出物测定法项下的冷浸法，以用正丁醇作溶剂，测定浸出物。经十批样品测定结果，十批样品浸出物按干燥品计算在3.03%～7.25%之间，标准规定为正丁醇浸出物应不得少于3.0%。63质量标准研究结果（二）4重金属、砷盐：按《中国药典》2000年版一部附录重金属检查法项下方法二、砷盐检查法项下第一法的规定对三批样品进行测定，结果表明其重金属含量以标准铅计不超过10ppm、砷含量低于2ppm。故此项暂不列入正文。5含量测定研究结果:对方中芍药的有效成分芍药苷采用高效液相色谱法进行含量测定；内控标准增加测定丹参的有效成分

采用高效液相色谱法进行含量测定。64质量标准研究结果（三）1)线性回归试验：芍药苷进样量在0.0956-0.4780mg范围内呈良好线性关系，计算回归方程：Y=0.0008X+0.0109，r＝0.9997。2)精密度试验：芍药苷RSD（%）为90.97（n=5）结果表明：精密度良好。3)稳定性试验：芍药苷RSD（%）为1.9（n=7）结果表明：供试品溶液12小时内稳定性良好65质量标准研究结果（四）4)重现性试验：供试品溶液平均含量测定1.404（mg/粒），RSD（%）1.96(n=10)结果重现性良好。5)加样回收率测定：平均回收率为97.7%，RSD为1.58%测定结果符合要求，方法可行。6)样品测定：样品中芍药苷含量测定结果芍药苷为含量1.72~1.76（mg）RSD（%）1.5~2.0（n=4）66质量标准研究结论质量标准研究结果表明，本标准能准确地反映药品内在的品质，符合药品生产需求和质量控制，采用方法先进，确保药品有效、质量稳定。结果显示：其检测验方法科学，结果可靠，方法准确，灵敏，稳定性及重现性好。

芍药苷的含量测定结果为1.28～1.84mg/500mg之间，标准规定本品每粒含白芍以芍药苷(C23H18O11)计，不得少于1.2mg/500mg

。丹参酮ⅡA含量测定结果在17.3～44.9（ug/粒）范围内，标准规定本品每粒含含丹参以丹参酮ⅡA（C19H18O3）计，不得少于15ug。67四、主要药效学研究（统计学使用X2检验）68丹珍头痛胶囊具有补营血、散虚滞、平肝、熄风、解痉止痛、扩张血管、降低血液粘度、改善微循环的作用，主要用于血管性头痛、高血压和脑外伤后遗症等引起的头痛等症，采用扭体法和热板法镇痛实验,对小鼠耳廓微循环的影响实验，抗血栓形成等药效学实验，为临床验证提供依据。69研究内容1.丹珍头痛胶囊的镇痛实验研究1.1扭体法镇痛实验1.2热板法镇痛实验2丹珍头痛胶囊对大鼠血栓形成的影响研究3丹珍头痛胶囊对小鼠耳廓微循环的影响研究70实验材料及动物药物:丹珍头痛胶囊：由青海省人民医院制剂室提供；阳性对照药物：镇脑宁胶囊：批准文号（92）卫药准字Z—19号。试验动物：ICR小鼠（一级）；Wistar大鼠（一级）。71分组取19-21gICR健康小鼠100只，随机分为5组，20只为一组，雌雄各半，其分组及给药剂量如下：第一组：空白对照组：给以等量纯化水；第二组：镇脑宁胶囊组，给以镇脑宁胶囊1.44g药品/kg（相当于临床一日用量20倍）；第三组：丹珍头痛高剂量组，给以丹珍头痛2.4g药品/kg（按轻症用量计相当于临床一日用量20倍）；第四组：丹珍头痛中剂量组，给以丹珍头痛1.2g药品/kg（按轻症用量计相当于临床一日用量10倍）；第五组：丹珍头痛胶囊低剂量组，给以丹珍头痛0.06g药品/kg（按轻症用量计相当于临床一日用量5倍）。72研究方法及技术指标73丹珍头痛胶囊的镇痛实验研究（一）扭体法镇痛实验技术指标：镇痛百分率（%）=（空白对照组扭体反应鼠数--给药组扭体反应鼠数）/（空白对照组扭体反应鼠数×100%）74丹珍头痛胶囊的镇痛实验研究（二）试验方法：每天灌胃给药一次，连续给药七天，于末次给药30min后各鼠腹腔注射0.5%醋酸0.2ml/只，观察10min内各组出现扭体反应的小鼠只数，小鼠扭体反应表现腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高等，计算各组镇痛百分率。75丹珍头痛胶囊的镇痛实验研究（三）热板法镇痛实验技术指标：测定小鼠痛阈值。试验方法：①调节恒温水浴：将水浴槽加满水，使水面接触热板，调节恒温装置使水温控制在55±0.5℃。76丹珍头痛胶囊的镇痛实验研究（四）②筛选合格小鼠：取19-22gICR雌性小鼠120只，每次将一只小鼠放置在恒温55±0.5℃的热板上，室温控制在15-18℃，以小鼠接触热板到出现舔后趾所需时间为该鼠痛阈值。凡舔后足时间小于5秒或大于30秒或跳跃者弃之不用，挑选合格小鼠100只，随机分为5组，重复测其正常能阈值，取两次正常痛阈平均值，作为该鼠给药前痛阈值。分组及灌胃给药剂量同扭体法镇痛实验。③观察药物镇痛作用：按不同分组剂量给药，给药后30min、60min、90min分别再测定小鼠痛阈值。如小鼠60秒钟仍无反应，将小鼠取出，以免烫伤，其痛阈值以60秒计。给药后痛阈值（S,X±SD）。77丹珍头痛胶囊对大鼠血栓形成的影响研究技术指标：测定血栓形成时间（min）。试验方法:取体重200±20gWistar雄性大鼠100只，按体重随机分为5组，每组20只。每天灌胃给药一次，连续给药10天，停药当日禁食，次日大鼠以25mg/ml戊巴比妥钠0.2ml/100g（体重）腹腔注射麻醉，然后用实验性体内血栓形成测定仪测定血栓形成时间（min）。78丹珍头痛胶囊对小鼠耳廓微循环的影响研究（一）

技术指标：廓微循环细动脉（A）(μm)口径、细静脉（V）(μm)口径，毛细血管开放量（个/mm）采用毛细血管与1mm横线相交的交叉点来表示。（μm,X±SD，n=10）79丹珍头痛胶囊对小鼠耳廓微循环的影响研究（二）③将小鼠肌肉注射0.2g/ml乌拉坦溶液0.15ml/20g，麻醉后用医用橡皮膏轻粘轻拉去耳廓毛，然后小鼠腹部向下固定在小鼠观察台上，调节以有机玻璃制作的耳托高度，使耳廓平展在耳托上，在耳托上和耳廓表面滴加小许液体石腊。将观察台置于显微镜载物台上，调节冷光源适当亮度。在透射光下，用100倍镜观察小鼠耳廓微循环在按以上不同剂量灌胃给药前后的变化。分别记录给药后10、20、30分钟耳廓微循环细动脉（A）(μm)口径、细静脉（V）(μm)口径，毛细血管开放量，以判断微循环改善情况。血管口径采用显微测微尺测量。毛细血管开放量（个/mm）采用毛细血管与1mm横线相交的交叉点来表示。（μm,X±SD，n=1080药效学研究结果（一）1该药具有丹珍头痛胶囊具有补营血、散虚滞、平肝、熄风、解痉止痛、扩张血管、降低血液粘度、改善微循环的作用，主要用于血管性头痛、高血压和脑外伤后遗症等引起的头痛等症。2丹珍头痛胶囊能明显减少醋酸引起小鼠发生扭体反应只数，与空白对照组比较显著性差异，（P<0.01),与阳性对照组比较无差异(P<0.05);同时还能明显提高小鼠对热刺激的痛阈值,各给药组与给药前比较有不同差异,说明丹珍头痛胶囊具有明显的镇痛作用。3丹珍头痛胶囊能明显延长大鼠体内血栓形成时间（OT），各剂量组与空白对照组比较有显著性差异（P<0.01），中、低剂量组与高剂量组比较有显著性差异（P<0.01），具有一定的量效关系。高剂量组与阳性对照组比较无显著性差异（P<0.01）81药效学研究结果（二）4丹珍头痛胶囊右增加小鼠耳廓微循环细动脉（A）口径、细静脉（V）口径、毛细血管开放量，与空白对照组比较有差异。高剂量组与阳性对照组比较无差异（P>0.05）。实验结果说明丹珍头痛胶囊能明显改善小鼠耳廓微循环情况，具有促进血液循环，活血通络的作用。5通过扭体法及热板法镇痛实验，结果表明丹珍头痛胶囊能明显减少醋酸引起小鼠发生扭体反应只数，同时还能明显提高小鼠对热刺激的痛阈值，说明其具有明显的镇痛作用。6通过对小鼠血栓形成的影响及对小鼠耳廓微循环的影响实验表明，丹珍头痛胶囊能明显延长大鼠体内血栓形成时间（OT），增加小鼠耳廓循环细动脉（A）口径、细静脉（V）口径、毛细血管开放量，说明丹珍头痛胶囊有抗血栓形成，改善小鼠耳廓微循环作用，具有促进血液循环，活血通络之功效。82药效学研究结论通过丹珍头痛胶囊扭体法及热板镇痛实验，对小鼠耳廓微循环的影响实验，抗血栓形成实验，结果表明：丹珍头痛胶囊具有镇痛、改善微循环及抗血栓形成等作用，为其临床治疗作用提供了较好的药效学实验依据。83临床试验

（统计学处理使用X2检验）84根据毒理学试验，质量标准研究的结果表明，该复方制剂无明显毒性反应，可提供临床安全使用；质量标准具有可控制的特点。为此，依据卫生部《新药审批办法》中关于三类新药审批的有关规定，报请卫生厅批准在青海省人民医院对丹珍头痛胶囊进行了临床验证工作。青海省人民医院内科应用丹珍头痛胶囊治疗439例血管性头痛（中医辨证为痰浊瘀阻者）患者，同时用某国家级治疗头痛新药作对照，观察了丹珍头痛胶囊对患者的疗效及血，尿常规，肝，肾功能和血液流变学指标的影响，旨在对比观察其临床疗效及安全性。85病例选择

青海省人民医院内科选择439例血管性头痛病人，随机分成治疗组321例，对照组118例，治疗组中男性136例，占42.37%，女性185例，占57.63%；年龄最大65岁，最小18岁，年龄平均43.57岁。病程最长10年，最短0.5年，平均病程3.25年。两组性别，年龄，病程比较，经统计学处理，无显著性差异，具有可比性。排除病例标准1.虽有头痛，但作为其他病的一个症状表现，如高血压脑外伤后综合征及脑内器质性病变等患者。2.年龄小于18岁或大于65岁者，妊娠或哺乳期妇女，过敏体质及对本药过敏者。3.合并有心血管，肝，肾，造血系统等严重的继发性疾病的精神病患者。4.不符合纳入标准，未按规定用药，无法判断疗效，或资料不全等影响疗效或安全性判断者。86技术路线与技术指标（一）头痛诊断标准：①主要临床表现：反复发作或持续头痛；疼痛部位在额颞、前额、巅顶、后枕、或左或右辗转不安；疼痛性质多为跳痛、刺痛、胀痛、昏痛、隐痛或头痛如裂；头痛发作和持续时间长短不一，可以数分钟到数日不等;②发作特点：急性，亚急性或慢性起病，病发可有诱因，未发前可有先兆症状;③性别、年龄特点：好发于青壮年，女性多于男性;④经神经系统检查及理化、CT、MRT等检查可以除外的脑出血、蛛血、硬膜下水肿、肿瘤等脑内器质性病变者。纳入病例标准：符合头痛诊断标准及中医辩证分型为痰浊瘀阻头痛者，可纳入验证病例。87技术路线与技术指标（二）

治疗方法

治疗组丹珍头痛胶囊每次3粒，每天三次。十天为一个疗程。两组治疗观察期间，停用其它与本病有关的药物。症候评分标准伴随症状头痛发作次数头痛持续时间头痛程度、不痛0分无（－）0分轻度痛、但不影响活动2分轻（+）1分几次/周几个小时/次中度痛、但不停止活动4分中（++）2分重度痛、不能参加活动6分重（+++）3分疗效判断标准显效头痛程度减轻≥4，伴随症状减少≥2/3，或发作次数或疼痛持续时间减少2/3以上。有效头痛程度减轻≥2分，伴随症状减少2/3而≥1/3，或发作间隔时间延长，或头痛持续时间缩短不足2/3且减少≥1/3。无效头痛程度减轻不到2分，伴随症状减少＜1/3，或头痛持续时间缩短不到1/3，或疼痛加重理，持续时间延长。88临床试验研究结果（一）总疗效

治疗组321例血管性头痛，经用丹珍头痛胶囊治疗一疗程后，显效127例，有效160例，总有效率为89.41%；对照组118例血管性头痛，经用对照药物治疗一疗程后，显效36例，有效44例，总有效率为66.10%。两组比较治疗组总有效率明显高于对照组。组别例数显效例（%）有效例（%）无效例（%）总有效率例（%）治疗组321127（39.56）160（49.84）34（10.59）280（89.41）对照组11836（30.51）44（37.29）36（30.51）78（66.10）89临床试验研究结果（二）症候异常例数治疗组异常例数对照组显效有效有效率（%）显效有效有效率（%）头痛30010317091.00100323870.00头沉重胀28010213885.7170312971.43泛恶欲吐2201067481.8260221866.67情绪不佳2408012083.336092150.00睡眠不安2208610486.365002040.00单项症候疗效治疗组病例治疗后各单项症候均有明显改善，有效率﹥80%以上，各症候症状的疗效均优于对照组。

90临床试验研究结果（三）组别头痛例数例程度减轻例（%）次数减少例（%）时间缩短例（%）治疗组321273（85.05）240(74.77)260(81.00)对照组11872（61.02）48（40.68）66（55.93）头痛作用的比较

治疗组对于头痛程度减轻，发作次数的减少及持续时间的缩短三方面而作用均优于对照组91临床试验研究结果（四）丹珍头痛胶囊对血常规、肝肾功能的影响

检测项目治疗前治疗p值Hb（g/l）155.4±8.5159.3±9.3>0.05RBC(×10/L)5.21±0.65.45±0.9>0.05WBC(×10/L)7.65±3.17.73±2.2>0.05AST（mmol/l）23.14±4.2323.55±4.09>0.05ALT（mmol/l）22.28±4.3323.17±3.98>0.05BUN（mmol/l）5.24±1.855.49±2.93>0.05Cr（mmol/l）5.31±2.025.47±2.49>0.05治疗前后病人血常规、肝肾功能无明显改变p>0.05），表明该药对患者血常规、肝肾功能无明显影响。92临床试验研究结果（五）项目治疗前治疗后P全血粘度（比）6.18±0.565.07±0.72<0.01血浆粘度（比）1.82±0.991.65±0.99>0.05血沉（mm/H）15.32±13.0826.79±13.91<0.01RBC压积(%)0.52±0.1247.61±7.77<0.05全血还原粘度(%)9.74±0.6428.14±71.24>0.01血沉K值75.18±56.86110.99±70.24<0.01纤维蛋白原(mg%)254.93±82.89268.42±99.88>0.05血液流变学指标的测定结果

结果表明治疗前后血流变学的观察在全血粘度血球压积及血沉指标等方面有明显好转。经统计学处理p<0.01.表明该药对血管性头痛患者的血液流变学指标具有明显的调节和改善作用。93典型病例王**，女，43岁，工人，发作性右偏头疼十年，每次发作呈搏动性刺疼伴眼球胀疼，视物模糊，恶心，呕吐，烦躁不安，发作持续2-3天，服用止疼片头痛缓解。83年5月10日头痛发作，经外院治疗没有减轻，来我院就诊，查体：神志清楚，BP/89mmHg，心肺（—），神经系统（—），眼底（—），头颅片（—），脑超声波中线无偏移，脑血流图双侧波幅不对称，颈A相差50%，椎A相差40%，治疗前血液流变学检查结果：W—血粘度7.1，血浆粘度1.75，血沉3，血球压积59，还原血粘度10.3，血沉k值25..4纤维蛋白南296mg。治疗后：全血粘度5.61，血浆粘度1，73，血沉20，血球压积49，还原血粘度9.8，血沉k值88.9，纤维蛋白原255mg，服药三个疗程（30天）后治愈，复查脑血流图正常，血液流变学显著好转。94不良反应及禁忌症两组病例治疗观察期间的均未出现不良反应。因本方中马兜铃科植物细辛对肾功能可能有影响，此对肾脏病患者、孕妇、新生儿临床试验数据尚需进一步验证，暂定禁用，并定期复查肾功能。95临床试验研究结论通过临床试验观察，丹珍头痛胶囊治疗血管性头痛，中医辨证属痰浊瘀阻者：疗效确切，总有效率达91%，该药除了能显著减轻头痛程度，减少头痛发作次数，缩短头痛持续时间外，还能有效缓解头痛头胀，泛恶欲吐以及情绪不佳，不安等症，丹珍头痛胶囊治疗血管性头痛疗效优于对照药物。丹珍头痛胶囊是纯中、藏药制剂，其主要成分高原丹参，川芎，鸡血藤，菊花，当归，白芍等药具有补营血，散虚滞平肝，熄风，解痉止痛，扩张血管，降低血液粘度，改善微循环作用，主治血管性头痛，高血压和脑外伤后遗症引起的头痛。96六药品稳定性及有效期研究

室温考察97技术路线与技术指标样品及考察环境：

五批样品均为上市药品包装，0.5g/粒×12粒/板×2板/盒，PVC铝箔包装，室温放置，考察0、3、6、9、12、18、24、30、36、42、48月，测得数据。稳定性试验项目：

根据国家药品监督管理局《中药新药研究的技术要求》中的规定，该制剂应对性状、鉴别、检查（包括水分、装量差异、崩解时限）、含量测定及微生物限度检验等项目的考察。方法依据:丹珍头痛胶囊药品质量标准98稳定性试验及结果（一）规格：0.5g/粒批号：20050626存贮温度：室温日期性状薄层鉴别检查浸出物含量测定微生物限度检验芍药丹参装量差异±10%崩解时限≤30min水分≤9.0%正丁醇≥3.0％芍药苷≥1.2mg/粒杂菌≤1000个/g霉菌≤100个/g致病菌及活螨（应不得检出）2005.7.10月本品为胶囊剂，内容物为棕色或棕黄褐色粉末，味微涩、微苦检出检出符合规定203.504.001.28＜10＜10均未检出2005.10.73月本品为胶囊剂，内容物为棕色或棕黄褐色粉末，味微涩、微苦检出检出符合规定193.753.801.30＜10＜10均未检出2006.1.66月本品为胶囊剂，内容物为棕色或棕黄褐色粉末，味微涩、微苦检出检出符合规定203.753.901.30＜10＜10均未检出2006.4.59月本品为胶囊剂，内容物为棕色或棕黄褐色粉末，味微涩、微苦检出检出符合规定213.754.001.29＜10＜10均未检出2006.7.612月本品为胶囊剂，内容物为棕色或棕黄褐色粉末，味微涩、微苦检出检出符合规定204.004.101.29＜10＜10均未检出2006.10.615月本品为胶囊剂，内容物为棕色或棕黄褐色粉末，味微涩、微苦检出检出符合规定214.004.101.29＜10＜10均未检出2007.1.518月本品为胶囊剂，内容物为棕色或棕黄褐色粉末，味微涩、微苦检出检出符合规定213.803.801.29＜10＜10均未检出2007.5.622月本品为胶囊剂，内容物为棕色或棕黄褐色粉末，味微涩、微苦检出检出符合规定223.504.201.29＜10＜10均未检出2007.9.326月本品为胶囊剂，内容物为棕色或棕黄褐色粉末，味微涩、微苦检出检出符合规定203.754.001.27＜10＜10均未检出2008.1.1030月本品为胶囊剂，内容物为棕色或棕黄褐色粉