生物大分子进化总结课件

第9章生物大分子进化第9章生物大分子进化内容自然界生物大分子进化1生物大分子进化方法2生物大分子进化的概念和思路3分子多样性的建立4内容自然界生物大分子进化1生物大分子进化方法2生物大分子进化

分子库的放大5标记和区分蛋白质分子6挑选和筛选7应用实例8分子库的放大5标记和区分蛋白质分子6挑选和筛选7应用实例89.1自然界的生物大分子进化达尔文(1809～1882)

出生于英国西部一个世代为医的家庭。乘贝格尔号舰作了历时5年的环球航行，对动植物和地质结构等进行了大量的观察和采集。

9.1自然界的生物大分子进化达尔文(1809～1882)

19世纪中期，达尔文，在物种起源书中提到了进化论。物种进化的两个因素：遗传突变自然选择19世纪中期，达尔文，在物种起源遗传突变自然选择：

环境条件对于生物的变异进行选择而导致适者生存、不适者被淘汰的过程。

自然选择：

突变不被淘汰突变不被淘汰遗传信息储存在基因组中；基因组序列在自然情况下存在随机突变概率；突变可遗传给子代；增加种群的基因多样性。遗传信息储存在基因组中；优势基因频率增加进化

自然选择优势基因频率增加进化自然选择生物大分子进化DNA、蛋白质等生物大分子的功能从无到有从简单到复杂从低级到高级生物大分子进化DNA、蛋白质等生物大分子的功能自然界的生物大分子多样性和RNA世界假说自然界的生物大分子多样性和RNA世界假说生物大分子的进化基因数量庞大RNA剪切，表达产生不同的蛋白蛋白质剪切酶将蛋白质连接在一起；翻译后修饰；多样性生物大分子的进化基因数量庞大多样性RNA世界假说

DNARNA蛋白质RNA世界假说DNARNA蛋白质

1981年度诺贝尔化学奖获得者吉尔伯特（W.Gilbert）提出了“RNA世界”的假说。指的是“在生命起源的某个时期，生命体仅由RNA组成。遗传信息的传递建立于RNA的复制，其复制机理与当今DNA复制机理相似，作为生物催化的、由基因编码的蛋白质还不存在”。

1981年度诺贝尔化学奖获得者吉尔伯特（W.容易发生突变，因此在携带遗传信息的能力方面，RNA不如DNA；RNA又由于组成没有蛋白质复杂，不可能形成如蛋白质那么多样的结构，因此在功能分子的作用方面，RNA又不如蛋白质。容易发生突变，因此在携带遗传信息的能力方面，RNA不如DNA

RNA可自我复制RNA具有催化功能RNA可自我复制当DNA和蛋白质功能完善后RNA分子才被取代当DNA和蛋白质功能完善后乔伊斯，ScrippsResearchInstitute所长

发现了一对短小但功能强大的RNA序列，把它们和一堆结构更简单的RNA“原料”混在一起.结果：数量会不断倍增，几小时内就能扩增至原来的10倍，而且只要有充足的原料和空间，这种扩增过程就不会停止。

乔伊斯，ScrippsResearchInstitut问题RNA又是怎么产生的？问题RNA又是怎么产生的？9.2化学生物学中的生物大分子进化方法自然界进化的优点：生物多样性丰富，种群巨大；生物本身调控系统精密；缺点：不能定向突变；突变概率低；周期长。9.2化学生物学中的生物大分子进化方法自然界进化的优点：分子库扩增9.3生物大分子进化的基本概念和思路多样化分子进化目标分子竞争筛选分子库扩增9.3生物大分子进化的基本概念和思路多样化分子自然界生物大分子放大文库分子筛选目标分子自然界生物大分子放大文库分子筛选目标分子9.4分子多样性的建立分子多样性的建立是生物大分子进化的基础。DNA稳定性好；易操作；通过改变条件和模板就能得到不同序列和结构的DNA；可以转录和翻译变成RNA和蛋白质。9.4分子多样性的建立分子多样性的建立是生物大分子进化DNA文库的突变方法基因组随机突变易错PCR定点突变DNA改组法DNA文库的突变方法9.4.1基因组的随机突变法方法：天然随机突变物理化学诱变化学：羟胺、溴乙锭、烷基化试剂、强氧化剂等。物理：放射性诱变（紫外线）。9.4.1基因组的随机突变法方法：天然随机突变紫外线突变频率10～10天然突变频率10～10-4-9-9-10基因组的随机突变法缺点不能实现对特定基因的突变紫外线突变频率10～10-4-9-9-10基因组的随机关键突变频率的选择突变频率太高会导致绝大多数突变为有害突变，无法筛选到有益突变;突变频率太低则会导致文库中全是野生型群体。关键突变频率的选择9.4.2易错PCR

采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。9.4.2易错PCR采用DNA聚合酶生物大分子进化总结课件条件

高盐和添加剂存在的条件下，聚合酶的PCR的反应错误率可达0.7%。具体方法如提高镁离子浓度、加入锰离子；改变体系中四种的dNTPs浓度；运用低保真度DNA聚合酶等。条件9.4.3定点诱变

在体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术。分类：定点突变、盒式定点突变、PCR突变。9.4.3定点诱变在体外特异性地取代定点突变ＡＡＧＣＧ定点突变ＡＡＧＣＧ盒式定点诱变文库分子盒式定点诱变文库分子

定点突变文库筛选定9.4.4DNA改组DNAShuffling是运用随机突变技术，对某种感兴趣的蛋门质或核酸进行快速的改造，并定向选择所需性质的生物分子。

9.4.4DNA改组DNAShuffling原理单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的DNA片段。无引物PCR，具有互补3’末端的片段互为引物，各为模板，通过不断的PCR循环在不同模板上随机互补结合并进一步延伸。最后利用基因两端序列为引物合成全长的重排产物，这些重排产物的集合被称为突变文库。对突变文库进行筛选，选择改良的突变体进行下一轮shuffling循环，重复多次重排和筛选，直到最终获得性状比较理想的突变体。原理单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的DNA片进行定向进化的生物活性分子可以是那些由于毒性太大而无法大剂量使用的蛋白质药物;可以是基因治疗载体和基因药物等核酸分子。进行定向进化的生物活性分子示意图示意图FamilyshufflingFamilyshufflingDNA改组成功与否取决于三个因素：相关基因组中基因的相似程度;酶切产生的DNA片段小大;退火温度。

DNA改组成功与否取决于三个因素：优点人工理性设计DNAShuffling随机性优点人工理性设计DNAShuffling随机性同序比对同序比对9.5分子库的放大构建出的文库分子的拷贝数不高需要放大一锅法

DNA：PCRRNA：RT-PCR9.5分子库的放大构建出的文库分子的拷贝数不高PCRPCRRT-PCRRNAcDNADNART-PCRRNA9.6标记和区分蛋白质分子

蛋白质是生物体功能实现的载体，蛋白质分子不能直接放大。

需要对其标记和区分放大9.6标记和区分蛋白质分子蛋白质是生物体功能方法

目标蛋白质的基因与特殊的表达生物体结合，通过表达将蛋白质展示出来。方法目标蛋白质的基因与特殊的表达生物体结合，通

细胞展示噬菌体展示

具体方法核糖体展示

mRNA展示

细胞展示噬菌体展示具体核糖体展示mRNA展示9.6.1细胞展示将含有标签的目标蛋白的DNA导入到细胞中；挑选单克隆；诱导表达蛋白；通过特定的选择系统对蛋白质进行选择。9.6.1细胞展示将含有标签的目标蛋白的DNA导入到细胞中生物大分子进化总结课件缺点：文库的量很小；不能精确控制；缺点：9.6.2噬菌体展示

将目标蛋白的基因与噬菌体外壳蛋白基因相连接，使外源DNA所编码的蛋白质以融合蛋白形式表达在噬菌体表面的方法。9.6.2噬菌体展示将目标蛋白的基因与噬菌体外壳噬菌体感染细菌的病毒。噬菌体颗粒感染一个细菌细胞后可迅速生成几百个子代噬菌体颗粒，每个子代颗粒又可感染细菌细胞，再生成几百个子代噬菌体颗粒。如此重复只需4次，一个噬菌体颗粒便可使几十亿个细菌感染而死亡。

噬菌体生物大分子进化总结课件生物大分子进化总结课件生物大分子进化总结课件生物大分子进化总结课件9.6.3核糖体展示

蛋白及其mRNA同时结合在核糖体上，形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体，使目的蛋白展示在核糖体表面，将基因型和表型联系起来，同时含有mRNA的标签可以通过逆转录进行放大。9.6.3核糖体展示蛋白及其mRNA同时生物大分子进化总结课件

mRNA-核糖体-蛋白质三元复合物文库方便的对目标蛋白进行选择处理，通过亲和筛选的方法富集含有目标蛋白质的复合物，后对其进行放大操作。缺点：不是很稳定mRNA-核糖体-蛋白质三元复合物文库ribosomedisplayribosomedisplay9.6.4mRNA展示

mRNA展示技术一种新兴的体外多肽筛选技术。可以运用于生物分子配体的发现和相互作用的分析。

9.6.4mRNA展示原理

嘌呤霉素是一种分子质量小、化学性质为稳定的氨酰tRNA类似物。当3‘端带有嘌呤霉素连接子的mRNA在体外翻译系统中完成翻译时，嘌呤霉素模拟tRNA末端的氨酰基结构，进入核糖体的A位点，抑制了蛋白质的翻译，在新生肽链和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸之间形成稳定的酰胺键，使mRNA的3’端与多肽的羧基端共价结合起来。

原理嘌呤霉素是一种分子质量小、化学性质为稳生物大分子进化总结课件生物大分子进化总结课件9.7挑选和筛选分类：体内Invivo、体外Invitro筛选：对文库的每一个分子都进行尝试，找出目标。挑选：不需对文库的每一个分子都进行尝试，只需要设定一个条件，符合条件的分子将被挑选出。9.7挑选和筛选分类：体内Invivo、体挑选和筛选的比较体内体外筛选比较样品的颜色、荧光等物理化学性质让细胞产生各种颜色、荧光或具有放射性等挑选如共价或非共价结合在某固定相表面只表达了特异蛋白的细胞才能存活挑选和筛选的比较体内体外筛选比较样品的颜色、荧光等物理化学性10文库大小筛选：10挑选：10～10515挑选流程10文库大小515挑选流程筛选挑选优点简单快速缺点耗时需建立体系筛选挑选Conclusion定向进化=突变

+

筛选

ConclusionGene/genescodingforenzymesofinteresting突变Poolofmutantgenes转化宿主菌筛选单一突变基因的克隆好的突变进行下一轮突变突变的优良基因酶的生产和性质改进重复定向进化Gene/genescodingforenzymes9.8生物大分子进化应用实例9.8.1自然改进型分子进化

（1）绿色荧光蛋白2008年诺贝尔奖钱永健9.8生物大分子进化应用实例9.8.1自然改进型分子进下村修下村修钱永健

1994年，开始改造GFP，有多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的黄色、蓝色，有的可激活、可变色。钱永健1994年，开始改造GFP，有多项发现生物大分子进化总结课件绿色荧光蛋白分子进化DNA改组DNA文库转化细胞细胞展示体外筛选绿色荧光蛋白分子进化DNA改组DNA文库转化细胞细改进后效果发光强度增强45倍；激发光和发射光单色性有改善；进化出了黄色、红色等蛋白。改进后效果发光强度增强45倍；生物大分子进化总结课件生物大分子进化总结课件双内含肽系统纯化蛋白质原理内含肽1:SynechocystisspDnaBintein内含肽2:MycobacteriumxenopiGyrAintein

双内含肽系统纯化蛋白质原理内含肽1:Synechocys23℃pH7.0GFPmut3*双内含肽蛋白纯化过程

DTT上柱剪切洗脱15℃+IPTG

4℃几丁质柱剪切23℃pH7.0GFPmut3*双内含肽蛋白纯化过程D含cGFPmut3*表达的E.coli

激光共聚焦照片明场荧光叠加

优化的诱导表达温度：15℃含cGFPmut3*表达的E.coli激光共聚焦照片含GFPmut3*内含肽融合前体表达的E.coli

激光共聚焦照片明场荧光叠加含GFPmut3*内含肽融合前体表达的E.coli激光共亲和纯化得到的GFPmut3*SDS电泳图Lane1:蛋白MarkerLane4:Lane3上清液通过几丁质柱液后的溶液Lane2:诱导前的细胞粗提液Lane5:柱上洗脱的目的蛋白Lane3:IPTG诱导后的细胞破碎

Yield：2.41mg\LPurity：>95%

亲和纯化得到的GFPmut3*SDS电泳图纯化的GFPmut3*的光谱学特性

GFPmut3*的荧光光谱Ex=502nmEm=511nmGFPmut3*的紫外吸收光谱

纯化的GFPmut3*的光谱学特性GFPmut3GFP的结构示意图

GFPmut3*的圆二色性光谱GFP的结构示意图GFPmut3*的圆二色性光谱用途生物分子示踪金属离子、小分子的传感器研究分子成像用途生物分子示踪

（2）非天然氨基酸的定点插入定向进化tRNA和氨酰tRNA合成酶只能识别20种氨基酸识别非天然氨基酸进化（2）非天然氨基酸的定点插入定向进化tRNA和氨酰tRNA非天然氨基酸定点插入非天然氨基酸定点插入具体步骤确定目标tRNA建立氨酰tRNA合成酶文库转入细胞利用TAG作为非天然氨基酸的插入位点挑选具体步骤确定目标tRNA非天然氨基酸优点小巧，不会干扰蛋白质的正常功能；不需报告基因是蛋白质自身具有荧光功能；可识别金属离子；对pH值环境有特别响应。非天然氨基酸优点小巧，不会干扰蛋白质的正常功能；9.8.2新功能分子进化生长激素的重塑腺垂体细胞分泌的蛋白质，促进细胞生长和分化的重要因子。

9.8.2新功能分子进化生长激素的重塑受体与激素结合，传递信号激素受体与激素结合，传递信号激素生物大分子进化重塑生长激素和受体的相互作用

受体的SerAla进化生物大分子进化重塑生长激素和受体的相互作用受体的Ser具体方法突变方法构建分子库导入噬菌体噬菌体展示放大体外挑选富集含目标的噬菌体具体方法突变方法构建分子库导入噬菌体噬菌体展示放大体外结果得到5个氨基酸突变的生长激素，受体和激素之间的相互作用提高了1000倍。改变蛋白质之间的相互作用结果促红细胞生成素

一种糖蛋白细胞因子，可以增加人体血液中红细胞数量、提高血液含氧量的激素。适应症为肾功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血等。2003年全世界EPO的年销售额超过50亿美元。促红细胞生成素一种糖蛋白细胞因子，可以增加人模拟蛋白质药物天然EPO不易得到，使用生物大分子进化出新的蛋白质，可与EPO受体互作。模拟蛋白质药物天然EPO不易得到，使用（2）抗水解多肽思路：D型多肽不容易被天然的水解酶水解。过程：先合成L型水解酶，建立多肽文库；进化得到目标多肽；与D型水解酶作用，验证效果。（2）抗水解多肽思路：D型多肽不容易被天然的水解酶水解。9.8.3核酸适配体的应用核酸适配体由单链DNA或RNA组成，形成一定的二级结构，可以特异识别某种分子。适体库能识别分子，包括蛋白质、核酸、脂类、细胞、小分子。9.8.3核酸适配体的应用核酸适配体由单链DNA或RNA组体外挑选方法寻找核酸适配体1.合成寡聚核苷酸2.建立适体库3.固定蛋白将能与之结合的核酸适配体收集4.测序得到需要的核酸适配体步骤体外挑选方法寻找核酸适配体步骤湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室

以纳米和分子水平上的生化分析、化学与生物传感技术、生命科学中的新分析技术、化学计量学等为主要研究方向。

湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室以纳王柯敏教授课题组在核酸适配体的肿瘤活体荧光分子成像研究一种针对肿瘤细胞特异性表达蛋白的发夹型激活式核酸适配体探针，显著提高肿瘤细胞成像反差、缩短检测时间，成功用于裸鼠肿瘤活体实时荧光成像。王柯敏教授课题组在核酸适配体的肿瘤活体荧光分子成像研究本章重点

DNA文库的突变方法定点诱变DNAShuffling原理绿色荧光蛋白分子进化过程体外挑选方法寻找核酸适配体步骤本章重点DNA文库的突变方法谢谢!谢谢!第9章生物大分子进化第9章生物大分子进化内容自然界生物大分子进化1生物大分子进化方法2生物大分子进化的概念和思路3分子多样性的建立4内容自然界生物大分子进化1生物大分子进化方法2生物大分子进化

分子库的放大5标记和区分蛋白质分子6挑选和筛选7应用实例8分子库的放大5标记和区分蛋白质分子6挑选和筛选7应用实例89.1自然界的生物大分子进化达尔文(1809～1882)

出生于英国西部一个世代为医的家庭。乘贝格尔号舰作了历时5年的环球航行，对动植物和地质结构等进行了大量的观察和采集。

9.1自然界的生物大分子进化达尔文(1809～1882)

19世纪中期，达尔文，在物种起源书中提到了进化论。物种进化的两个因素：遗传突变自然选择19世纪中期，达尔文，在物种起源遗传突变自然选择：

环境条件对于生物的变异进行选择而导致适者生存、不适者被淘汰的过程。

自然选择：

突变不被淘汰突变不被淘汰遗传信息储存在基因组中；基因组序列在自然情况下存在随机突变概率；突变可遗传给子代；增加种群的基因多样性。遗传信息储存在基因组中；优势基因频率增加进化

自然选择优势基因频率增加进化自然选择生物大分子进化DNA、蛋白质等生物大分子的功能从无到有从简单到复杂从低级到高级生物大分子进化DNA、蛋白质等生物大分子的功能自然界的生物大分子多样性和RNA世界假说自然界的生物大分子多样性和RNA世界假说生物大分子的进化基因数量庞大RNA剪切，表达产生不同的蛋白蛋白质剪切酶将蛋白质连接在一起；翻译后修饰；多样性生物大分子的进化基因数量庞大多样性RNA世界假说

DNARNA蛋白质RNA世界假说DNARNA蛋白质

1981年度诺贝尔化学奖获得者吉尔伯特（W.Gilbert）提出了“RNA世界”的假说。指的是“在生命起源的某个时期，生命体仅由RNA组成。遗传信息的传递建立于RNA的复制，其复制机理与当今DNA复制机理相似，作为生物催化的、由基因编码的蛋白质还不存在”。

1981年度诺贝尔化学奖获得者吉尔伯特（W.容易发生突变，因此在携带遗传信息的能力方面，RNA不如DNA；RNA又由于组成没有蛋白质复杂，不可能形成如蛋白质那么多样的结构，因此在功能分子的作用方面，RNA又不如蛋白质。容易发生突变，因此在携带遗传信息的能力方面，RNA不如DNA

RNA可自我复制RNA具有催化功能RNA可自我复制当DNA和蛋白质功能完善后RNA分子才被取代当DNA和蛋白质功能完善后乔伊斯，ScrippsResearchInstitute所长

发现了一对短小但功能强大的RNA序列，把它们和一堆结构更简单的RNA“原料”混在一起.结果：数量会不断倍增，几小时内就能扩增至原来的10倍，而且只要有充足的原料和空间，这种扩增过程就不会停止。

乔伊斯，ScrippsResearchInstitut问题RNA又是怎么产生的？问题RNA又是怎么产生的？9.2化学生物学中的生物大分子进化方法自然界进化的优点：生物多样性丰富，种群巨大；生物本身调控系统精密；缺点：不能定向突变；突变概率低；周期长。9.2化学生物学中的生物大分子进化方法自然界进化的优点：分子库扩增9.3生物大分子进化的基本概念和思路多样化分子进化目标分子竞争筛选分子库扩增9.3生物大分子进化的基本概念和思路多样化分子自然界生物大分子放大文库分子筛选目标分子自然界生物大分子放大文库分子筛选目标分子9.4分子多样性的建立分子多样性的建立是生物大分子进化的基础。DNA稳定性好；易操作；通过改变条件和模板就能得到不同序列和结构的DNA；可以转录和翻译变成RNA和蛋白质。9.4分子多样性的建立分子多样性的建立是生物大分子进化DNA文库的突变方法基因组随机突变易错PCR定点突变DNA改组法DNA文库的突变方法9.4.1基因组的随机突变法方法：天然随机突变物理化学诱变化学：羟胺、溴乙锭、烷基化试剂、强氧化剂等。物理：放射性诱变（紫外线）。9.4.1基因组的随机突变法方法：天然随机突变紫外线突变频率10～10天然突变频率10～10-4-9-9-10基因组的随机突变法缺点不能实现对特定基因的突变紫外线突变频率10～10-4-9-9-10基因组的随机关键突变频率的选择突变频率太高会导致绝大多数突变为有害突变，无法筛选到有益突变;突变频率太低则会导致文库中全是野生型群体。关键突变频率的选择9.4.2易错PCR

采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。9.4.2易错PCR采用DNA聚合酶生物大分子进化总结课件条件

高盐和添加剂存在的条件下，聚合酶的PCR的反应错误率可达0.7%。具体方法如提高镁离子浓度、加入锰离子；改变体系中四种的dNTPs浓度；运用低保真度DNA聚合酶等。条件9.4.3定点诱变

在体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术。分类：定点突变、盒式定点突变、PCR突变。9.4.3定点诱变在体外特异性地取代定点突变ＡＡＧＣＧ定点突变ＡＡＧＣＧ盒式定点诱变文库分子盒式定点诱变文库分子

定点突变文库筛选定9.4.4DNA改组DNAShuffling是运用随机突变技术，对某种感兴趣的蛋门质或核酸进行快速的改造，并定向选择所需性质的生物分子。

9.4.4DNA改组DNAShuffling原理单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的DNA片段。无引物PCR，具有互补3’末端的片段互为引物，各为模板，通过不断的PCR循环在不同模板上随机互补结合并进一步延伸。最后利用基因两端序列为引物合成全长的重排产物，这些重排产物的集合被称为突变文库。对突变文库进行筛选，选择改良的突变体进行下一轮shuffling循环，重复多次重排和筛选，直到最终获得性状比较理想的突变体。原理单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的DNA片进行定向进化的生物活性分子可以是那些由于毒性太大而无法大剂量使用的蛋白质药物;可以是基因治疗载体和基因药物等核酸分子。进行定向进化的生物活性分子示意图示意图FamilyshufflingFamilyshufflingDNA改组成功与否取决于三个因素：相关基因组中基因的相似程度;酶切产生的DNA片段小大;退火温度。

DNA改组成功与否取决于三个因素：优点人工理性设计DNAShuffling随机性优点人工理性设计DNAShuffling随机性同序比对同序比对9.5分子库的放大构建出的文库分子的拷贝数不高需要放大一锅法

DNA：PCRRNA：RT-PCR9.5分子库的放大构建出的文库分子的拷贝数不高PCRPCRRT-PCRRNAcDNADNART-PCRRNA9.6标记和区分蛋白质分子

蛋白质是生物体功能实现的载体，蛋白质分子不能直接放大。

需要对其标记和区分放大9.6标记和区分蛋白质分子蛋白质是生物体功能方法

目标蛋白质的基因与特殊的表达生物体结合，通过表达将蛋白质展示出来。方法目标蛋白质的基因与特殊的表达生物体结合，通

细胞展示噬菌体展示

具体方法核糖体展示

mRNA展示

细胞展示噬菌体展示具体核糖体展示mRNA展示9.6.1细胞展示将含有标签的目标蛋白的DNA导入到细胞中；挑选单克隆；诱导表达蛋白；通过特定的选择系统对蛋白质进行选择。9.6.1细胞展示将含有标签的目标蛋白的DNA导入到细胞中生物大分子进化总结课件缺点：文库的量很小；不能精确控制；缺点：9.6.2噬菌体展示

将目标蛋白的基因与噬菌体外壳蛋白基因相连接，使外源DNA所编码的蛋白质以融合蛋白形式表达在噬菌体表面的方法。9.6.2噬菌体展示将目标蛋白的基因与噬菌体外壳噬菌体感染细菌的病毒。噬菌体颗粒感染一个细菌细胞后可迅速生成几百个子代噬菌体颗粒，每个子代颗粒又可感染细菌细胞，再生成几百个子代噬菌体颗粒。如此重复只需4次，一个噬菌体颗粒便可使几十亿个细菌感染而死亡。

噬菌体生物大分子进化总结课件生物大分子进化总结课件生物大分子进化总结课件生物大分子进化总结课件9.6.3核糖体展示

蛋白及其mRNA同时结合在核糖体上，形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体，使目的蛋白展示在核糖体表面，将基因型和表型联系起来，同时含有mRNA的标签可以通过逆转录进行放大。9.6.3核糖体展示蛋白及其mRNA同时生物大分子进化总结课件

mRNA-核糖体-蛋白质三元复合物文库方便的对目标蛋白进行选择处理，通过亲和筛选的方法富集含有目标蛋白质的复合物，后对其进行放大操作。缺点：不是很稳定mRNA-核糖体-蛋白质三元复合物文库ribosomedisplayribosomedisplay9.6.4mRNA展示

mRNA展示技术一种新兴的体外多肽筛选技术。可以运用于生物分子配体的发现和相互作用的分析。

9.6.4mRNA展示原理

嘌呤霉素是一种分子质量小、化学性质为稳定的氨酰tRNA类似物。当3‘端带有嘌呤霉素连接子的mRNA在体外翻译系统中完成翻译时，嘌呤霉素模拟tRNA末端的氨酰基结构，进入核糖体的A位点，抑制了蛋白质的翻译，在新生肽链和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸之间形成稳定的酰胺键，使mRNA的3’端与多肽的羧基端共价结合起来。

原理嘌呤霉素是一种分子质量小、化学性质为稳生物大分子进化总结课件生物大分子进化总结课件9.7挑选和筛选分类：体内Invivo、体外Invitro筛选：对文库的每一个分子都进行尝试，找出目标。挑选：不需对文库的每一个分子都进行尝试，只需要设定一个条件，符合条件的分子将被挑选出。9.7挑选和筛选分类：体内Invivo、体挑选和筛选的比较体内体外筛选比较样品的颜色、荧光等物理化学性质让细胞产生各种颜色、荧光或具有放射性等挑选如共价或非共价结合在某固定相表面只表达了特异蛋白的细胞才能存活挑选和筛选的比较体内体外筛选比较样品的颜色、荧光等物理化学性10文库大小筛选：10挑选：10～10515挑选流程10文库大小515挑选流程筛选挑选优点简单快速缺点耗时需建立体系筛选挑选Conclusion定向进化=突变

+

筛选

ConclusionGene/genescodingforenzymesofinteresting突变Poolofmutantgenes转化宿主菌筛选单一突变基因的克隆好的突变进行下一轮突变突变的优良基因酶的生产和性质改进重复定向进化Gene/genescodingforenzymes9.8生物大分子进化应用实例9.8.1自然改进型分子进化

（1）绿色荧光蛋白2008年诺贝尔奖钱永健9.8生物大分子进化应用实例9.8.1自然改进型分子进下村修下村修钱永健

1994年，开始改造GFP，有多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的黄色、蓝色，有的可激活、可变色。钱永健1994年，开始改造GFP，有多项发现生物大分子进化总结课件绿色荧光蛋白分子进化DNA改组DNA文库转化细胞细胞展示体外筛选绿色荧光蛋白分子进化DNA改组DNA文库转化细胞细改进后效果发光强度增强45倍；激发光和发射光单色性有改善；进化出了黄色、红色等蛋白。改进后效果发光强度增强45倍；生物大分子进化总结课件生物大分子进化总结课件双内含肽系统纯化蛋白质原理内含肽1:SynechocystisspDnaBintein内含肽2:MycobacteriumxenopiGyrAintein

双内含肽系统纯化蛋白质原理内含肽1:Synechocys23℃pH7.0GFPmut3*双内含肽蛋白纯化过程

DTT上柱剪切洗脱15℃+IPTG

4℃几丁质柱剪切23℃pH7.0GFPmut3*双内含肽蛋白纯化过程D含cGFPmut3*表达的E.coli

激光共聚焦照片明场荧光叠加

优化的诱导表达温度：15℃含cGFPmut3*表达的E.coli激光共聚焦照片含GFPmut3*内含肽融合前体表达的E.coli

激光共聚焦照片明场荧光叠加含GFPmut3*内含肽融合前体表达的E.coli激光共亲和纯化得到的GFPmut3*SDS电泳图Lane1:蛋白MarkerLane4:Lane3上清液通过几丁质柱液后的溶液Lane2:诱导前的细胞粗提液Lane5:柱上洗脱的目的蛋白Lane3:IPTG诱导后的细胞破碎

Yield：2.41mg\LPurity：>95%

亲和纯化得到的GFPmut3*SDS电泳图纯化的GFPmut3*的光谱学特性

GFPmut3*的荧光光谱Ex=502nmEm=511nmGFPmut3*的紫外吸收光谱

纯化的GFPmut3*的光谱学特性GFPmut3GFP的结构示意图