呕吐毒素DON的检测ELISA法

呕吐毒素（DON）的检测ELISA法在2—8℃冷藏—不要冻结1.简介DON毒素脱氧瓜萎镰菌醇（DON，）是单端孢菌素烯烃中的一种，它通常是由生长在谷类物品（如小麦、玉米、大麦和秣草）霉菌镰红菌素生成的。脱氧瓜萎镰菌醇的毒性效应包括：呕吐、不想进食、胃肠炎、腹泻、免疫抑制和血液病。研究表明猪对脱氧瓜萎镰菌醇很敏感。当脱氧瓜萎镰菌醇含量N1ppm时，它们就拒绝进食。其毒性也会对其他物种产生毒性效应，各种物种对脱氧瓜萎镰菌醇的敏感性各不相同。研究表明脱氧瓜萎镰菌醇会使已加工食物发生问题，包括使可吃的谷类制品产生臭味、对生面团质量产生负面影响。因此，精确测定可能含有脱氧瓜萎镰菌醇的食物和食品就现得十分重要。FDA（美国食品和药品管理局）已经制定

了脱氧瓜萎镰菌醇含量的强制标准。美国食品药物管理局已经颁布的DON毒素建议限量如下:适用对象限量物质人1ppm麦制品（面粉、麸和胚芽）反刍动物牛肉饲养的牛和鸡10ppm在＜50%的食入量（全食入量时为5ppm）所有谷物及其副产品猪5ppm在＜20%的食入量（全食入量时为1ppm）所有谷物及其副产品所有其它动物5ppm在＜40%的食入量（全食入量时为2ppm）所有谷物及其副产品2.方法原理本测试盒的测试原理是一种竞争性的直接酶联免疫吸附剂测试方法（ELISA），可准确检测出样品中ppm级的DON毒素。样品和标准控制液中游离的DON毒素与轭合物中的DON毒素竞争抗体结合位置。清洗后，加入底物，底物与轭合物反应出现兰色，兰色越深表明DON毒素越少。将其置于微型孔阅读器中可读出透光度，以控制标准液的透光度作标准曲线，将样品的透光度与标准曲线比较计算出样品中DON毒素的准确浓度。.贮存要求本试剂盒存放在2〜8℃时，可以一直使用到标签上注明的到期日期。.试剂与仪器已提供的材料48个包被了抗体的孔；48个红色标记的混合孔；5瓶2ml浓度为0、0.25、0.5、1、3PpmDON毒素控制标准液（黄色标签）;1瓶DON毒素-HRP轭合物溶液（兰色标签）；1瓶24ml底物溶液（绿色标签）;1瓶32ml红色终止液（红色标签）4.2需要但未提供的材料提取材料；蒸馏水或去离子水；100ml量筒；150ml的具塞三角瓶；滤纸；样品收集具塞试管；漏斗；粉碎机；称量为5〜25克的秤；带450nm滤光片的酶标仪；200口l移液器；200口1吸咀；纸巾或等效的吸水材料；计时器；防水记号笔；洗瓶；移液器用的试剂槽；蒸馏水或去离子水；计时器等.注意事项本测试盒不使用时应在2〜8℃下存放。不要使用过期的测试盒。不要把不同测试盒中的试剂混合使用。每次试验不要超过24个以上的孔。遵守正确的移液技术，包括取液前先用该液润洗一次。放置时间与本说明不一致时，可能会出现错误的结果。测试盒应先恢复到室温状态(18〜30℃)后才开始使用。避免测试盒在室温下长时间放置。不要使测试盒冻结。待测样品的pH值应为6〜8。酸碱过大的样品应进行调整。应将包括样品提取液在内的所有废液和实验器皿进行处理(如同已被DON毒素污染一样)。应始终穿戴手套和其它防护服。为了避免交叉污染，每个样品应使用清洁的吸咀和玻璃器皿，并在样品之间彻底清洗所有的玻璃器皿。.程序性的提示底物：底物随时可用，底物为清亮的浅兰色，如果变成了深兰，则弃去。使用时，只倒出所需量到试剂槽中，未用完的不要再倒回试剂瓶中。不使用时应盖住试剂槽，以避免光的照射。.操作步骤样品制备和提取待测样品应按公认的采样技术采集。样品应磨碎并充分混合后再提取。测试前，将样品在2〜8℃存放。取代表性样品。研磨样品至至少有75%的样品通过20目的筛子，颗粒尺寸大约相当于细的速溶咖啡。将10克研磨过的样品加入50ml水或去离子水中，用手或震荡器剧烈混合15分钟。将静置2-3分钟，使一些物质沉淀下来。用滤纸过滤出至少15ml的提取液。收集该滤液即为样品的待测液。测试程序测试前应将所有的试剂恢复至室温（18〜30℃）。从箔包中取红色标记的混合孔，放在孔架上。取同样数量的包被了抗体的孔。把暂不使用的孔放回到箔包中，并重新密封，以保护抗体。在带子的一端标上“1”，然后放到孔架上，将有标记的一端放在左边。不要在孔的里面和底部写标记。在使用之前摇动试剂瓶，混合每种试剂。从兰色标签的瓶内吸取100口1轭合物加到每个红色标记的混合孔内。每次使用新吸咀，吸取100口l控制标准溶液和样品液按下列顺序加到红色标记的混合孔内用移液器吸入、排出3次使孔内溶液彻底混合，吸取100口l加到相应的包被了抗体的孔内，在平的表面上将板前后滑动确保充分混合10〜20秒钟，不要溅出试剂，混合后于室温下（18〜30℃）放置10分钟。弃去红色标记孔。倒掉包被了抗体孔内的溶液。在每个孔内加满蒸馏水或去离子水，再倒出，如此重复5次，将板朝下，在吸水材料上拍击以去除所有的水滴。从绿色标签试剂瓶中倒出所需量的试剂到绿色试剂槽中。用移液器和新吸咀，吸取100口l底物加到每个孔内，在平的表面上将板前后滑动确保充分混合10〜20秒钟。7.2.10混合后放置5分钟。从红色试剂瓶中倒出所需量的试剂到红色试剂槽中。吸取100口l红色终止液加到每个孔内，在平的表面上将板前后滑动确保充分混合。用干净的布擦净板底，将板置于微型孔阅读器于450nm滤光片下读数。由于气泡会影响结果，应削除溶液中气泡。应在加入红色终