体积排阻色谱和光散射技术市公开课金奖市赛课一等奖课件

SizeExclusionChromatographywithLightScatteringDetection(SEC-MALS)LightScatteringUniversityWyattTechnologyCorporationCHINA第1页主要内容SEC技术与SEC-MALS技术仪器参数确定小结第2页多角度光散射法：两种测定模式单机模式(Batchmode)Mw(weight-averagedmolarmass)，Rz(z-averagedRMSradius)，A2无法测定：样品多分散性系数（

PDI

）；联机模式(Onlinemode,flowmode)MolarMass，RMS，Distributions，PDI；第3页SEC=SizeExclusionChromatography（体积排阻色谱）SizeExclusionChromatography(SEC)：

基于高分子分子尺寸大小不一样而分离色谱法。（分子尺寸大小：hydrodynamicvolume.）MALS=Multi-AngleLightScattering（多角度光散射）SEC-MALS:多角度光散射与体积排阻法联用技术什么是

SEC-MALS?第4页体积排阻色谱第5页传统SEC

假设弊端Sizeexclusionchromatographyofnativeandreduced,carboxymethylatedRnaseAdaptedfrom“Size-exclusionchromatographywithon-linelight-scattering,absorbance,andrefractiveindexdetectorsforstudyingproteinsandtheirinteractions”byJ.Wen,etal.,Anal.Biochem.240155–166(1996).传统SEC

假设待测样与标样性质相同：构象相同；密度相同；与柱填料无任何相互作用。第6页高分子表征需要BSALSRIMwDextranLSRIMw多分散性样品:Mn,Mw,Mz,PDI(Mw/Mn)单分散性样品:检测，识别聚集体以及各组分数量。第7页经典光散射与色谱联用配置第8页对于水相体系，提议使用0.1µm对流动相过滤；而对于有机相体系，提议使用0.2µm对流动相过滤；使用在线脱气装置（In-linedegasser）；添加在线过滤器（

In-linemembranefilter）：

水相体系：PEEK材质在线过滤器；有机相体系：不锈钢材质在线过滤器；

逐步增加或降低流速，切不可大幅度调整流速；SEC-MALS测定法几点提议*以上提议有利于延长泵、柱子寿命（即使不使用光散射仪）。第9页摩尔质量-定义Numberaveragemolarmass:Weightaveragemolarmass:Z-averagemolarmass:色谱洗脱曲线中，每一洗脱体积其摩尔质量由光散射仪测定。色谱洗脱曲线中，每一洗脱体积其浓度由浓度型检测器测定。第10页范例:2个分子(“1-mer”和

“9-mer”)相对分子质量分别是1和9ass范例：摩尔质量计算第11页LSRI多分散性样品摩尔质量Mn<Mv<Mw<MzMw

直接有LS测定良好SEC分离效果是准确测定摩尔质量主要前提。MzMwMpMn第12页均方根半径（旋转半径）MeanSquareRadius:

z-averagemeansquareradius

直接由MALS测定

。Astra直接计算出数均、重均以及z-均方根半径。

RootMeanSquare(rms)Radiusrg:单分子链中质量为mj链段多分散性高分子：Z-averageMeanSquareRadiusmjrj第13页模板参数创建（TemplateGeneration）:归一化系数（Normalizationcoefficients）

激光光电二极管检测能力差异修正延迟体积（Alignment）：

检测器间管路体积。宽峰校正（Bandbroadening）：

样品稀释效应修正。仪器系统有效性确认（SystemValidation）模板参数创建与系统有效性确认第14页建立仪器参数:“第一针”--BSAASTRA经过仪器配置自动识别、标识不一样仪器、并存放数据。也能够支持第三方检测器如UV、RI等。LS90°UV第15页数据分析-Baselines设定LS与浓度信号基线设定基线时，其应覆盖可能基线漂移区。

第16页数据分析

–Peaks单分散性高分子：选峰范围对结果影响很小。多分散性高分子：选峰范围对结果影响较大。LSUV,

RI第17页使用各向同性高分子对（不包含90度角）不一样角度光电二极管相对于90度进行归一化。修正光电二极管灵敏度及几何形状差异。归一化要求:各向同性散射体必须用流动相配制。同一检测池中使用。数据分析–Normalization惯用归一化标样

水相:10,000-40,000g/moldextran,pullulan,BSA(0.02μm过滤头)

有机相:10,000-40,000g/molpolystyrene或

PMMA第18页光散射信号叠加图（Overlayplots）归一化后，光散射信号叠加图能够评价归一化效果：归一化效果；是否存在杂散光（Straylight）；流通池污染，池窗污染等。Baseline设定是否合理。第19页修正LS与浓度型检测器之间管路体积

。

只有单分散性样品才能使用Alignment数据分析:AlignmentUVLSRI第20页为何使用单分散性样品修正?Alignment&BandBroadening修正单分散性样品LS

&RI信号重合第21页Alignment&BandBroadening修正

为何不能使用多分散性样品?多分散性样品LS&RI不可能重合

(不能使用alignment修正)LSRI第22页检测器间宽峰效应：BandBroadening样品随流动相依次经过DAWN、

RI时，造成峰变宽宽峰效应致使

LS

&RI

分离Mwdata第23页检测器间宽峰效应：BandBroadeningASTRA能修正检测器间宽峰效应第24页参数详细信息与SEC、溶剂相关?与样品种类相关?Calibration90°LSdetector（甲苯体系）NoNoNormalization同一检测池,同一溶剂同一各性同向散射体MaybeNoDelayVolume&BandBroadeningCorrection相同检测池，

不一样检测器间管路,

单分散性样品NoNo仪器参数第25页ZimmPlot：在单机试验中，进样系列浓度不能太低。DebyePlot

：在联机模式下，仅需要1个浓度（低浓度）。二者拟合数据数学公式：

ZimmFormalism:

其它拟合公式:Debye,Berry,RandomCoilZimmPlot与DebyePlot第26页

Zimm公式DebyePlot拟合度为1时：高分子

rmsradius<50nm纵坐标截距：1/Mw

；斜率与rmsradius

平方成正比。以

对

作图1/MwRrms2第27页Zimm公式Zimm–适合小到中等尺寸高分子

(RMSradii<50nm).6.528e+4g/mol1storderfitASTRA软件中显示某一保留时间下摩尔质量与均方根半径第28页数据分析-DistributionPlotsMolarMassLSRIEASIGraph可查看更多类型图第29页数据分析-EASITableEASIGraph可比较不一样试验结果第30页EASIGraph：摩尔质量分布曲线拟合数据能够处理信噪比较低区域散射数据

PolysaccharideLSRIMwBSALSRIMw第31页均方根半径分布曲线LSRI拟合数据能够处理信噪比较低时散射数据

RMSradiusfit1storderexponentialRMSradius第32页摩尔质量与均方分半径分布：

累计摩尔质量与均方根半径MolarMassHA4HA2HA3RMSRadiusHA4HA2HA3第33页摩尔质量与均方分半径分布：

微分摩尔质量与均方根半径MolarMassHA4HA2HA3RMSRadiusHA4HA2HA3第34页BSA：累积与微分摩尔质量分布曲线累积分布（cumulativedistribution）可判断样品聚集体情况，如寡聚体等样品展现台阶式分布；每一组分含量可由台阶高度决定。微分分布（differentialdistribution）可判断某一分子量范围组分质量百分含量。第35页判断多分散性样品对于rmsradius>10nm样品*，Mw

和rmsradius同时能够测定；

*而半径<10nm时，Mw

与特征粘度或QELS数据能够揭示分子构象信息。分子构象图（Conformation）无归线团

(斜率0.5–0.6)

棒状（Rod）: 长度与rmsradius

、M成正比；无归线团（Randomcoil）:

末端距与

rmsradius、M1/2成正比；球形（Sphere）: 球体半径与

rmsradius

、M1/3成正比；棒状(斜率

=1)球形

(斜率=1/3)logrglogM第36页构象图了解高分子支化信息以log(rmsradius)

对log(Mw)作图HA2Slope:0.48HA3Slope:0.49HA4Slope:0.18Highlybranchedmolecule第37页单机模式vs.联机模式SEC-MALS：Mn，Mw，Mz，PD，分子构象SEC-MALS试验:散射光强度，浓度，

dn/dc(Debyeplot,A2)建立SEC-MALS系统参数:normalization，alignment/bandbroadening摩尔质量与均方半径分布曲线：EasiGraphs构象图：logRgvs.logMw小结第38页附录Zimm,Debye,Berry,orRandomCoil公式适用范围公式y轴应用说明Zimm10to100nmmostlinearBerry100to200nminsteadofZimmplotDebyeWidesizerange,GenerallyhigherfitorderRandomCoilAssumesrandomcoilconformation第39页ZimmFormal