双水相萃取实验

5/5双水相萃取实验一、双水相系统的相图绘制

1.实验目的

了解制作双水相系统的相图的方法，加深对相图的认识。

2.实验原理

相图是研究两水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。图1是典型的高聚物-高聚物-水双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成、度的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。

图1A-B-水双水相体系相图

Oaqueoustwo-phasesystemFigure1ThephasediagramoftheA-B-H

2

3.实验器材和试剂

（1）器材：电子台秤，漩涡混合器，大试管，滴定管，密度计，温度计。（2）试剂：聚乙二醇，硫酸铵，硫酸镁。

4.操作方法

（1）溶液的配制

配制40%的盐（硫酸铵或硫酸镁）溶液

配制40%的聚乙二醇溶液，液体聚乙二醇可用纯溶液。

（2）相图的制作

精确称取一定质量（0.7000g左右）PEG溶液于大试管中，按表1所列第1列数据，加入0.5mL去离子水，用滴定管缓慢滴加已配好的40%的盐溶液，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止。记录盐溶液的加量(g)。然后，按表格所列第2列数据加入水，溶液澄清，继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。计算每次达到浑浊时，PEG和盐在系统总量中的质量分数，将实验数据填入表中，以PEG的质量分数为纵坐标，某种盐的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。

表1相图制作表

编

号水

/g(NH4)2SO4溶液加量/g纯(NH4)2SO4累计量/g溶液累计总量/g(NH4)2SO4质量分

数/%PEG质量分数/%10.53.13150.8954.378620.44.7920.32.17921.51865.951121.853.0230.32.04562.19.286722.652.2640.33.13723.012.673823.681.6550.56.07694.719.327624.521.0860.56.19096.526.013825.020.870.5

6.8585

8.5

33.4596

25.32

0.62

根据以上数据以(NH4)2SO4质量分数为横坐标，以PEG质量分数为纵坐标即可做出相图。

二、双水相系统比例的选择

根据相图，选择五个成相比例。

三、蛋白酶酶活标准曲线的绘制——Folin酚法或紫外分光光度法

PEG4000与MgSO4双水相图

y=0.0995x2-5.3887x+73.334

2012345

6

20

21

22

2324

25

26

MgSO4%

PEG4000%

紫外分光光度法测蛋白酶酶活

1．原理

蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

2．试剂和溶液

2.1三氯乙酸c=0.4mol/L：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。

2.2氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L

2.3盐酸溶液c（HCl）＝1mol/L及0.1mol/L

1mol/LHCl:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

0.1mol/LHCl：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

2.4缓冲溶液

a.磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶

称取磷酸氢二钠（Na

2HPO

4

·12H

2

O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH

2

PO

4

·12H

2

O）0.5g，

加水溶解并定容至1000mL。

b.乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶

甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。

乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000mL。

使用溶液取甲液8mL，加乙液1mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。

c.硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶

甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。

乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。

使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1000mL。

上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。

2.510g/L酪素溶液

称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，

在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。

2.6100ug/mLL-酪氨酸标准溶液

a．称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。

b．吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100ug/mLL－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。

3.仪器和设备

3.1恒温水浴40±0.2℃。

3.2紫外分光光度计

4分析步骤

4.1求K值

按下表配制不同浓度的L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）,根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值;（其K值应在（130～135）范围内）。

4.2测定

吸取适量稀释的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度（A）。

a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min；

b、按下列程序操作：

试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）

加酶液2.00mL加酶液2.00mL

40±0.2℃，2min40±0.2℃，2min

加三氯乙酸4.00mL（摇匀）加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）

40±0.2℃，10min（精确计时）40±0.2℃，10min（精确计时）

加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）加三氯乙酸4.00mL（摇匀）

继续加热10min，过滤或离心继续加热10min，过滤或离心

于275nm波长，测上清液吸光值于275nm波长，测上清液吸光值

c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其它操作同4.2。标准曲线作同样处理。

5计算

在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。

X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E

式中：X——样品的酶活力，(u/mL)；

A——试样溶液的平均吸光度；

K——吸光常数；

8——反应试剂的总体积，mL；

2——吸取酶液2.00mL；

1/10——反应时间10min，以1min计；

n——稀释倍数

E——紫外法与福林法的换算系数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77）。

所得结果表示至整数。

6结果的允许差

平行试验测定值之差不得超过3％。

四、双水相系统在蛋白酶分离中的应用

利用选择的五个成相体系对蛋白酶进行分离纯化