转基因克隆技术

转基因克隆技术转基因克隆技术转基因克隆技术xxx公司转基因克隆技术文件编号：文件日期：修订次数：第1.0次更改批准审核制定方案设计，管理制度转基因克隆技术研究进展摘要：转基因克隆技术是最近发展起来的利用细胞核移植技术生产转基因动物的方法，它是以动物体细胞为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。与传统转基因方法相比具有明显的优势。本文概述了传统转基因技术的缺陷、转基因克隆技术的优越性、研究概况以及目前存在的问题等。关键词：转基因动物克隆转基因克隆引言：转基因动物(transgenicanimal)是指用人工方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因组整合，并随细胞的分裂而增殖，从而将外源基因稳定地遗传给下一代的工程化动物。[1]在转基因动物作为当今生命科学中一个发展最快、最热门的领域正在改变着生物医药、农业生产、环境保护、生物材料，甚至是整个生命科学的研究与发展面貌的时代背景下，如何高效率低成本的生产出所期望的转基因动物已成为科学界甚至商界关注的热点。克隆(cloning)是英语“clone”音译，来源于希腊语“klon”[2]，原意是扦插枝条，即无性繁殖。动物克隆指不通过精子和卵子受精过程而获得与亲本具有相同遗传物质后代的过程。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，所以在一般情况下人们往往把它称为动物克隆技术。克隆技术的发展为转基因动物的研究应用带来了契机，两者的结合既有迫切性又有必然性。而且，这种结合不仅仅是简单的技术叠加，而是技术的重组、综合和优化[3]。转基因克隆动物技术是转基因动物技术与克隆动物技术的有机结合，它是以动物体细胞(包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等)为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。[3]转基因技术与克隆技术结合，创建转基因克隆动物，已经成为本世纪培育遗传工程动物的主导性技术途径。转基因克隆技术作为一种高效而低成本生产转基因动物的技术已经为转基因动物的生产带来了新的契机。本文概述了传统转基因技术的缺陷、转基因克隆技术的优越性、研究概况以及目前存在的问题等。1.动物传统的转基因技术概述现代转基因动物研究始于20世纪80年代初。1980年，Gordon等首次报道用显微注射法获得转基因小鼠。1982年，Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵的雄性原核中，获得了个体比对照鼠增大一倍的“超级小鼠”，从此揭开了转基因动物研究的新篇章[1，4]。先后出现了显微注射法、反转录病毒载体法、胚胎干细胞介导法、精子载体法等转基因动物生产技术。但是由于这几种方法都各自存在一些缺点，所以在技术上制约了转基因技术应用于转基因动物生产的发展速度，现分述如下。显微注射法存在转基因的整合是随机的，因此整合的位点、拷贝等均难以精确控制。同时随机整合也可造成较严重的插入突变，影响受体动物基因组的其他结构和功能，无法满足精确修饰的要求。反转录病毒载体法只能通过嵌合体途径获取纯系转基因动物，实验周期长;目的基因不能超过100kb;由于含有病毒DNA，可能会出现病毒自身复制和表达的现象，安全性令人担忧。胚胎干细胞介导法适用物种少[5，6]，只能适用于已建立了真正的ES细胞系的小鼠。此外动物育种需经过嵌合体途径，受ES细胞的生殖嵌合能力以及交配机率的影响，实验周期较长。精子载体法和"受精卵显微注射"途径一样具有目的基因整合的随机性和无法早期验证修饰事件等不足之处。上述几种转基因技术中常用的方法的不足的确在技术上制约了转基因技术在各个方面的应用范围，总的来说转基因技术存在以下问题：(1)整合和表达效率低用显微注射法一次可向一个卵中注射几百个转基因拷贝，但总是单位点整合或单位点多拷贝整合，Hochic等[7]研究了显微注射法的转基因动物总效率为%，田小利等[8]对大鼠的统计结果阳性率为%，总效率为1%。说明转基因动物的总效率很低。转基因的整合还可造成宿主细胞基因的突变，导致四肢畸形、死胎、木乃伊等现象的发生。(2)转基因的遗传率低许多研究表明，转基因动物及其后代并不能够保证外源基因世代传递，外源基因整合后容易从基因组型中消失，并不能在任何情况下连续传代。只有单位点整合才能以孟德尔方式遗传[9]。(3)生产成本高由于基因整合与表达效率较低，生产一头有用的转基因动物，需用大量供体和受体动物，涉及很高的研究费用，转基因动物产业化受到很大限制。据Wall等[10]计算，生产一头祖代转基因猪需花费万美元，生产一头转基因牛需要50万美元。如果用体外成熟和体外授精方法，成本约可降低1/3。2.转基因克隆技术生产转基因动物的优越性转基因克隆技术用于生产转基因动物的可行性和优越性在于它直接以胎儿体细胞为转基因受体细胞，继而以转基因体细胞为核供体制作转基因克隆动物。其采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件进行转基因整合预检，减少了受体动物的数目，不需要用受体母畜来承担那些非转基因的胚胎。同时，可事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞进行筛选，简化了转基因动物生产的许多环节，节约了人力，具有很大的优越性。另外，结合胚胎性别鉴定技术可以通过鉴别核供体的核型而预先得知转基因动物的性别，从而选择性地制备雌性的转基因动物，有利于外源基因在母乳中的表达以使生产的转基因动物获得期望的性状。用转基因克隆技术制作转基因动物的效率提高了。这是因为用作核供体的细胞是确证整合了某一外源结构基因的细胞，一旦核移植成功，就意味着得到了转基因动物。3.转基因克隆技术的研究概况转基因克隆技术在国外的发展自从多莉诞生的近十年来，转基因克隆技术不断的被应用于转基因动物的的制作，并且越来越向服务于人类服务于生产靠近。1997年，第一只成年体细胞克隆绵羊“多莉”诞生后不久，Wilmut研究小组[11]于1997年6月报道用胚胎细胞为核供体，获得了表达治疗人血友病的凝血因子IX转基因克隆绵羊“波利”(Polly)，由此第一只转染了人凝血因子IX基因的转基因克隆绵羊也顺利诞生。1998年，Cibelli等[12]成功制备出转LacZ基因的克隆牛。1999年，Baguisi等[13]用含人抗凝血酶基因的山羊胎儿体细胞进行核移植，得到了三只转基因克隆山羊，经诱导泌乳证明能高效表达人抗凝血酶，首次证实含外源基因的山羊胎儿细胞能克隆得到转基因的个体，为转基因克隆法生产转基因山羊展示了广阔的前景。2000年McCreath等[14]报道了世界上第一只基因打靶克隆绵羊的诞生，为特定基因修饰的转基因动物研究带来了全新的方法。2001年，曾经参与克隆小羊多利的英国PPL医疗公司4月宣布，该公司研究人员成功地培育出5只转基因克隆猪。这是人类首次培育出转基因克隆猪，标志着异种器官移植研究又向前迈进了重要的一步。同年，Denning等[15]成功制备出灭活了原蛋白基因〔PrP)、α-1，3半乳糖转移酶基因(GGTA1)的克隆绵羊。2002年，Dai等[16]以及Lai等[17]获得了灭活了α-1，3半乳糖转移酶基因(GGTA1)的克隆猪。特别是Lai等[17]通过两次核移植制备出完全灭活两条α-1，3半乳糖转移酶等位基因的克隆猪，向着为人类提供异种器官的目标迈出了坚实的一步。转基因克隆技术在我国的发展在多莉诞生之后，我国的科学家奋起直追。2002年，成勇等[18]用成年转基因山羊的成纤维细胞和卵巢颗粒细胞克隆得到转基因克隆山羊，首次证实含外源基因的成年山羊体细胞也能克隆得到个体。邹贤刚、成勇等[19]用转染了外源基因(neo)的山羊胎儿成纤维细胞克隆得到5只转基因克隆山羊，并且在克隆羊的体细胞中仍能检测到外源基因(neo)的表达。经过不懈努力，2003年，李宁等[20]的实验室培育出了转基因体细胞克隆牛“乐娃”和“岩娃”。其中，“岩娃”创造了两个世界纪录：一是首次转有人岩藻糖转移酶基因，使转基因体细胞克隆牛的牛奶，可望成为一种口服液用于治疗或预防人类胃溃疡疾病；二是首次在同一头牛中转有3种外源基因。在世界上首次克隆出了转岩藻糖基因，转人乳铁基因，转溶菌酶基因。之后龚国春等以不同类型的转基因细胞为核供体生产牛的转基因克隆胚胎。2004年，龚国春等[21]又利用转基因克隆技术成功的获得了转基因牛。2005年，张运海，潘登科等[22]利用转基因克隆技术生产了表达绿色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎。2006年，东北农业大学刘忠华教授带领的课题组[23]成功培育出我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪，是世界上继美国、韩国、日本之后的第四例成功通过转基因克隆技术生产出的绿色荧光蛋白转基因猪。4.转基因克隆技术目前存在的问题转基因的供体细胞核是否会影响核移植效果关于外源基因对核移植是否有影响，不同的实验得出的结论不同。有报道称，转入的外源基因对牛的体细胞核移植有负面影响[[24，25]。而Rohet等人[26]报道，将转染了绿色荧光蛋白基因(GFP)的牛胎儿成纤维细胞进行核移植时，重构胚的体外发育等情况与未转染的细胞无差异。外源基因在制备的转基因动物中表达效果不一在已制备的转基因克隆山羊中，外源基因的表达效果也不相同。Baguisi等[12]用转基因山羊F代的胎儿体细胞克隆得到个体，外源基因的表达量与其F1代转基因山羊的表达量相似。Keefer等[27]将绿色荧光蛋白基因转染到山羊胎儿成纤维细胞中，并克隆得到一只转基因克隆山羊，可是，在转基因克隆山羊的细胞中不能直接检测到绿色荧光蛋白基因的表达。邹贤刚、成勇等[28]用转染了neor基因的山羊胎儿成纤维细胞克隆得到转基因克隆山羊，并在其细胞中检测到neor基因的表达。5.展望转基因克隆动物技术用于生产转基因动物的研究开发已成为当今动物克隆技术最重要的应用方向之一。转基因克隆技术是21世纪创建遗传工程动物的主导性技术，对该技术的研究可以迅速实现转基因动物的应用推广和产业化。但是由于转基因克隆技术还存在着上述几方面的问题，对于如何解决这些问题，更好的利用转基因克隆技术高效而低成本的获取期望的转基因动物将会是今后转基因克隆技术走向成熟化要解决的首要问题，这些问题也将会是21世纪研究领域争论的热点。参考文献：[1]陆得如,陈永青主编.2002.基因工程.北京:化学工业出版社,121～122[2],JM.Alexander,AR.Willianm,etal.HumanfactorIXtransgenicsheepproducedbytransferofnucleifromtransfectedfetalfibroblasts.Science,1997,278:2130～2133.[3]张福德，王建荣.转基因克隆动物研究[Pl.生物技术通报，1999,4:16～18.[4]刘建忠,李宁,丁翔等.1998.转基因动物研究进展,农业生物技术学报,6(3):269～276[5]林莉,胡佐忠.2005.转基因动物技术的研究进展.畜禽业,(5):20～23[6]李丽立,杨坤明主编.2002.现代生物技术与畜牧业.北京:科学出版社,1930[7]HochiSI,NinomiyaT,HonmaM,etal.SuccessfulproductionoftransgenicBiotech.1990;1:175～184.[8]田小利,陈兰英.转基因动物研究中存在问题.生物工程进展,PROGRESSINBIOTECHNOLOGY.1995.～44

.[9]PalmiterRDBR,HammerRE,TrumbauerME,etal.Dramaticgrowthofmicethatdevelopfromeggsmicroinjectedwithmetallothionein-growthhormonefusiongenes.Nature1982;300:611～615.[10]RobertJ.Wall..ProductsofRecombination.Science1January1993259:109[11]SchniekeAEKA,RitchieWA,MycockK,etfactorIXtransgenicsheepproducedbytransferofnucleifromtransfectedfetalfibroblasts.Science.1997;278:2130-2133.[12]CibelliJBSS,GoluekePJ,KaneJJ,etal.Clonedtransgeniccalvesproducedfromnonquiescentfetalfibroblasts.Science.1998;280:1256-1258.[13]BaguisiABE,MelicanDT,PollockJS,etal.ProductionofgoatsbysomaticcellnuclearBiotechnol.1999;17:456-461.[14]McCreathKJHJ,CampbellKH,ColmanA,etal.Productionofgene-targetedsheepbynucleartransferfromculturedsomaticcells.Nature2000;405:1066-1069.[15]DenningCBS,AinslieA,BrackenJ,etal.Deletionofthealpha(1,3)galactosyltransferase(GGTA1)geneandtheprionprotein(PrP)geneinsheep.NatBiotechnol.2001;19:559-562.[16]DaiYVT,BooneJ,ChenSH,etal.Targeteddisruptionofthealphagalactosyltransferasegeneinclonedpigs.NatBiotechnol.2002;20:251-255.[17].LaiLK-SD,ParkKW,CheongHT,etal.Productionofalpha-deficientpigs.Science2002;299:411-414.[18]成勇，王玉阁，罗金平，等.由成年转基因山羊体细胞而来的克隆山羊.生物工程学报2002;18:79-83.[19]ZouXWY,ChengY,YangY,etal.Generationofclonedgoats(Caprahircus)fromtransfectedfoetalfibroblastcells,theeffectofdonorcellcycle.MolReprodDev.2002;61:164-172.[20]龚国春,戴蕴平,樊宝良,等.以不同类型的转基因细胞为核供体生产牛的转基因克隆胚胎.中国科学,C辑,2003,33(6):532-538[21]龚国春((2004)利用体细胞核移植技术生产转基因牛.[博士学位论文]中国农业大学[22]张运海，潘登科等.利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎.中国科学C辑生命科学2005,35(5):439-445[23]黑龙江日报.2006年12月27日[24]Arats,Gibbons,J.,Rzucidlo,s.,etal.Invitrodevelopmentofbovinenucleartransferembryosfromtransgenicclonallinesofadultandfetalfibroblastcellsofthesamegenotype.BiolReprod.2002;66:1768-1774.[25]ZakhartchenkoV,Mueller,S.,Alberio,R.,etal.Nucleartransfer