分子生物学实验4限制性内切酶切

实验目的学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法，理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。背景知识上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR

I和EcoR

II，以及来源于流感 杆菌(Heamophilus

influenzae)的Hind

II和Hind

III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的片段。研究者很快发现内切酶是研究

组成、功能及表达非常有用的工具。限制性内切酶生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。这种切割作用是在DNA分子进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。1.分类类别识别位点切割位点需用ATPⅠ类非对称不特异，在识别位点1000bp外YesⅡ类4-6

bp，大多数为回文对称结构特异，在识别位点中或紧靠NoⅢ类5-7

bp非对称不特异，在识别位点下游24-26

bpYes2.命名1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.coli

用Eco

表示，所以用斜体字。

EcoRI，EcoRV。2

）

用

一

个

字

母

代

表

菌

株

或

型

，

如

流

感

菌(Heamophilus

influenzae)Rd菌株用d，即Hind。3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制酶，则以罗马数字表示，如HindⅠ,

HindⅡ，HindⅢ等3.限制性内切酶的选择根据实验的目的结合载体和 的特性选择合适的酶切位点；根据酶本身的属性酶的酶切效率；双酶切共用缓冲液；选择何种公司的产品：Fermentas、TaKaRa、NEB。4.酶切产物（1）粘性末端：如EcoRI的识别位点为：5’……

G↓AATTC

……3’3’……

CTTAA↑G

……5’在双链上交错切割的位置切割后生成：5’……G3’……CTTAAAATTC……3’G……5’（2）平末端例如EcoRV

的识别序列是：GAT

ATCCTA

TAG切割后形成GAT

ATCCTA

TAG同裂酶来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同同序同切酶同序异切酶SmaI和XmaICCC↓GGGC↓CCGGGSmaIXmaI同尾酶识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能酶切产生相同的黏性末端XbaI与SpeI;

XhoI与SalI;

BamHI与BglIIXbaI5’……

T↓CTAGA

……3’3’……

AGATC↑T

……5’SpeI5’……

A↓CTAGT……3’3’……

TGATC↑A

……5’5’……

TCTAGT……3’3’……

AGATCA

……5’5.酶切的方式单酶切/双酶切部分酶切/完全酶切单酶切环状DNA分子L-DN

段双酶切环状DNA两种限制酶识别序列数之和线性DNA两种限制酶识别序列数加1部分酶切限制性内切酶切割DNA【实验材料】实验材料及试剂质粒或目的

（DNA），双蒸无菌水，10×Buffer，EcoRI限制性内切酶实验用具及仪器不同量程的移液器和配套吸头，0.2lEppendorf管，微量离心机，塑料板，恒温水浴锅等pCAMBIA

130412361

bpkanamycin

(R)hygromycin

(R)mGFP5*pVS1

stagusA

(N358Q)N358-Q

Glycosylation

site

mutatiolacZ

alphaCaMV

35S

promoterpBR322

oripBR322

bomNco

I

(1)Bgl

II

(8)Spe

I

(15)Nhe

I

(5982)pVS1

repPml

I

(339)Histidine

tagNhe

I

(2541)Pml

I

(2564)Bst

EII

(2574)Nos

poly-AT-Border

(right)Sph

I

(2979)Hin

d

III

(11600)Sph

I

(11598)Pst

I

(11592)Sal

I

(11582)Xba

I

(11576)Bam

H

I

(11570)Sma

I

(11567)Kpn

I

(11565)Sac

I

(11559)EcoR

I

(11549)Xho

I

(9425)CaMV35S

polyAT-Border

(left)Sac

II

(8907)Bst

XI

(11306)CaMV35S

promoterXho

I

(10519)【实验步骤】1.配制酶切反应体系由于酶切体系为30μl，先根据下表需要使用试剂及用量，计算出需要补充双蒸水的体积，然后取1个200l离心管，按照ddH2O

、10×Buffer、质粒或

（DNA）、两种内切酶的加样顺序，配制酶切反应体系。试剂取样体积ddH2Oup

to

30

μl10×Buffer3.0

μl质粒或

（DNA）10.0μl（约1μg）限制性内切酶1.0

μl酶切反应配制好酶切反应体系，用手指轻弹离心管管壁使溶液充分混匀，用微量离心机离心15秒。将离心管置于

塑料板上，在最适反应温度（一般为37°C）下反应2-4h。如果酶切样品是PCR产物，需要酶切过夜，使酶切完全。终止酶切反应待反应完全后，将离心管置于65°C保温10min，灭活限制酶，终止酶切反应，以进行下一步操作。实验注意事项限制性内切酶用量可按标准体系1μg

DNA加1单位酶，消化1-2h。吸样量一定要准确。酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。要求在冰上操作，并充分混匀。开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。样品在37℃与65℃保温时，将离心管 ，以防水进入管内造成实验失败。市场销售的酶一般浓