荧光定量pcr试剂产品选购指南

普通PCR技术荧光定量方法产品选购指南实验优化方案常规PCR技术常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性分析S1S2MDNA

Engine实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法;如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析介绍三个概念：扩增曲线、荧光域值、Ct值实时荧光定量PCR原理实时荧光PCR荧光曲线图---循环数，荧光值---指数扩增期，非指数扩增期扩增产物荧光曲线指数扩增期非指数扩增期域值（Threshold）线——荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准（PCR扩增产物量的标准）C(t)（CountofThreshold）值——荧光信号（扩增产物）到达域值时所经过的扩增循环次数域值线C

(t)值C(t)值：对于同一PCR反应而言，模板浓度相同时，C(t)值极具重复性；对于同一PCR反应而言中，模板浓度越高，到达某一域值时对应的C(t)值就越小，反之，则越高；在指数增长期内，初始模板的Log浓度与C(t)值呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数[即C(t)值]就可计算出样品中所含的模板量。定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量定量方法：初始模板量的对数与C(T)循环数之间呈线性关系10610510410310210常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增

产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析常规vs实时优缺点比较优势来自：实验数据及定量分析方法荧光实时监测产物浓度实时荧光定量PCR常规PCR凝胶电泳分析终产物通过终产物定性分析模板荧光实时分析每一次循环产物精确计算初始模板浓度，灵敏度高，检测单拷贝模板计算机自动

分析检测方法费时费力荧光定量方法法使用内掺式

---- SYBR

Green

I探针法使用序列特异性探针----

Taqman----

Molecular

Beacons----

DualProbes(FRET)3’5’3’5’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green

ISYBR-Green

I

的优点使用方便－－不必设计复杂的引物没有序列特异性－－可以用于不同的模板与常规仪器兼容－－可用300-495nm的任何类型的光源激发适合高通量大规模的定量PCR检测价格便宜灵敏度高SYBR-Green

I

的缺点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性(但可以通过融解曲线分析，优化反应条件)对引物特异性要求较高SYBR

Green

I

融解曲线分析温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度SYBR

Green

I

融解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTm融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量

确非特异性产物SYBR

Green

I

法的应用范围型的分析起始模板的测定•

融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。与目标序列互补5′端标记有报告基团(Reporter,R),如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan探针---水解型杂交探针3’5’3’5’5’3’5’3’QExcitationExcitation双标记探针（Taqman

Probe）TaqMan探针优缺点优点对目标序列的高特异性------

结果确定设计相对简单------与目标序列某一区域互补重复性比较好与Molecular

Beacons

相比设计相对简单缺点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针不能进行融解曲线分析Taqman的应用定量起始模板浓度型分析产物鉴定SNP分析ExcitationEmission分子信标（Molecular

Beacon

Probe）分子信标的优点对目标序列有很高的特异性---用于SNP检测的最灵敏的试剂之一荧光背景低分子信标的缺点设计无终点分析功能只能用于一个特定的目标价格较高分子信标的应用定量起始模板浓度型分析鉴定产物单核苷酸多态性（SNP）检测ExcitationEmissionTransfer荧光能量传递（FRET

Probe）小

结性质特异性通用性探针非特异性检测荧光SYBR可逆荧光引物(非特异性扩增或引物二聚体有影响)通用不需要扩增序列专一检测荧光探针法Taqman(包括MGB技术)积累荧光引物+探针需要FRET一般实时荧光引物+双探针需要Amplisensor分子信标(molecularbeacon)积累荧光引物+探针需要荧光标记引物蝎型引物(scorpionprimer)积累荧光引物不需要Amplifluor积累荧光引物通用不需要相关产品QIAGEN-Operon:

定量引物，探针QIAGEN:

预

的探针引物QIAGEN:

定量PCR试剂盒

（

法/探针法）BIO-RAD:

定量PCR

SuperMix其他:

Applied

Biosystems

(ABI)，Finnzymes，RocheApplied

Science，Stratagene，Invitrogen，New

EnglandBiolabs，Sigma-Aldrich

;(在

输入qPCR即可查到产品信息）Tect

SYBR

Gree R/

RT-PCR

Kit

试剂盒内含严谨的热启动酶HotStarTaqDNA

Ploymerase，ROX参比

，dNTPs和优化的缓冲体系，确保高特异性和高灵敏度以预混液形式提供，使用方便,

无需优化适用于各种定量PCR仪（这些仪器包括：ABI

PRISM，Applied

Biosystems，LightCycler，iCycler

iQ，DNA

Engine

Opticon,

Mx4000,

Mx3000P）规格：40次/200次/1000次反应（50ul体系）Qiagen

定量PCR试剂Tect

Probe

PCR/

RT-PCR

Kit适用于Real-time

RT-PCR和两步法RT-PCR，使用序列特异性探针热启动酶HotStarTaq

DNA

Ploymerase独特缓冲液逆转录酶Omniscript和Sensiscript的混合物特点:确保高特异性和高灵敏度使用简单，无需优化以预混液形式提供，使用方便适用于各种定量PCR仪，兼容各种序列特异性探针Tect

Multiplex

PCR

Kit多重定量即在同一反应管内同时对多个目标进行定量，本产品在一个反应中对最多4个模板同时进行定量分析。可以大大提高精度并节约成本。采用专利的MP因子，可以增加模板附近的引物的局部浓度。节约成本----节省试剂，节省样本，节省时间。提高精度----

避免加样误差和反应间误差。特点:无需优化–试剂和操作步骤都经过了预先优化高灵敏度–可检测到10copy的目标序列定量准确可靠

–

目标

和参照

在一个反映体系中扩增，消除了加样误差和反应间误差导致的结果误差操作简单–预制好的master

mixes可以和各种荧光定量PCR仪配套使用适用于各种PCR仪（ABI

PRISM，Applied

Biosystems，iCycler

iQ，LightCycler2.0，DNA

Engine

Opticon

2，Mx4000，Mx3000P，SmartCyclerⅡ）Tect

Multiplex

PCR

KitTect

Multiplex

PCR

Kit应用表达研究型分析----GMO.

微生物鉴定，RNAi后期验证试剂盒里面带有ROX,最多作3个204543（200）

-

RMB8883204545

（1000）

-

RMB35505Cost:

35.5-44.4RMB/Run-------如果一次做3个,则每个只需11.8-14.8RMBTect

Multiplex

PCR

KitBio-Rad

Supermix

系列IQ

SupermixiTaq热启动DNA聚合酶（抗体介导）

,dNTPs,缓冲液浓度最适合实时PCR检测，使用方便；只需模板、引物、探针；可与iCycler

iQ

和MyiQ实时PCR系统配合使用IQ

SYBR Green

SuperMix优化的缓冲液保持SYBR

GreenⅠ

的稳定性，确保实验结果可靠优化的SYBR

GreenⅠ

浓度，确保检测灵敏而精确使用方便，只需模板和引物iTaq

SYBR

Green

ROX

/

iTaq

Supermix

with

ROX专利低

配方，吸取更方便可用于所有需要ROX的光学PCR仪平台方便的单管配方，预混有ROX和dUTP比同类产品稳定的产生更早的Ct值,结果高度均一iScript

One-Step

RT-PCR

KitWith

SYBR

GreenⅠ/

Probes适用于一步法RT-PCR，使用SYBRGreenⅠ或探针检测检测灵敏度可达0.1pgiScript

反转录酶、iTaq

DNA

聚合酶定量PCR耗材Axygen

/

Bio-rad0.2ml

PCR八排管0.2ml

PCR八排管盖96孔PCR板96孔PCR板（半边）,用于ABI-3100PCR板膜吸头类定量PCR实验优化方案反应体系的建立及优化（使用SYBR

GreenⅠ）:SYBR

Green

Ⅰ使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：要求引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,

以减少非特异性产物反应Buffer

体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同TaqMan探针PCR反应的建立1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，<30

bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400

bp

，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：一般为：94

℃，10-20S;60℃，30-60S（Taq酶5′-3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通过温度梯度优化退火温度;72

℃，45

S;3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM其他与常规PCR相同RNA提取RNA反转录成cDNA荧光定量PCR数据分析荧光定量PCR步骤RNA的质