生物学研究方法简介

生物学研究方法

一、细胞形态结构的观察方法

肉眼的分辨率一般只有0.2mm，很难识别单个细胞；光学显微镜的分辨能力达0.2m，借此发现了细胞；电子显微镜分辨能力高达0.2nm，将细胞的超微结构展现在人们面前。

光学显微镜

普通复式光学显微镜2.相差显微镜和微分干涉显微镜3.荧光显微镜4.激光扫描显微镜

电子显微镜

基本步骤

1.固定2.脱水（清洗后用系列梯度丙酮或乙醇浸泡）3.包埋4.置温箱中聚合5.修块6.切片7.收集切片于载网上8.染色9.电镜观察

负染色技术

经纯化的细胞组分或结构，如线粒体基质、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等可以通过电镜负染色技术显示其精细结构，分辨率可达1.5nm左右。负染色是用重金属盐，如吴磷钨酸或醋酸双氧铀溶液对铺展在载网上的样品进行染色。吸去多余染料，样品自然干燥后，整个载网都铺上了一薄层重金属盐，从而衬托出样品的精细结构。

冷冻刻蚀技术

冷冻刻蚀技术的样品制备过程包括冰冻断裂与蚀刻复型两步，因此又称冰冻断裂-蚀刻复型技术。用快速低温冷冻法，在液氮或液氦中将样品迅速冷冻，然后再低温下进行断裂。这时冷冻样品往往从其结构相对“脆弱”的部分（即脂膜双分子层的疏水端）裂开，从而显示出镶嵌在膜脂中的蛋白颗粒。经过一段时间的冰的升华（又称蚀刻），进一步增强“浮雕”样的效果。再用铂等金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸断裂面的电子反差，接着用碳进行垂直喷镀，在断裂面上形成一层连续的碳膜。最后用消化液吧生物样品消化掉，将复型膜移到载网上，并在电镜下进行观察

冷冻蚀刻几乎是主要用来观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌表征，图像附有立体感，样品不需要包埋甚至不需要固定，因而能够更好的保持样品的真实结构。

扫描隧道显微镜（STM）

二、细胞及其组分的分析方法

用超离心技术分离细胞组分

用低渗匀浆、超生破碎或研磨等方法可使细胞质膜破损，形成细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器和细胞组分组成的混合均桨，再通过差速离心，即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒组分分开。

密度梯度离心是将要分离的细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的，高溶解性的惰性物质（如蔗糖）形成的密度梯度表面，通过重力或离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉降带。

密度梯度离心又可分为速度沉降和等密度沉降，常用的介质有蔗糖和氯化铯。

速度沉降：主要用于分离密度相近而大小不一的细胞组分。离心前，要将分离的细胞匀浆物放置在蔗糖浓度梯度溶液的上层，各种细胞组分根据它们的大小以不同的速度沉降，形成不同的沉降带，然后分别收集不同的沉降带中的组分，用于分析

等密度沉降：用于分离不同密度的细胞组分。细胞组分在连续密度的高密度介质中经离心力场长时间的作用沉降或漂浮到与自身密度相等的位置，形成不同密度梯度带。这种方法非常灵敏，甚至可以将掺入重同位素。如用的生物大分子将未标记物分开。利用N15标记大肠杆菌DNA，并用氯化铯等密度沉降法直接证明了DNA的半保留复制。

细胞成分的细胞化学显示方法

为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂质等细胞组分，通常利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基因特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和相对含量。

例如福尔根反应可以特异显示紫红色的DNA的分布，利用希夫试剂反应呈紫红色。

PAS反应则利用碘酸氧化作用生成醛基，醛基与碱性品红反应产生紫红色化合物，用于确定多糖的存在。

四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，用以证明脂滴的存在。而苏丹lll（深红色）染色则通过扩散进入使脂滴着色。

特异蛋白抗原的定位于定性

免疫荧光技术

所谓免疫荧光技术就是将免疫学方法（抗原-抗体特异结合）与荧光技术结合用于研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法，包括直接和间接免疫荧光技术两种。

实验的主要步骤有抗体的制备、标本的制备。免疫染色和观察记录。标本处理多种方式，组织切片、冷冻切片等等，宗旨只有一个，尽量保持被检测蛋白质的抗原性。

免疫电镜技术

免疫荧光技术快速、灵敏、特异性强，但其分辨率有限。免疫电镜技术能有效地提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。

可分为免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术、免疫胶体金技术。免疫胶体金技术有诸多优点：如在电镜下金颗粒容易识别、并可以支撑不同直径的金颗粒，用以双重标记或多重标记。

细胞内特异核酸的定位与定性

细胞内特异核酸（DNA或RNA）的定性与定位的研究，通常采用原位杂交技术。用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的方法称为原味杂交。

原位杂交技术首先是在光镜水平上发展起来的，放射性同位素标记的探针与样品中的DNA或RNA杂交后，用显微放射自显影的方法显示杂交物的存在部位；或用荧光素标记的探针进行杂交，在荧光显微镜下直接显示细胞中与探针杂交的特异核酸。

三、细胞培养与细胞工程

细胞培养

细胞培养是将从机体中取出的细胞，置于一定的生长基质中，并给以恒定的培养环境，并使这些细胞在体外继续生长和分离的技术。

细胞培养技术按方式可分为两种，一是群体培养，将含有一定数量的细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，会合后形成均匀的单细胞层。二是克隆培养，将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，此种集落成为一个克隆。

植物细胞培养

是指在离体无菌条件下，将损伤组织或其它易分散的组织于培养基中进行培养，得到分散成的游离细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。其理论基础是植物的单个细胞具有全能性。植物细胞按培养系统可分为悬浮培养、液体培养和固定化培养等。

目前植物细胞培养主要有两种类型：1.单倍体细胞培养：这种培养方法主要用于花药在人工培养基上进行培养。2.原生质体培养：一般用植物的体细胞（二倍体细胞），先经纤维素酶除去细胞壁，去壁的细胞叫做原生质体。

植物细胞培养的实际应用包括：获得再生植株、消除病害、种质的长期贮藏、合成次生代谢产物。合成药用代谢产物、天然食品、杀虫剂、饲料等。

动物细胞培养

将动物的组织或细胞分散成单个细胞，模拟体内的生长环境，使其在体外环境继续生长繁殖的过程，叫做细胞培养。体外培养的动物细胞可分为原代细胞与传代细胞。原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞，进行传代培养后的细胞即称为传代细胞。

任何动物细胞的培养均需从原代细胞做起，动物很多组织的细胞，如幼年动物的肾、肺、卵巢、精巢、肌肉及肿瘤等组织的细胞较容易培养；而神经细胞的较难培养。

原代细胞培养步骤如下:首先从健康动物体内取出皮细胞，剪碎，用浓度和活性适中的胰酶和胶原酶与EDTA等将细胞连接处酰化分散，给予良好的培养液与无菌培养环境（接近体温与体内PH），在培养瓶中进行静止或慢速转动培养，培养液中加一定量的小牛或胚牛血清，这样才有利于细胞的贴壁生长和分裂。分散的细胞悬液在培养瓶中很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。分散呈球状的细胞一经贴壁就迅速铺展并开始有丝分裂，逐渐形成致密的细胞单层，称为单层细胞，这种培养方法叫做单层细胞培养。

培养小鼠细胞，首先从健康小鼠体内取出皮细胞，剪碎，用浓度和活性适中的胰酶和胶原酶与EDTA等将细胞连接处酰化分散，给予良好的培养液与无菌培养环境（接近体温与体内PH），在培养瓶中进行静止或慢速转动培养，培养液中加一定量的小牛或胚牛血清，这样才有利于细胞的贴壁生长和分裂。

细胞融合与单克隆抗体技术

细胞融合

两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合。

介导动物细胞融合常用的促融剂有灭活的病毒（如仙台病毒）或化学物质（如聚乙二醇，PEG）。植物细胞融合时，要先用纤维素酶去掉细胞壁，然后才便于原生质体融合。或者电融合：将悬浮细胞在低压交流电场中聚集成串珠状细胞群，或对相互接触的单层培养细胞，再施加高压电脉冲处理使其融合。

细胞融合可以在基因型相同的细胞间进行，也可以在基因型不同的细胞间进行。基因型相同的细胞形成的细胞融合成的融合细胞称为同核体。不同的叫做异核体。

单克隆抗体技术

动物受到抗原刺激后可发生免疫反应，产生相应的抗体。这一职能是由B淋巴细胞来承担的。一个B淋巴细胞只能产生一种抗体，因此想要获得大量纯一的抗体，就必须使一个B淋巴细胞大量增殖。可使B淋巴细胞的寿命是有限的，在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞不能无限大量增殖。

英国科学家milestein和kohler开创了将产生抗体的单个细胞同肿瘤细胞融合的技术。癌细胞在体外培养条件下可以无限传代，是“永生”的细胞。为了大量制作纯一的单克隆抗体，他们的设计方法是：

把小鼠髓瘤细胞（由骨髓中的浆细胞转化为恶性的肿瘤细胞）同经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）在聚乙二醇或病毒的介导下发生融合。融合的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌抗绵羊红细胞的抗体，一方面像瘤细胞一样可以在体外培养条件下或移植到体内无限增殖，从而分泌大量抗体。

B淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤之一就是使骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合。

目前的通用方法是利用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移缺陷型（HGPRT）和胸腺核苷激酶缺陷型（TK）骨髓瘤细胞株，这两种缺陷型细胞在HAT选择培养液中不能存活，而被淘汰。HAT选择培养液对淋巴细胞无影响，但淋巴细胞在培养条件下不能长期存活，因而也被淘汰。

HAT选择培养液由次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶三种组分组成，氨基蝶呤阻断DNA的合成。另外细胞中DNA合成的应急途径是由HGPRT和TK所催化的，所以两种缺陷此酶的瘤细胞植株不能存活。

骨髓瘤细胞和脾细胞融合成的杂交瘤细胞，由于继承了脾细胞合成HGPRT酶和TK酶的能力，故可在培养液中长期生存。这种能长期生存并且能够分泌抗体的杂交细胞，叫做B淋巴细胞杂交瘤细胞。杂交细胞可以通过克隆化培养形成细胞系。单克隆杂交瘤细胞可在体外培养，从培养液中提取杂交瘤细胞所分泌的抗体。这种由单一杂交瘤细胞克隆分泌的抗体叫做单克隆抗体。

单克隆抗体是单个杂交瘤细胞增殖产生的克隆细胞群所分泌的高度纯一的抗体。

单克隆抗体技术的实验成功，不仅在免疫理论上有着重要意义，而且在时间上有着巨大的实用价值。在医学上的用途十分广泛，抗病毒单克隆抗体已经用于临床，用于诊断流感病毒类型和狂犬病的治疗。此外也用于组织相溶性抗原的分类，寄生虫病的诊断，单克隆抗体最受重视的用途是在肿瘤诊断和治疗方面。

四、细胞及生物大分子的动态变化

荧光漂白恢复技术

荧光漂白恢复技术（FRP）是使用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质偶联，用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部的运动及其迁移速率。

FRP的原理是：利用高能激光束照射细胞的某一特定区域，使该区域的某一特定区域，使该标记的荧光分子发生不可逆淬灭，这一区域称作光漂白区。随后，由于细胞中脂质分子或蛋白分子的运动，周围非漂白区的荧光强度逐渐恢复到以前水平，这一过程叫荧光恢复。荧光恢复的速度很大程度上反应荧光标记的脂质或蛋白质在细胞中的运动速率。

单分子技术与细胞生命活动的研究

与生命科学相关的单分子技术是在细胞内实时观测单一生物分子运动规律的技术，它可以在纳米空间尺度和毫秒时间尺度上精确测量单分子的距离、位置、指向、分布、结构以及各种动态过程。

酵母双杂交系统

酵母双杂交系统是一种利用单细胞真核生物酵母在体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的系统。

酵母双杂交系统的建立得益于真核生物调控转录起始过程的认识和DNA重组质粒的构建技术。基因转录需要转录激活因子的参与，转录激活因子一般由两个或两个以上相互独立的结构域构成，即DNA结合域（DB）和转录激活域（AD）。前者可识别DNA上的特异转录调控序列并与之结合；后者可与其他成分作用形成转录复合体，从而启动