化学第三章 分子荧光 光谱法课件

第三章

分子荧光光谱法

MolecularFluorescenceSpectroscopy

第三章分子荧光光谱法

MolecularFluo1本章主要内容荧光分析法的基本原理1荧光分析仪2荧光法的应用34本章主要内容荧光分析法的基本原理1荧光分析仪2荧光法的应用2

自然界存在这样一类物质，当吸收了外界能量后，能发出不同波长和不同强度的光，一旦外界能源消失，则这种光也随之消失，这种光称为荧光。什么是荧光？自然界存在这样一类物质，当吸收了外界能量后，能发出不同3[化学]第三章分子荧光光谱法课件4[化学]第三章分子荧光光谱法课件53.1分子荧光产生机理

1.光谱类型

荧光光谱是物质分子吸收紫外光后产生的分子发射光谱。2.跃迁类型

分子中原子的电子能级跃迁，伴随振动能级的跃迁。3.1分子荧光产生机理1.光谱类型荧光光谱是物质6（1）分子的激发基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射，跃迁一次到位。3.分子的激发与失活单重态：一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。（1）分子的激发3.分子的激发与失活单重态：一个分子中所有7激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态寿命最短的占优势。

激发态分子不稳定，以辐射或无辐射跃迁的方式回到基态。（2）激发态分子的失活激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态寿命最短的占优8①无辐射跃迁振动弛豫：由于分子间的碰撞，激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。激发态分子常常首先发生振动驰豫。内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。

（3）失活的方式①无辐射跃迁振动弛豫：由于分子间的碰撞，激发态分子由同一9系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。含有重原子的分子中（如I、Br等），系间窜跃最常见。

外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用和能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。

系间窜越：10荧光：受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到达第一电子激发单重态的最低振动能级，以辐射的形式失活回到基态，发出荧光。由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比激发光波长长。②辐射跃迁荧光：②辐射跃迁11磷光：若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。由于激发三重态能量较激发单重态低，所以磷光的波长比荧光的波长稍长。磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光很少应用于分析。磷光：12l2l1l

3l

2S1T1系间跨越内转换振动弛豫S2S0能量T2内转换发射荧光发射磷光外转换振动弛豫l2l1l3l2S1T1系间跨越内转换振动弛豫S2134.荧光产生的过程：（1）处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；（2）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过无辐射跃迁降落到第一电子激发态的最低振动能级；（3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光：（4）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级．4.荧光产生的过程：（1）处于基态最低振动能级的荧光物质分14（1）具有合适的结构。只有少数具有某些结构特性的体系才会产生荧光现象。（2）具有一定的荧光量子产率。

5.分子产生荧光必须具备的条件物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：（1）具有合适的结构。只有少数具有某些结构特性的体系才会产生151）荧光与分子结构的关系

要求：有强的紫外可见吸收电子跃迁类型

*→的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常数较小，有利于荧光的产生。共轭效应含有*→跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能产生荧光。1）荧光与分子结构的关系要求：有强的紫外可见吸收电子跃迁类16取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基会使荧光增强。

给电子取代基如—NH2、—OH、—OCH3、—CN、—NHR、—NR2等，能增加分子的π电子共轭程度，使荧光效率提高。而-COOH、—NO2、—C=O、—F、—Cl等吸电子取代基，可减弱分子π电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。还有一类取代基则对荧光的影响不明显，如—R、—SO3H、—NH3等。取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基17平面刚性结构效应

可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。平面刚性结构效应18荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F）与①荧光物质的吸光程度②发射荧光的能力有关：

F=K′（I0—I）

I0

—入射光辐射强度；I

—透射光辐射强度；

K′—取决于荧光量子产率（Ф）。6.荧光强度与浓度的关系荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F）与6.荧光19Lambert-Beer定律：=Lambert-Beer定律：=20

溶液浓度较低时：当入射光的λ1和

I0一定时：

F=Kc

即：

在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。

————这是荧光法定量的基础。

溶液浓度较低时：21（1）内部因素自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。自吸收——荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。7.影响荧光强度的因素（1）内部因素7.影响荧光强度的因素22(2）环境因素

①温度温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率，因此会增加荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光产率增加3%，当温度降低至-80℃时，荧光产率为100%。

②pH值

含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生变化。(2）环境因素①温度②pH值

含有酸性或碱性取代基23(1).荧光激发光谱和荧光发射光谱荧光激发光谱（荧光物质的吸收光谱）：保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。8荧光光谱的特征激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。(1).荧光激发光谱和荧光发射光谱8荧光光谱的特征激发光谱24

荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长。荧光发射光谱使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发出的荧光通过发射单色器照射于检测器上，亦即进行扫描，以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长25200250300350400450500nm荧光激发光谱荧光光谱荧光强度激发光波长

荧光波长蒽的激发光谱和荧光光谱200250300350400450500nm荧光激发光谱荧262.激发光谱与发射光谱的关系镜像规则荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有关，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态中的振动能级的分布。S1S02.激发光谱与发射光谱的关系镜像规则S1S027Stokes位移Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长差值。荧光的波长总是大于激发光的波长。这是由于发射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能量。Stokes位移28荧光光谱的形状与激发光波长无关电子跃迁到不同激发态，吸收不同波长的能量，产生不同的吸收带，但荧光均是激发态电子回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态而产生的，这与荧光物质分子被激发至哪一能级无关。因此，荧光光谱的形状和激发光的波长λ1无关。荧光光谱的形状与激发光波长无关29关于激发光的波长λ1：①决定荧光物质是否能够产生吸收并发射出荧光；②能够使荧光物质产生吸收并发射出荧光的激发光的波长并不具有唯一性；③在保证激发的前提下，不同激发波长处的荧光发射光谱相同，但荧光强度不同。④在进行荧光测定时，须选择激发光波长以保证荧光强度最大。关于激发光的波长λ1：30（1）首先，在紫外光区内，固定激发光波长（可以任意选择几个）对荧光物质进行荧光发射光谱的扫描，从而确定产生最大的荧光强度时的荧光波长λ2；（2）固定荧光波长λ2，对荧光物质进行激发光谱的扫描，确定最佳的激发光波长λ1

。3.激发光波长λ1

和λ2的选择（1）首先，在紫外光区内，固定激发光波长（可以任意选择几个）31§3.2荧光(磷光)分光光度计一.主要组成及部件的功能光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器发射单色器§3.2荧光(磷光)分光光度计一.主要组成及部件的功能光32激发光源(lightsource)样品池(吸收池)(absorptioncell)单色器(monochromator)检测器(detecor)记录及数据处理器(display)仪器的主要部件激发光源(lightsource)仪器的主要部件33能够在紫外-可见光区连续发光，用卤钨灯、氙灯、高压汞灯或激光光源.激发光源卤钨灯高压汞灯高压氙灯能够在紫外-可见光区连续发光，用卤钨灯、氙灯、高压汞34样品池紫外-可见分光光度计

(吸收池)I0It荧光分光光度计样品池I0ItIF,p样品池紫外-可见分光光度计

(吸收池)I0It荧光分光光度35滤光片、棱镜、光栅单色器第一单色器——选择激发光波长λ1

（＞250nm的紫外光），称为激发单色器。第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2,与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。检测器光电池或光电倍增管,

光电二极管阵列式检测器问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？滤光片、棱镜、光栅单色器第一单色器——选择激发光波长λ1（36紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制荧光(磷光)分光光度计:光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理荧光(磷37

特点：（1）灵敏度高

比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；检测下限：0.1～0.1g/cm-33.3荧光分析方法与应用荧光辐射的波长比激发光波长长，测量到的荧光频率与入射光的频率不同；荧光在各个方向上都有发射，因此可以在与入射光成直角的方向上检测；荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及荧光分光光度计的灵敏度有关，测量用的样品量很少，且测量方法简便。特点：3.3荧光分析方法与应用荧光辐射的波长比激发光波长38②选择性好

凡是会发生荧光的物质首先必须会吸收一定频率的光，但会吸收光的物质却不—定会产生荧光。对于某一给定波长的激发光，产生荧光的物质发出的荧光波长也不相同，只要控制荧光分光光度计中激发光和荧光单色器的波长便可得到选择性良好的方法．③应用范围小能够引起荧光的化学物质较少大多数物质本身不会产生荧光,一些物质在加入某种试剂后能够产生荧光。②选择性好39一、定性分析

荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光谱，因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。定性方法：将特征光谱的形状、波长范围与标准品对照，看是否一致。一、定性分析荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光40F－F0cFx－F0cx二、定量分析

1.标准曲线法：F－F0cFx－F0cx二、定量分析1.标准曲线法：412.直接比较法

如果荧光物质的标准曲线过零点，且线性良好，可用直接比较法测定。在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，进行比较：2.直接比较法如果荧光物质的标准曲线过零点，且42三、荧光分析法的应用（1、有机物的荧光分析

三、荧光分析法的应用（1、有机物的荧光分析43无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。可通过与荧光试剂作用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭荧光反应进行荧光分析。非过渡金属离子的荧光配合物较多。可用于荧光分析的元素已近70种。荧光试剂是具有两个或以上与MZ+形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构。2、无机元素的荧光分析

OH

NSO3NaN=NOHHOON8-羟基喹啉石榴茜素R无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。可通过与荧光试剂作用44铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；45荧光成像CellCell标记抗体的荧光纳米颗粒被识别的目标细胞

目标细胞

3、在生命科学中的应用荧光成像CellCell标记抗体的荧光纳米颗粒被识别的46分子信标具有单碱基错配识别能力的分子信标探针，可以用于检测单细胞内基因的表达、突变等分子信标具有单碱基错配识别能力的分子信标探针，可以用于检测单47知识拓展—新型荧光材料荧光量子点、荧光纳米簇、荧光聚合物点知识拓展—新型荧光材料荧光量子点、荧光纳米簇、荧光聚合物点481.下列说法哪个是错误的？()荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应(2)最长的荧光波长与最长的激发光波长相对应(3)荧光光谱与激发光波长无关(4)荧光波长永远长于激发光波长21.分子荧光过程是()(1)光致发光(2)能量源激光发光(3)化学发光(4)电致发光32.在荧光光谱中,测量时,通常检测系统与入射光的夹角呈()(1)180°(2)120°(3)90°(4)45°1.下列说法哪个是错误的？4942.荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计的主要区别在于()(1)光路(2)光源(3)单色器(4)光电倍增管75.在分子荧光分析法中，以下说法正确的是 （）（1）分子中电子共轭程度越大，荧光越易发生，且向短波方向移动（2）只要物质具有与激发光相同的频率的吸收结构，就会产生荧光（3）分子中电子共轭程度越大，荧光越易发生，且向长波方向移动（4）非刚性分子的荧光强于刚性分子6.荧光是光致发光现象。荧光分光光度计是在与入射光束成直角的方向测定荧光，这是为了_____。荧光分光光度计通常备有两个单色器，其中一个是_____单色器，其作用是______，另一个是______单色器，其作用是_______。42.荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计的主要区别在于50ThankYou!ThankYou!51

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分子荧光光谱法

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第三章分子荧光光谱法

MolecularFluo52本章主要内容荧光分析法的基本原理1荧光分析仪2荧光法的应用34本章主要内容荧光分析法的基本原理1荧光分析仪2荧光法的应用53

自然界存在这样一类物质，当吸收了外界能量后，能发出不同波长和不同强度的光，一旦外界能源消失，则这种光也随之消失，这种光称为荧光。什么是荧光？自然界存在这样一类物质，当吸收了外界能量后，能发出不同54[化学]第三章分子荧光光谱法课件55[化学]第三章分子荧光光谱法课件563.1分子荧光产生机理

1.光谱类型

荧光光谱是物质分子吸收紫外光后产生的分子发射光谱。2.跃迁类型

分子中原子的电子能级跃迁，伴随振动能级的跃迁。3.1分子荧光产生机理1.光谱类型荧光光谱是物质57（1）分子的激发基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射，跃迁一次到位。3.分子的激发与失活单重态：一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。（1）分子的激发3.分子的激发与失活单重态：一个分子中所有58激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态寿命最短的占优势。

激发态分子不稳定，以辐射或无辐射跃迁的方式回到基态。（2）激发态分子的失活激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态寿命最短的占优59①无辐射跃迁振动弛豫：由于分子间的碰撞，激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。激发态分子常常首先发生振动驰豫。内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。

（3）失活的方式①无辐射跃迁振动弛豫：由于分子间的碰撞，激发态分子由同一60系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。含有重原子的分子中（如I、Br等），系间窜跃最常见。

外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用和能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。

系间窜越：61荧光：受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到达第一电子激发单重态的最低振动能级，以辐射的形式失活回到基态，发出荧光。由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比激发光波长长。②辐射跃迁荧光：②辐射跃迁62磷光：若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。由于激发三重态能量较激发单重态低，所以磷光的波长比荧光的波长稍长。磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光很少应用于分析。磷光：63l2l1l

3l

2S1T1系间跨越内转换振动弛豫S2S0能量T2内转换发射荧光发射磷光外转换振动弛豫l2l1l3l2S1T1系间跨越内转换振动弛豫S2644.荧光产生的过程：（1）处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；（2）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过无辐射跃迁降落到第一电子激发态的最低振动能级；（3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光：（4）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级．4.荧光产生的过程：（1）处于基态最低振动能级的荧光物质分65（1）具有合适的结构。只有少数具有某些结构特性的体系才会产生荧光现象。（2）具有一定的荧光量子产率。

5.分子产生荧光必须具备的条件物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：（1）具有合适的结构。只有少数具有某些结构特性的体系才会产生661）荧光与分子结构的关系

要求：有强的紫外可见吸收电子跃迁类型

*→的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常数较小，有利于荧光的产生。共轭效应含有*→跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能产生荧光。1）荧光与分子结构的关系要求：有强的紫外可见吸收电子跃迁类67取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基会使荧光增强。

给电子取代基如—NH2、—OH、—OCH3、—CN、—NHR、—NR2等，能增加分子的π电子共轭程度，使荧光效率提高。而-COOH、—NO2、—C=O、—F、—Cl等吸电子取代基，可减弱分子π电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。还有一类取代基则对荧光的影响不明显，如—R、—SO3H、—NH3等。取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基68平面刚性结构效应

可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。平面刚性结构效应69荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F）与①荧光物质的吸光程度②发射荧光的能力有关：

F=K′（I0—I）

I0

—入射光辐射强度；I

—透射光辐射强度；

K′—取决于荧光量子产率（Ф）。6.荧光强度与浓度的关系荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F）与6.荧光70Lambert-Beer定律：=Lambert-Beer定律：=71

溶液浓度较低时：当入射光的λ1和

I0一定时：

F=Kc

即：

在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。

————这是荧光法定量的基础。

溶液浓度较低时：72（1）内部因素自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。自吸收——荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。7.影响荧光强度的因素（1）内部因素7.影响荧光强度的因素73(2）环境因素

①温度温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率，因此会增加荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光产率增加3%，当温度降低至-80℃时，荧光产率为100%。

②pH值

含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生变化。(2）环境因素①温度②pH值

含有酸性或碱性取代基74(1).荧光激发光谱和荧光发射光谱荧光激发光谱（荧光物质的吸收光谱）：保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。8荧光光谱的特征激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。(1).荧光激发光谱和荧光发射光谱8荧光光谱的特征激发光谱75

荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长。荧光发射光谱使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发出的荧光通过发射单色器照射于检测器上，亦即进行扫描，以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长76200250300350400450500nm荧光激发光谱荧光光谱荧光强度激发光波长

荧光波长蒽的激发光谱和荧光光谱200250300350400450500nm荧光激发光谱荧772.激发光谱与发射光谱的关系镜像规则荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有关，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态中的振动能级的分布。S1S02.激发光谱与发射光谱的关系镜像规则S1S078Stokes位移Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长差值。荧光的波长总是大于激发光的波长。这是由于发射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能量。Stokes位移79荧光光谱的形状与激发光波长无关电子跃迁到不同激发态，吸收不同波长的能量，产生不同的吸收带，但荧光均是激发态电子回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态而产生的，这与荧光物质分子被激发至哪一能级无关。因此，荧光光谱的形状和激发光的波长λ1无关。荧光光谱的形状与激发光波长无关80关于激发光的波长λ1：①决定荧光物质是否能够产生吸收并发射出荧光；②能够使荧光物质产生吸收并发射出荧光的激发光的波长并不具有唯一性；③在保证激发的前提下，不同激发波长处的荧光发射光谱相同，但荧光强度不同。④在进行荧光测定时，须选择激发光波长以保证荧光强度最大。关于激发光的波长λ1：81（1）首先，在紫外光区内，固定激发光波长（可以任意选择几个）对荧光物质进行荧光发射光谱的扫描，从而确定产生最大的荧光强度时的荧光波长λ2；（2）固定荧光波长λ2，对荧光物质进行激发光谱的扫描，确定最佳的激发光波长λ1

。3.激发光波长λ1

和λ2的选择（1）首先，在紫外光区内，固定激发光波长（可以任意选择几个）82§3.2荧光(磷光)分光光度计一.主要组成及部件的功能光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器发射单色器§3.2荧光(磷光)分光光度计一.主要组成及部件的功能光83激发光源(lightsource)样品池(吸收池)(absorptioncell)单色器(monochromator)检测器(detecor)记录及数据处理器(display)仪器的主要部件激发光源(lightsource)仪器的主要部件84能够在紫外-可见光区连续发光，用卤钨灯、氙灯、高压汞灯或激光光源.激发光源卤钨灯高压汞灯高压氙灯能够在紫外-可见光区连续发光，用卤钨灯、氙灯、高压汞85样品池紫外-可见分光光度计

(吸收池)I0It荧光分光光度计样品池I0ItIF,p样品池紫外-可见分光光度计

(吸收池)I0It荧光分光光度86滤光片、棱镜、光栅单色器第一单色器——选择激发光波长λ1

（＞250nm的紫外光），称为激发单色器。第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2,与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。检测器光电池或光电倍增管,

光电二极管阵列式检测器问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？滤光片、棱镜、光栅单色器第一单色器——选择激发光波长λ1（87紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制荧光(磷光)分光光度计:光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理荧光(磷88

特点：（1）灵敏度高

比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；检测下限：0.1～0.1g/cm-33.3荧光分析方法与应用荧光辐射的波长比激发光波长长，测量到的荧光频率与入射光的频率不同；荧光在各个方向上都有发射，因此可以在与入射光成直角的方向上检测；荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及荧光分光光度计的灵敏度有关，测量用的样品量很少，且测量方法简便。特点：3.3荧光分析方法与应用荧光辐射的波长比激发光波长89②选择性好

凡是会发生荧光的物质首先必须会吸收一定频率的光，但会吸收光的物质却不—定会产生荧光。对于某一给定波长的激发光，产生荧光的物质发出的荧光波长也不相同，只要控制荧光分光光度计中激发光和荧光单色器的波长便可得到选择性良好的方法．③应用范围小能够引起荧光的化学物质较少大多数物质本身不会产生荧光,一些物质在加入某种试剂后能够产生荧光。②选择性好90一、定性分析

荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光谱，因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。定性方法：将特征光谱的形状、波长范围与标准品对照，看是否一致。一、定性分析荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光91F－F0cFx－F0cx二、定量分析

1.标准曲线法：F－F0cFx－F0cx二、定量分析1.标准曲线法：922.直接比较法

如果荧光物质的标准曲线过零点，且