生物化学课件 DNA的复制和修复

本章主要内容一、DNA的半保留复制二、DNA复制的起点与方向三、DNA的半不连续复制四、与DNA复制有关的蛋白质五、大肠杆菌DNA的复制过程六、复制起始的时序控制七、真核生物DNA复制特点八、DNA损伤的修复目的要求第34章DNA的复制和修复本章主要内容一、DNA的半保留复制目的要求第34章DNA1

1.掌握遗传信息传递的中心法则。2.

掌握DNA复制的一般规律：DNA的半保留复制、DNA的半不连续复制的概念。3.

了解三种大肠杆菌DNA聚合酶的催化特性及其功用；了解原核生物DNA的复制过程。4.

了解使DNA损伤的因素；DNA损伤的修复机制：错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、直接修复、重组修复及倾向差错的修复的过程及过程所需要的酶类；了解DNA损伤修复的意义。目的要求第34章DNA的复制和修复1.掌握遗传信息传递的中心法则。目的要求21964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录

1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。

中心法则：病毒（复制）复制转录DNARNA蛋白质翻译逆转录RNA的复制存在于RNA病毒DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。第34章DNA的复制和修复1964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转3Reversetranscription中心法则图示Reverse中心法则图示4

复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。几个基本概念：

逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。

翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。

转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。第34章DNA的复制和修复复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一5一、DNA的半保留复制2.半保留复制的实验证据:1.定义：1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。第34章DNA的复制和修复一、DNA的半保留复制2.半保留复制的实验证据:1.定义：6TestingModelsforDNAreplicationMatthewMeselsonandFranklinStahl(1958)TestingModelsforDNAreplica7生物化学课件DNA的复制和修复8DNA复制的可能方式全保留与全新复制分散复制半保留复制DNA复制的可能方式全保留与全新复制分散复制半保留复制9DNA半保留复制图示：DNA半保留复制图示：10半保留复制的证明：Meselson和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。第34章DNA的复制和修复半保留复制的证明：Meselson和Stahl将同位素11生物化学课件DNA的复制和修复1215N-DNA的密度大于14N-DNA的密度15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度13亲代DNA（15N～15N）子一代DNA（15N～14N）子二代DNA(15N～14N，14N～14N1:1)子三代DNA(15N～14N，14N～14N1:3)子四代DNA(15N～14N，14N～14N1:7)亲代DNA与子二代DNA的混合物亲代DNA与子四代DNA的混合物亲代DNA（15N～15N）子一代DNA（15N～14N）子14复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图

(Cairns实验)将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分占整个染色体的三分之二，其中一条双链（B）仅有一股链是标记的，另外一股双链（A）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。ABC环状DNA的复制ABC复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图

(Cairns实验)15复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图16DNA的半保留复制的生物学意义：DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。

DNA的半保留复制表明了DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。第34章DNA的复制和修复DNA的半保留复制的生物学意义：DNA在代谢上的稳定性并非17二、DNA复制的起点与方向二、DNA复制的起点与方向18生物化学课件DNA的复制和修复19双向复制单向复制双向复制单向复制20复制中的DNA

复制原点复制叉第34章DNA的复制和修复复制中的DNA复制原点复制叉第34章DNA的复制和修复21DNA复制的主要方式大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）3不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）单向滚环式复制（噬菌体X174DNA—单链环状）DNA复制的主要方式大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制22DNA的几种复制方式DNA的几种复制方式23亲代双链（或单链）DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其5'端游离出来。DNA聚合酶Ⅲ便可以将脱氧核糖核苷酸聚合在3'-OH端。当复制向前进行时，亲代DNA上被切断的5'端继续游离下来，并且很快被单链结合蛋白所结合。因为5'端从环上向下解链的同时伴有环状双链DNA环绕其轴不断的旋转，而且以3'-OH端为引物的DNA生长链则不断地以另一条环状DNA链为模板向前延伸，因而称为滚环(Rollingcircle)复制。亲代双链（或单链）DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其24在这种复制方式中，DNA的延伸可以一直进行下去，产生的DNA链可以是亲代DNA单位长度的许多倍。这么长的DNA链是如何转变为单位长度的DNA分子的，目前尚不清楚。可能是由特异的内切酶切开产生单位长度的子代DNA。这些DNA可自身环绕，或保持线性分子状态。在这种复制方式中，DNA的延伸可以一直进行下去，产生的DNA25双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代，在电镜下可以看到呈D环形状。待一条链复制到一定程度，露出另一链的复制起点，另一条链才开始复制。这表明复制起点是以一条链为摸板起始合成DNA的一段序列；两条链的起点并不总在同一点上，当两条链的起点分开一定距离时就产生D－环（D-loop）复制。F.双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，一26多复制叉复制第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。多复制叉复制第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制27三、DNA复制的半不连续性前导链滞后链冈崎片段前导链：以3’→5’方向的亲代链为模板连续合成的子代链。滞后链：以5’→3’方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。三、DNA复制的半不连续性前导链滞后链冈崎片段前导链：以3’28半不连续复制的发现

同位素实验，用含3H的dT标记用T4噬菌体感染的大肠杆菌短时间内分离的DNA均为DNA小片段一段时间后检测到DNA大片段。当用DNA连接酶的缺失的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。→证明DNA复制中有小片段合成。测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。似乎两条链都是不连续合成的，后发现是由于U替代dT渗入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，DNA的U不再被切除，则检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。1968日本学者冈崎：半不连续复制的发现同位素实验，用含3H的dT标记用T4噬29ArthurKornberg1918

StanfordUniversity

Stanford,CA,USA

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959"fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid"ArthurKornberg1918Stanford30四、与DNA复制有关的酶和蛋白质原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTPdCTPdTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3’-OH.合成方向：53(一)DNA聚合酶：1956年Kornberg等在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。该酶的催化性质如下：第34章DNA的复制和修复四、与DNA复制有关的酶和蛋白质原料：四种脱氧核苷三磷酸(一31（二）大肠杆菌DNA聚合酶（1）53聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）；（2）3

5’外切酶活性（对双链无作用，在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）；（3）还具有53’外切酶活性（双链有效）；1、DNA聚合酶Ⅰ:1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有:该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对DNA损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其缺口的填补。第34章DNA的复制和修复（二）大肠杆菌DNA聚合酶（1）53聚合酶功能（32DNA聚合酶催化的反应：DNA聚合酶催化的反应：33ⅠDNA聚合酶Ⅰ的功能ⅠDNA聚合酶Ⅰ的功能34[1]聚合作用在引物RNA3'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3'-OH与5'-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3'-5'外切酶活性位点所识别并切除之。[1]聚合作用35[2]3'→5'外切酶活性──校对作用这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。[2]3'→5'外切酶活性──校对作用36生物化学课件DNA的复制和修复37[3]5'→3'外切酶活性──切除修复作用从5‘→3’方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5‘-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5'末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。[3]5'→3'外切酶活性──切除修复作用38[4]焦磷酸解作用DNApolⅠ的这种活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi→(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA[5]焦磷酸交换作用催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。反应式为32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA（[4]、[5]两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。）[4]焦磷酸解作用（[4]、[5]两种作用，都要求有较高浓度392、DNA聚合酶Ⅱ：多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有3’5’外切酶活性。其功能可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。第34章DNA的复制和修复2、DNA聚合酶Ⅱ：多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA403、DNA聚合酶Ⅲ

多亚基酶，含十种亚基:（αβγθτδδ’χΨε），其中（αεθ）称为核心酶，β2称为夹子，（γ2δδ’χΨ）组成γ复合物，其主要功能是帮助β亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死。因此认为该酶DNA的真正复制酶。第34章DNA的复制和修复3、DNA聚合酶Ⅲ多亚基酶，含十种亚基:（αβγθτ41DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成亚基相对分子量亚基数目基因亚基功能αεθτγδδ’χΨβ1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadX＊holAholBholCholDdnaN聚合作用3’→5’外切酶的校对功能组建核心酶使核心酶二聚化依赖DNA的ATP酶，形成γ复合物与β亚基结合，形成γ复合物形成γ复合物形成γ复合物形成γ复合物两个β亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力。DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成亚基相对分子量亚基数目基因亚基功42DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体前导链的合成滞后链的合成DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体前导链的合成滞后链的合成43DNA聚合酶Ⅲ的β-钳子俯视图DNA双螺旋DNA聚合酶Ⅲ的β-钳子俯视图DNA双螺旋44大肠杆菌三种聚合酶比较DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ结构基因＊不同种类的亚基数目相对分子质量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持续合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修复PolB≥788,000＋－2,4001,500修复PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000复制大肠杆菌三种DNA聚合酶比较大肠杆菌三种聚合酶比较DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合45(三）DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口作用特点：大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中的DNA连接酶，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。第34章DNA的复制和修复(三）DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口作用特点：大46DNA连接酶作用机理DNA连接酶作用机理471、拓扑异构酶拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。第34章DNA的复制和修复1、拓扑异构酶拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变48(四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)蛋白质功能相对分子量（×103）分子/细胞DNA旋转酶（或拓扑异构酶）DNA解链酶单链结合蛋白引物合成酶DNA聚合酶Ⅰ引入或松开超螺旋使双链DNA解链稳定单链区合成RNA引物除去引物并填满缺口40065746010950300100300(四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)蛋白质功能49拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。两类拓扑异构酶作用特点:

二者共同控制DNA的拓扑结构。第34章DNA的复制和修复拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负50生物化学课件DNA的复制和修复512、解螺旋酶（解链酶）

通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。3、单链结合蛋白：第34章DNA的复制和修复2、解螺旋酶（解链酶）通过水解ATP将DNA两条链打52解螺旋酶（helicase）可以促使DNA在复制叉处打开双链。解螺旋酶可以和单链DNA结合，并且与ATP结合，利用ATP分解成ADP时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开。目前，大肠杆菌中发现有两种解螺旋酶参与这个过程，一种称为解螺旋酶I、II、III，与滞后链的模板DNA结合沿5'→3'方向运动;第二种称为Rep蛋白，和前导链的模板DNA结合沿3'→5'方向运动。解螺旋酶（helicase）可以促使DNA在复制叉处打开双链53单链DNA结合蛋白(SSBP)螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNA不会长久存在，会很快重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。在细胞内有大量单链DNA结合蛋白能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。一个SSBP四聚体结合于单链DNA上可以促进其他SSBP四聚体现相邻的单链DNA结合，这个过程称为协同结合(cooperativebinding)，SSBP结合到单链DNA上后，使其呈伸展状态，没有弯曲和结节，有利于单链DNA作为模板。SSBP可以重复使用，当新生的DNA链合成到某一位置时，该处的SSBP便会脱落，并被重复利用。单链DNA结合蛋白(SSBP)螺旋酶沿复制叉方向向前推进产54引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。3、引物合成酶与引发前体引物合成酶：催化引物RNA的生成

引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。第34章DNA的复制和修复引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起55（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图56五、DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）复制的终止：复制的起始1、起始复合物的形成：称为引发2、RNA引物的合成链的延伸：第34章DNA的复制和修复五、DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）复制的终止：复57复制原点oriC和原点的识别：从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用oriC(或o）表示。大肠杆菌的复制原点oriC由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。复制原点由DnaA蛋白识别，在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶Π、SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。复制原点oriC和原点的识别：从复制原点到终点，组成一个复58（一）复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下,DanA蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿5’→3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。（一）复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。59生物化学课件DNA的复制和修复60(二)链的延长（冈崎片段的合成）

真核生物的冈崎片段为：100-200bp原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp(二)链的延长（冈崎片段的合成）真核生物的冈崎片段为：61DNA链的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种5’-脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。

前导链滞后链冈崎片段半不连续复制冈崎模型DNA链的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种5’-62生物化学课件DNA的复制和修复63冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:64前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶的异二聚体催化）前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶的异二聚体催化）65生物化学课件DNA的复制和修复66(三)复制的终止顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致DNA复制的终止。(三)复制的终止顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱Ter:终67大肠杆菌DNA

复制的终止大肠杆菌DNA

复制的终止68(四)DNA复制的精确性（高保真复制）1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低100～1000倍。3、DNA的损伤修复系统。DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/109～1/1010，即每109～1010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制1000～10000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：(四)DNA复制的精确性（高保真复制）1、碱基的配对规律：69六、复制起始

的时序控制六、复制起始

的时序控制70七、真核生物DNA复制的特点4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物染色体DNA复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。1、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列（ARS）或复制基因(replicator);多复制眼，呈双向复制，多复制子。2、冈崎片段长约200bp(原核1000-2000bp)。3、真核生物DNA复制速度比原核慢，速度为1000～3000bp/min(仅为原核生物的1/20～1/50）。七、真核生物DNA复制的特点4、真核生物染色体在全部复制完之71真核DNA复制特点7、RPA：真核生物的单链结合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶ε填补缺口。5、真核生物有多种DNA聚合酶,DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正的复制酶，在PCNA存在下有持续的合成能力（PCNA称为增殖细胞核抗原，相当于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ的β-夹子）。RFC蛋白相当于夹子装配器。6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，它是由许多成串的重短复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5’-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色体保持一定长度。端粒酶是含一段RNA的逆转录酶.真核DNA复制特点7、RPA：真核生物的单链结合蛋白；RNa72端粒酶（telomerase）DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。

初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶（telomerase）DNA复制需要引物73端粒合成的一种模型3´5´TTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3´5´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3´5´AATTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和杂交移位和再杂交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5´3´nAA3´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5´3´TTCCCCTnAA3´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5´3´TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn进一步加工继续延伸动画端粒合成的一种模型3´5´5´3´AAAACCCCAAAAC74生物化学课件DNA的复制和修复75真核细胞内有五种DNA聚合酶DNA聚合酶αDNA聚合酶βDNA聚合酶γDNA聚合酶δDNA聚合酶ε定位亚基数目外切酶活性引物合成酶活性持续合成能力抑制剂功能细胞核4－＋中等蚜肠霉素引物合成细胞核1－－低双脱氧TTP修复线粒体23’→5’外切酶－高双脱氧TTP线粒体DNA合成细胞核23’→5’外切酶－有PCNA时高蚜肠霉素核DNA合成细胞核＞15’→3’外切酶－高蚜肠霉素修复真核细胞内有五种DNA聚合酶DNA聚合酶αDNA聚合酶βD76真核细胞DNA复制示意图真核细胞DNA复制示意图77八、DNA损伤的修复DNA突变：DNA的核苷酸顺序永久性的改变称为DNA的突变。其主要形式有：

1.点突变：DNA分子中一个碱基对替代另一个碱基对称为点的突变。

2.插入作用：DNA分子中插入一个或几个碱基称为插入作用。

3.缺失作用：DNA分子中缺失一个或多个碱基对称为缺失作用。DNA在复制时产生错配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，都可能使DNA的结构及功能发生改变。从而引起生物突变，甚至导致死亡。DNA的损伤与DNA突变：八、DNA损伤的修复DNA突变：DNA的核苷酸顺序永久性78DNA突变可能导致肿瘤的发生:着色性干皮病：对嘧啶二聚体和大的DNA损伤修复酶的缺失而产生的一种皮肤癌。

沉默突变：突变影响非必需的DNA或突变对一个基因的功能的影响可忽略，称为沉默突变。回复突变：一些突变可以克服第一次突变造成的影响，这类突变称为回复突变。动物细胞的突变与癌的发生有强烈的相关性。通常生物体DNA的损伤有一系列的修复机制，如：错配修复、碱基的切除修复、核苷酸的切割修复、直接修复、重组修复等。DNA突变可能导致肿瘤的发生:着色性干皮病：对嘧啶二聚体和79DNA损伤的修复机制:1、参与错配修复的酶与蛋白质Dam甲基化酶;MutH、MutL、MutS蛋白;解螺旋酶Ⅱ;DNA聚合酶Ⅲ;外切酶Ⅰ、Ⅹ、Ⅶ；RecJ核酸酶DNA连接酶；SSB（一）错配修复DNA损伤的修复机制:1、参与错配修复的酶与蛋白质（一）错配80MutS识别并结合于碱基错配处MutH-MutL二聚体结合后沿两个方向移动，形成DNA环，直至遭遇半甲基化的CTAG。MutH在CTAG的5’-端切开一个切口，核酸外切酶Ⅰ、Ⅶ沿3’→5’方向切除含配错碱基的新链DNA聚合酶Ⅲ补缺，DNA连接酶连接切口。高度耗能的错配修复MutS识别并结合于碱基错配处MutH-MutL二聚体结合后81生物化学课件DNA的复制和修复82

这是最早发现的DNA修复方式。修复是由细菌中的DNA光解酶（photolyase）完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300-600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中，人体细胞中也有发现。（二）直接修复这是最早发现的DNA修复方式。修复是由细菌中的DNA光解酶83(三)切除修复碱基丢失碱基缺陷或错配结构缺陷切开核酸内切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA连接酶AP核酸内切酶核酸外切酶切开切除修复连接糖苷酶插入酶碱基取代(三)切除修复碱基丢失碱基缺陷或错配结构缺陷切开核酸内切酶84附：核苷酸的切除修复DNA解螺旋酶附：核苷酸的切除修复DNA解螺旋酶85核苷酸切除修复（2）光解酶uvrB、uvrA蛋白结合uvrB产生3’-端切口uvrC产生5’-端切口DNA聚合酶Ⅰ或ⅡDNA连接酶uvrD切除核苷酸切除修复（2）光解酶uvrB、uvrA蛋白结合uvrB86①受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口。②完整的另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换，将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处，而母链DNA出现缺口。③以另一条子链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口，最后由DNA连接酶连接，完成修补。（四）重组修复①受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出87生物化学课件DNA的复制和修复88生物化学课件DNA的复制和修复89（五）SOS反应和诱导修复（易错修复）SOS反应：细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急状态下，为求生存而出现的应急反应。SOS反应包括:避免差错的修复能力增强诱导产生无校正功能的DNA聚合酶合成抑制细胞分裂SOS反应是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。对原核生物它产生高变异，对高等动物则是致癌的。（五）SOS反应和诱导修复（易错修复）SOS反应：细胞DN90当DNA两条链的损伤接近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺，再由损伤诱导产生的一整套的特殊DNA聚合酶──SOS修复酶类，催化空缺部位DNA的合成，这时补上去的核苷酸几乎是随机的，仍然终于保持了DNA双链的完整性，使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很高的突变率。

当DNA两条链的损伤接近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这91

第三节DNA的突变

DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。二、诱变剂的作用碱基类似物(baseanalog)

碱基修饰剂(basemodifier)嵌入染料(intercalationdye)

紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizingradiation)一、突变的类型

碱基对的置换(substitution)

移码突变(framesshiftmutation)第三节DNA的突变

DNA分子中的核苷酸序92

DNA突变的类型-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-转换野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-颠换碱基对的置换(substitution)移码突变(framesshiftmutation)

-T-C-G-C-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-T-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-T-G-A-C-A-T-G-C-缺失CGDNA突变的类型-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C93本章主要内容一、DNA的半保留复制二、DNA复制的起点与方向三、DNA的半不连续复制四、与DNA复制有关的蛋白质五、大肠杆菌DNA的复制过程六、复制起始的时序控制七、真核生物DNA复制特点八、DNA损伤的修复目的要求第34章DNA的复制和修复本章主要内容一、DNA的半保留复制目的要求第34章DNA94

1.掌握遗传信息传递的中心法则。2.

掌握DNA复制的一般规律：DNA的半保留复制、DNA的半不连续复制的概念。3.

了解三种大肠杆菌DNA聚合酶的催化特性及其功用；了解原核生物DNA的复制过程。4.

了解使DNA损伤的因素；DNA损伤的修复机制：错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、直接修复、重组修复及倾向差错的修复的过程及过程所需要的酶类；了解DNA损伤修复的意义。目的要求第34章DNA的复制和修复1.掌握遗传信息传递的中心法则。目的要求951964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录

1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。

中心法则：病毒（复制）复制转录DNARNA蛋白质翻译逆转录RNA的复制存在于RNA病毒DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。第34章DNA的复制和修复1964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转96Reversetranscription中心法则图示Reverse中心法则图示97

复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。几个基本概念：

逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。

翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。

转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。第34章DNA的复制和修复复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一98一、DNA的半保留复制2.半保留复制的实验证据:1.定义：1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。第34章DNA的复制和修复一、DNA的半保留复制2.半保留复制的实验证据:1.定义：99TestingModelsforDNAreplicationMatthewMeselsonandFranklinStahl(1958)TestingModelsforDNAreplica100生物化学课件DNA的复制和修复101DNA复制的可能方式全保留与全新复制分散复制半保留复制DNA复制的可能方式全保留与全新复制分散复制半保留复制102DNA半保留复制图示：DNA半保留复制图示：103半保留复制的证明：Meselson和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。第34章DNA的复制和修复半保留复制的证明：Meselson和Stahl将同位素104生物化学课件DNA的复制和修复10515N-DNA的密度大于14N-DNA的密度15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度106亲代DNA（15N～15N）子一代DNA（15N～14N）子二代DNA(15N～14N，14N～14N1:1)子三代DNA(15N～14N，14N～14N1:3)子四代DNA(15N～14N，14N～14N1:7)亲代DNA与子二代DNA的混合物亲代DNA与子四代DNA的混合物亲代DNA（15N～15N）子一代DNA（15N～14N）子107复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图

(Cairns实验)将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分占整个染色体的三分之二，其中一条双链（B）仅有一股链是标记的，另外一股双链（A）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。ABC环状DNA的复制ABC复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图

(Cairns实验)108复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图109DNA的半保留复制的生物学意义：DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。

DNA的半保留复制表明了DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。第34章DNA的复制和修复DNA的半保留复制的生物学意义：DNA在代谢上的稳定性并非110二、DNA复制的起点与方向二、DNA复制的起点与方向111生物化学课件DNA的复制和修复112双向复制单向复制双向复制单向复制113复制中的DNA

复制原点复制叉第34章DNA的复制和修复复制中的DNA复制原点复制叉第34章DNA的复制和修复114DNA复制的主要方式大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）3不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）单向滚环式复制（噬菌体X174DNA—单链环状）DNA复制的主要方式大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制115DNA的几种复制方式DNA的几种复制方式116亲代双链（或单链）DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其5'端游离出来。DNA聚合酶Ⅲ便可以将脱氧核糖核苷酸聚合在3'-OH端。当复制向前进行时，亲代DNA上被切断的5'端继续游离下来，并且很快被单链结合蛋白所结合。因为5'端从环上向下解链的同时伴有环状双链DNA环绕其轴不断的旋转，而且以3'-OH端为引物的DNA生长链则不断地以另一条环状DNA链为模板向前延伸，因而称为滚环(Rollingcircle)复制。亲代双链（或单链）DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其117在这种复制方式中，DNA的延伸可以一直进行下去，产生的DNA链可以是亲代DNA单位长度的许多倍。这么长的DNA链是如何转变为单位长度的DNA分子的，目前尚不清楚。可能是由特异的内切酶切开产生单位长度的子代DNA。这些DNA可自身环绕，或保持线性分子状态。在这种复制方式中，DNA的延伸可以一直进行下去，产生的DNA118双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代，在电镜下可以看到呈D环形状。待一条链复制到一定程度，露出另一链的复制起点，另一条链才开始复制。这表明复制起点是以一条链为摸板起始合成DNA的一段序列；两条链的起点并不总在同一点上，当两条链的起点分开一定距离时就产生D－环（D-loop）复制。F.双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，一119多复制叉复制第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。多复制叉复制第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制120三、DNA复制的半不连续性前导链滞后链冈崎片段前导链：以3’→5’方向的亲代链为模板连续合成的子代链。滞后链：以5’→3’方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。三、DNA复制的半不连续性前导链滞后链冈崎片段前导链：以3’121半不连续复制的发现

同位素实验，用含3H的dT标记用T4噬菌体感染的大肠杆菌短时间内分离的DNA均为DNA小片段一段时间后检测到DNA大片段。当用DNA连接酶的缺失的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。→证明DNA复制中有小片段合成。测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。似乎两条链都是不连续合成的，后发现是由于U替代dT渗入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，DNA的U不再被切除，则检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。1968日本学者冈崎：半不连续复制的发现同位素实验，用含3H的dT标记用T4噬122ArthurKornberg1918

StanfordUniversity

Stanford,CA,USA

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959"fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid"ArthurKornberg1918Stanford123四、与DNA复制有关的酶和蛋白质原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTPdCTPdTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3’-OH.合成方向：53(一)DNA聚合酶：1956年Kornberg等在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。该酶的催化性质如下：第34章DNA的复制和修复四、与DNA复制有关的酶和蛋白质原料：四种脱氧核苷三磷酸(一124（二）大肠杆菌DNA聚合酶（1）53聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）；（2）3

5’外切酶活性（对双链无作用，在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）；（3）还具有53’外切酶活性（双链有效）；1、DNA聚合酶Ⅰ:1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有:该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对DNA损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其缺口的填补。第34章DNA的复制和修复（二）大肠杆菌DNA聚合酶（1）53聚合酶功能（125DNA聚合酶催化的反应：DNA聚合酶催化的反应：126ⅠDNA聚合酶Ⅰ的功能ⅠDNA聚合酶Ⅰ的功能127[1]聚合作用在引物RNA3'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3'-OH与5'-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3'-5'外切酶活性位点所识别并切除之。[1]聚合作用128[2]3'→5'外切酶活性──校对作用这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。[2]3'→5'外切酶活性──校对作用129生物化学课件DNA的复制和修复130[3]5'→3'外切酶活性──切除修复作用从5‘→3’方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5‘-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5'末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。[3]5'→3'外切酶活性──切除修复作用131[4]焦磷酸解作用DNApolⅠ的这种活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi→(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA[5]焦磷酸交换作用催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。反应式为32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA（[4]、[5]两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。）[4]焦磷酸解作用（[4]、[5]两种作用，都要求有较高浓度1322、DNA聚合酶Ⅱ：多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有3’5’外切酶活性。其功能可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。第34章DNA的复制和修复2、DNA聚合酶Ⅱ：多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA1333、DNA聚合酶Ⅲ

多亚基酶，含十种亚基:（αβγθτδδ’χΨε），其中（αεθ）称为核心酶，β2称为夹子，（γ2δδ’χΨ）组成γ复合物，其主要功能是帮助β亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死。因此认为该酶DNA的真正复制酶。第34章DNA的复制和修复3、DNA聚合酶Ⅲ多亚基酶，含十种亚基:（αβγθτ134DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成亚基相对分子量亚基数目基因亚基功能αεθτγδδ’χΨβ1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadX＊holAholBholCholDdnaN聚合作用3’→5’外切酶的校对功能组建核心酶使核心酶二聚化依赖DNA的ATP酶，形成γ复合物与β亚基结合，形成γ复合物形成γ复合物形成γ复合物形成γ复合物两个β亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力。DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成亚基相对分子量亚基数目基因亚基功135DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体前导链的合成滞后链的合成DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体前导链的合成滞后链的合成136DNA聚合酶Ⅲ的β-钳子俯视图DNA双螺旋DNA聚合酶Ⅲ的β-钳子俯视图DNA双螺旋137大肠杆菌三种聚合酶比较DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ结构基因＊不同种类的亚基数目相对分子质量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持续合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修复PolB≥788,000＋－2,4001,500修复PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000复制大肠杆菌三种DNA聚合酶比较大肠杆菌三种聚合酶比较DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合138(三）DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口作用特点：大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中的DNA连接酶，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。第34章DNA的复制和修复(三）DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口作用特点：大139DNA连接酶作用机理DNA连接酶作用机理1401、拓扑异构酶拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。第34章DNA的复制和修复1、拓扑异构酶拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变141(四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)蛋白质功能相对分子量（×103）分子/细胞DNA旋转酶（或拓扑异构酶）DNA解链酶单链结合蛋白引物合成酶DNA聚合酶Ⅰ引入或松开超螺旋使双链DNA解链稳定单链区合成RNA引物除去引物并填满缺口40065746010950300100300(四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)蛋白质功能142拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。两类拓扑异构酶作用特点:

二者共同控制DNA的拓扑结构。第34章DNA的复制和修复拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负143生物化学课件DNA的复制和修复1442、解螺旋酶（解链酶）

通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。3、单链结合蛋白：第34章DNA的复制和修复2、解螺旋酶（解链酶）通过水解ATP将DNA两条链打145解螺旋酶（helicase）可以促使DNA在复制叉处打开双链。解螺旋酶可以和单链DNA结合，并且与ATP结合，利用ATP分解成ADP时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开。目前，大肠杆菌中发现有两种解螺旋酶参与这个过程，一种称为解螺旋酶I、II、III，与滞后链的模板DNA结合沿5'→3'方向运动;第二种称为Rep蛋白，和前导链的模板DNA结合沿3'→5'方向运动。解螺旋酶（helicase）可以促使DNA在复制叉处打开双链146单链DNA结合蛋白(SSBP)螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNA不会长久存在，会很快重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。在细胞内有大量单链DNA结合蛋白能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。一个SSBP四聚体结合于单链DNA上可以促进其他SSBP四聚体现相邻的单链DNA结合，这个过程称为协同结合(cooperativebinding)，SSBP结合到单链DNA上后，使其呈伸展状态，没有弯曲和结节，有利于单链DNA作为模板。SSBP可以重复使用，当新生的DNA链合成到某一位置时，该处的SSBP便会脱落，并被重复利用。单链DNA结合蛋白(SSBP)螺旋酶沿复制叉方向向前推进产147引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。3、引物合成酶与引发前体引物合成酶：催化引物RNA的生成

引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。第34章DNA的复制和修复引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起148（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图149五、DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）复制的终止：复制的起始1、起始复合物的形成：称为引发2、RNA引物的合成链的延伸：第34章DNA的复制和修复五、DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）复制的终止：复150复制原点oriC和原点的识别：从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用oriC(或o）表示。大肠杆菌的复制原点oriC由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。复制原点由DnaA蛋白识别，在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶Π、SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。复制原点oriC和原点的识别：从复制原点到终点，组成一个复151（一）复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下,DanA蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿5’→3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。（一）复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。152生物化学课件DNA的复制和修复153(二)链的延长（冈崎片段的合成）

真核生物的冈崎片段为：100-200bp原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp(二)链的延长（冈崎片段的合成）真核生物的冈崎片段为：154DNA链的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种5’-脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。

前导链滞后链冈崎片段半不连续复制冈崎模型DNA链的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种5’-155生物化学课件DNA的复制和修复156冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:157前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶的异二聚体催化）前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶的异二聚体催化）158生物化学课件DNA的复制和修复159(三)复制的终止顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致DNA复制的终止。(三)复制的终止顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱Ter:终160大肠杆菌DNA

复制的终止大肠杆菌DNA

复制的终止161(四)DNA复制的精确性（高保真复制）1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低100～1000倍。3、DNA的损伤修复系统。DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/109～1/1010，即每109～1010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制1000～10000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：(四)DNA复制的精确性（高保真复制）1、碱基的配对规律：162六、复制起始

的时序控制六、复制起始

的时序控制163七、真核生物DNA复制的特点4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物染色体DNA复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。1、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列（ARS）或复制基因(replicator);多复制眼，呈双向复制，多复制子。2、冈崎片段长约200bp(原核1000-2000bp)。3、真核生物DNA复制速度比原核慢，速度为1000～3000bp/min(仅为原核生物的1/20～1/50）。七、真核生物DNA复制的特点4、真核生物染色体在全部复制完之164真核DNA复制特点7、RPA：真核生物的单链结合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶ε填补缺口。5、真核生物有多种DNA聚合酶,DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正的复制酶，在PCNA存在下有持续的合成能力（PCNA称为增殖细胞核抗原，相当于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ的β-夹子）。RFC蛋白相当于夹子装配器。6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，它是由许多成串的重短复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5’-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色体保持一定长度。端粒酶是含一段RNA的逆转录酶.真核DNA复制特点7、RPA：真核生物的单链结合蛋白；RNa165端粒酶（telomerase）DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过