酶工程酶和细胞的固定化课件

酶工程酶和细胞的固定化酶工程酶和细胞的固定化1（优选）酶工程酶和细胞的固定化（优选）酶工程酶和细胞的固定化2果葡糖浆：葡萄糖异构酶/木糖异构酶异麦芽酮糖：蔗糖变位酶阿斯巴甜：嗜热菌蛋白酶果葡糖浆：葡萄糖异构酶/木糖异构酶异麦芽酮糖：蔗糖变位酶阿斯36-氨基青霉烷酸（6-APA）：青霉素酰化酶7-氨基头孢烷酸（7-ACA）：D-氨基酸氧化酶苯乙醇胺（又用作瘦肉精）：脂肪酶丙烯酰胺：腈水解酶氨基酸：氨基酰化酶/酰脲酶6-氨基青霉烷酸（6-APA）：7-氨基头孢烷酸（7-ACA4果葡糖浆葡萄糖异构酶青霉素酰化酶6-氨基青霉烷酸果葡糖浆葡萄糖异构酶青霉素酰化酶6-氨基青霉烷酸5Immobilization,

Why

？EnzymepropertiesImmobilizedEnzymeor

cell？CarrierpropertiesImmobilizedeffectImmobilizedMethods&ParametersGroup,charge&hydrophobicityImmobilization,Why？EnzymeImm6Contentsofchapter44.2固定化的载体和方法4.3固定化酶的性质GoGo4.1固定化的目的和定义Go4.4应用实例GoContentsofchapter44.2固定化的载74.1固定化的目的和定义4.1固定化的目的和定义8Why？成本高生产过程难以连续产物分离困难利用率低稳定性差反应过程难以控制游离酶/细胞:Why？成本高生产过程产物分离利用率低稳定性差反应过程难以控9Why？成本↓反复/连续生产过程产物分离容易利用率↑稳定性↑固定化酶/细胞:反应过程易控制Why？成本↓反复/连续产物分离利用率↑稳定性↑固定化酶/细10

固定化酶/细胞技术是指利用物理或化学特定的手段，将游离的酶或细胞定位，或限制于特定的空间区域，使其保持催化活性，并可反复使用的技术。定义固定化酶酶需要分离纯化；酶活力有损失；不适合多酶反应；催化效率高，节省空间固定化细胞无需酶的分离纯化酶活损失小，更稳定多酶体系，无需辅酶再生生产成本低定义固定化酶固定化细胞114.2固定化的载体和方法4.2固定化的载体和方法12Carriers化学性质要求亲水性/疏水性膨胀系数——低稳定性——高形态学性质要求粒径小，粒度分布窄内表面积——大孔径——足够大机械性质要求耐压性——高可压缩性——低弹性——足够其他要求来源——广泛成本——低食品级（用于食品工业）Carriers化学性质要求形态学性质要求机械性质要求其他要13载体孔径大于酶分子大小，以保证酶构象的自由变化，提高酶活，降低空间位阻。被吸附到空穴内壁的酶分子EupergitC孔径10-20nm酶活力较低依赖于孔径Eupergit250L孔径＞100nm酶活力高酶负载高载体孔径及分布载体孔径大于酶被吸附到空穴内壁的酶分子EupergitCE14扩散限制可以克服时，载体最小孔径是多少？rp＞20+de一般最小孔径2rp=40+2de酶直径de孔半径rp若酶分子直径5nm，最小载体孔径应为50nm扩散限制可以克服时，载体最小孔径是多少？rp＞20+de酶直15孔径、比表面积、酶负载量的关系该图中随孔径增大，酶所占据的内表面积越小，酶负载量越小。固定化酶的比活力起初随孔径增大而减小；载体孔径大于60nm时，酶活力增加，说明扩散限制越来越小。菊糖酶固定在可控孔的二氧化硅载体上孔径、比表面积、酶负载量的关系该图中随孔径增大，酶所占据的内16无机载体高压稳定性搅拌器中易受磨损vs多孔玻璃SiO2硅藻土SiO2斑脱土(膨润土)Al2Mg3Si4H2O121.5g青霉素酰化酶/1g斑脱土无机载体高压稳搅拌器中vs多孔玻璃硅藻土斑脱土(膨润土)117无机载体应用功能基团制造商多孔玻璃SiO2实验室-OHCorning(USA)Waters(USA)Schuller(D)多孔硅胶SiO2工业规模-OHGrace(USA)（商品名Deloxan®）Solvay(D)Degussa(D)明矾硅石-OH介孔分子筛MCM-41实验室无机载体应用功能基团制造商多孔玻璃SiO2实验室-OHCor18有机载体——天然高分子，如多糖类与蛋白质的相容性较好琼脂糖宽网状，亲水性，与酶作用弱，酶不易失活纤维素功能化：CM(羧甲基)-纤维素DEAE(二乙基氨基乙基)-纤维素工业：DEAE-纤维素用于葡萄糖异构酶固定化，1986葡聚糖机械稳定性低，来源受限水溶性，实验室实验室有机载体——天然高分子，如多糖类与蛋白质的琼脂糖纤维素功能化19有机载体——合成聚合物载体化学和机械稳定性高性能优良操作简单离子交换树脂聚甲基丙烯酸衍生物聚丙烯酸酯衍生物固定化脂肪酶催化非水系统反应有机载体——合成聚合物载体化学和机械性能优良离子交换树脂聚甲20新型载体磁性高分子微球高分子复配载体：两种及以上高分子体系，经氢键、疏水作用等次级键聚集，生物相容，传质性能好。海藻酸+聚丙烯，聚乙烯亚胺-卡拉胶，硅胶-海藻酸钙……聚合物纳米凝胶包埋辣根过氧化物酶，提高稳定性，保持酶在有机溶剂中的活力纳米载体介孔磁性载体固定化微生物用于污水处理，COD去除率可达82.7%新型载体磁性高分子微球高分子复配载体：海藻酸+聚丙烯，聚乙烯21微胶囊（半透膜）

凝胶

Methods包埋（可溶形式）

载体固定化交联

通过化学键与载体连接

吸附

离子键结合

配位结合

共价结合

微胶囊（半透膜）凝胶22(1)吸附法1916年Nellson&Griffin木炭固定蔗糖酶简易，可逆性载体重复使用避免化学修饰保持酶活(1)吸附法1916年Nellson&Griffin23酶吸附固定化的不同方法离子吸附生物特异性非特异性配位疏水作用酶吸附固定化的不同方法离子吸附生物特异性非特异性配位疏水作用24pH7.0~7.5氨基酰化酶酶液0.05mol/LNaOH，水洗涤DEAE-SephadexA251g/60mL酶液冷库搅拌吸附过夜吸去上清液4℃备用水，醋酸钠溶液洗涤固定化酶活力回收：50%~60%；600~800mol/(hg)湿固定化酶最早应用于工业化的固定化酶pH7.0~7.50.05mol/LNaOH，水洗涤125(2)共价法A-活性氨基酸残基；B-载体上的官能团C-载体；D-间隔臂酶与载体连接牢固，稳定性高，但酶易失活(2)共价法A-活性氨基酸残基；B-载体上的官能团酶与载体26不同氨基酸残基的活性官能团载体的结合官能团酶的结合官能团天然高分子载体人工合成高聚物载体不同氨基酸残基的活性官能团载体的结合官能团酶的结合官能团天然27载体与酶的共价结合模式1重氮化2叠氮化3烷基化和芳基化4溴化氰5Schiff碱6Ugi反应7酰胺化8巯基-二硫键变换反应9Mercury-酶相互作用10氧化11肽键载体的结合官能团酶的结合官能团载体需事先活化载体与酶的共价结合模式1重氮化2叠氮化载体的结合28重氮化反应举例：含-NH2载体与异硫氰酸反应酶中游离氨基、组氨酸咪唑基、酪氨酸的酚基参与反应用于固定酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶重氮化反应举例：含-NH2载体与异硫氰酸反应酶中游离氨基、组29举例：含-COOH载体,如CMC酶中游离氨基参与反应与琥珀酰亚胺反应与氯化亚砜反应举例：含-COOH载体,如CMC酶中游离氨基与琥珀酰亚胺反30举例：含-COOH载体,如CMC与酶中游离氨基、巯基、羟基、酚羟基反应叠氮化反应酯化酰肼衍生物叠氮衍生物举例：含-COOH载体,如CMC与酶中游离氨基、巯基、羟基31举例：含-OH载体,如多糖与酶中游离氨基、羟基反应与溴化氰反应活泼的亚胺碳酸酯条件温和举例：含-OH载体,如多糖与酶中游离氨基、羟基反应与溴化氰32举例：含-OH载体,如多糖与酶中游离氨基、羟基、巯基反应与三氯均三嗪反应磺酰化反应环氧化反应，如Eupergit举例：含-OH载体,如多糖与酶中游离氨基、羟基、巯基反应与33举例：含硅无机载体方法一：载体表面包覆有机层（如琼脂糖、葡聚糖、白蛋白），或用表面聚合法“镀上”一层聚合物，再对包覆后的表面活化方法二：利用有机硅试剂直接活化硅羟基举例：含硅无机载体方法一：载体表面包覆有机层（如琼脂糖、葡聚34蒸馏水1mL,1mol/LHCl1mL，5%NaNO21mLABSE-交联琼脂3g冰水浴，15min，洗去NO2-4℃备用1mol/LNa2CO3调节pH7.0，冰水浴2hABSE-交联琼脂固定化碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶约300u，BSA20mg，NaCl，MgSO4，ZnSO4溶液重氮盐ABSE：对氨基苯磺酰乙基蒸馏水1mL,1mol/LHCl1mL，5%N35(3)包埋法不涉及化学修饰，条件温和，酶活力回收率高凝胶包埋法：酶分子包在高聚物格子中(3)包埋法不涉及化学修饰，条件凝胶包埋法：36i.天然凝胶包埋法海藻酸钠+细胞+酶CaCl2溶液其他天然凝胶：明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等i.天然凝胶包埋法海藻酸钠CaCl2溶液其他天然凝胶：37喷射切割器喷射切割器38注射方法得藻酸盐球珠喷射切割器得藻酸盐球珠注射方法得藻酸盐球珠喷射切割器得藻酸盐球珠39ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶的合成与酶的包埋——

网格型丙烯酰胺BISBIS：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶的合成与酶的包埋40美国Altus公司已上市10个产品，年利润百万美元。影响因素：交联剂、介质、温度，pH，离子强度，缓冲液种类，添加剂等酵母乳糖酶（100mg）溶于56mL磷酸缓冲液（pH7.Corning，Valio，Suminoto，SnamProgettiExamples：甜味剂工业酶分子包在高聚物格子中界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而形成的薄膜将酶包埋。异麦芽酮糖：蔗糖变位酶用于固定酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶n-丁醇4200m3D-间隔臂如：疏水的酰亚胺酯修饰酵母醇脱氢酶，可定量吸附在XAD-7多聚体小珠上。1.酶2.单体+交联剂3.起始剂4.搅拌分散1.酵母乳糖酶（100mg）溶于56mL磷酸缓冲液（pH7.3）2.丙烯酰胺单体15~30%BIS交联剂5%3.起始剂：0.6mLTEMED，200mg过硫酸铵缓冲液4.1mL失水山梨醇半油酸酯，400mL甲苯-氯仿固定化酶颗粒100~200μm珠状聚丙烯酰胺包埋β-半乳糖苷酶ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法氮气，4℃，30minBIS：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺；TEMED：四甲基乙二胺搅拌分散美国Altus公司已上市10个产品，年利润百万美元。1.酶411.酶2.单体+交联剂3.起始剂1.1kg湿重E.coli悬浮于2L0.9%NaCl，8℃2.丙烯酰胺单体750g，BIS交联剂2.4L，8℃聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌（天冬氨酸酶）3.100mLβ-二甲基氨基丙腈，500mL，1%过硫酸钾（起始剂）20~25℃到30℃时冰水迅速冷却凝胶切成3~4mm3的立方体ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法15~20min1.酶1.1kg湿重E.2.丙烯酰胺单体750g，42来自小牛肠黏膜的纯碱性磷酸酶（ALP）被四甲氧基硅烷（TMOS）溶胶-凝胶固定化后活力回收30%，与溶液酶相比，稳定性提高。iii.溶胶-凝胶包埋法将无机硅源前驱体与酶混合，水解、缩合反应，得透明溶胶，经陈化、聚合形成多孔凝胶，即得固定化酶来自小牛肠黏膜的纯碱性磷酸酶（ALP）被四甲氧基iii.溶43B.微囊化：以物理方式将酶包封于半透膜内微囊内径几微米-几百微米，酶关在不同构型半透膜外壳内，小分子自由进出，避免酶失活。酶被胶囊膜限制在内部，底物或产物可以自由扩散。微胶囊材料：聚酰胺膜、火棉胶膜等B.微囊化：以物理方式将酶包封于半透膜内酶被胶囊膜限制在内44界面沉淀法制备微胶囊乳化油包水的微滴加入高聚物高聚物在油水界面上沉淀、析出，将酶包埋界面沉淀法制备微胶囊乳化油包水加入高聚物高聚物在油水界45微胶囊制备方法界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而形成的薄膜将酶包埋。界面聚合法：亲水性单体+疏水性单体在界面发生聚合将酶包埋。二级乳化法：酶先在聚合物相中分散乳化，再分散于水中形成次级乳化液，而后将聚合物溶液固化。脂质体包埋法：类似于“细胞质膜”式的结构。聚电解质络合法：如海藻酸钠与聚赖氨酸通过静电作用结合。微胶囊制备方法46(4)交联法利用双功能试剂进行酶之间的交联，使酶分子和双功能试剂间形成共价键，得到三维交联网架结构。常用的交联试剂戊二醛（glutaraldehyde）己二胺（hexamethylenediamine顺丁烯二酸酐（maleicanhydride）(4)交联法利用双功能试剂进行酶之间的交联，使酶分子和双功47A.酶分子之间的交联B.酶与水不溶性载体交联A.酶分子之间的交联B.酶与水不溶性载体交联48A.酶分子间的戊二醛交联：氨基的交联反应交联时的pH值一般与酶的等电点pI相同A.酶分子间的戊二醛交联：49交联酶晶体CLEC：将纯酶晶体进行交联，底物和产物扩散通过2-5nm微孔通道进行。高纯度、高活性、高生产效率如：核糖核酸酶A、枯草芽孢杆菌蛋白酶、羧肽酶B以及醇脱氢酶的交联酶晶体。美国Altus公司已上市10个产品，年利润百万美元。交联酶聚集体CLEA：通过合适的沉淀剂，如：硫酸铵、叔丁醇和PEG将酶沉淀，同时保留活性可达100%，然后用戊二醛交联。交联酶晶体CLEC：将纯酶晶体进行交联，底物交联酶聚集体CL502.5%戊二醛溶液2mL胰凝乳蛋白酶500mg溶于5mL0.2mol/LpH6醋酸缓冲液搅拌1~3h凝胶在匀浆器内粉碎检测A280水洗去游离戊二醛和酶戊二醛交联胰凝乳蛋白酶戊二醛终浓度0.3~0.6%得最好的活力回收2.5%戊二醛溶液胰凝乳蛋白酶500mg溶于5mL0.251B.酶与载体交联：采用交联剂将酶分子偶联到水不溶性载体上，形成水不溶性的固定化酶。B.酶与载体交联：52交联酶的特性：a.交联得到的固定化酶/固定化菌体结合牢固，酶很难脱落，可长期使用。b.交联反应条件剧烈，而且交联需酶分子中的多个基团同时参与，致使酶活力损失较大c.制成的固定化酶/菌体颗粒较小双重固定化法包埋+交联吸附+交联交联酶的特性：53传统固定化方法的比较特征载体结合法交联法包埋法离子吸附法物理吸附法共价结合法制备易易难中较难结合力中弱强强强酶活性高高中或低低高载体再生性较容易容易难不能再生不能再生底物专一性不变不变可变可变不变稳定性中低高高高固定化成本低低高中中或高抗微生物能力无无无可能较强传统固定化方法的比较特征载体结合法交联法包埋法离子吸附法物理54(5)非传统固定化方法修饰-吸附法如：单甲氧基PEG(1900)以NPCF（氯甲酸对硝基苯酯）活化，使玫瑰假丝酵母脂酶PEG化，增加酶活。To：酶难以吸附在载体，或吸附量低(5)非传统固定化方法修饰-吸附法如：单甲氧基PEG(1955吸附-包埋法如：两步法来自放线菌的青霉素V酰基转移酶固定：a.酶吸附于硅藻土，b.包埋于聚丙烯酰胺凝胶如：来自黑曲霉的葡糖淀粉酶固定化（可稳定21天）：a.吸附于糊化的玉米淀粉上，b.包埋于藻酸盐纤维中。To：酶容易从载体表面脱离吸附-包埋法如：两步法来自放线菌的青霉素V酰基转移酶固定：T56吸附-交联法如：青霉素G酰基转移酶吸附固定在壳聚糖、琼脂糖、苯氧乙酰纤维素、聚丙烯酰胺泡沫塑料、多孔玻璃等不同载体上，再用戊二醛交联。在60℃下稳定性比自由酶提高10倍以上。To：酶容易流失，稳定性差吸附-交联法如：青霉素G酰基转移酶吸附固定在壳聚糖、琼脂糖、574mL碱性蛋白酶液离子交换树脂DowerMWA-11g,用多种缓冲液洗涤pH6.51%戊二醛溶液活力回收率27%过滤，磷酸钾缓冲液洗涤吸附交联法固定碱性蛋白酶0℃，1h4mL碱性蛋白酶液离子交换树脂DowerMWA-1pH58修饰-包埋法酶先共价结合明胶、水溶性右旋糖酐、淀粉等，所得共轭物再被包埋进凝胶基质中。如：天然牛血清胺氧化酶PEG化，再与水凝胶作用

To：包埋酶流失修饰-包埋法酶先共价结合明胶、水溶性右旋糖酐、淀粉等，所得共59修饰后固定化额外电荷的引入氨基酸残基的互换疏水性的改变不饱和键的引入提高有机溶剂中溶解度环节支持物表面的毒性如：疏水的酰亚胺酯修饰酵母醇脱氢酶，可定量吸附在XAD-7多聚体小珠上。修饰后固定化额外电荷的引入如：疏水的酰亚胺酯修饰酵母醇脱氢60固定化酶化学后处理如：固定在CNBr活化琼脂糖上的黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的热稳定性，在经该酶的糖链氨烷化后，借助戊二醛的交联，得到明显改进。固定化酶化学后处理如：固定在CNBr活化琼脂糖上的黑曲霉的β614.3固定化酶的性质4.3固定化酶的性质62Properties固定化酶活力固定化酶稳定性固定化酶底物特异性最适温度最适pH值Properties固定化酶固定化酶固定化酶最适温度最适pH63固定化酶的活力固定化酶活力一般低于天然酶固定化载体与酶的相互作用引起酶活性中心或调解中心的构象发生了改变，甚至影响了活性中心的氨基酸，从而导致酶活力下降；固定化载体增加了酶分子的活性中心与反应底物之间的阻力（载体空隙太小或固定化方式与位置不当），使得底物无法和酶接触，影响对底物的定位作用，从而降低酶活力；固定化酶的活力固定化酶活力固定化载体与酶的相互作用引起酶活性64固定化酶的稳定性固定化后酶分子与载体多点连接，防止酶分子伸展变形；酶分子失去了

分子间相互作用的机会，

抑制了降解，提高了酶的稳定性，保存时间延长。固定化酶稳定性（热稳定性、储存稳定性、操作稳定性）一般高于天然酶c.影响因素：交联剂、介质、温度，pH，离子强度，缓冲液种类，添加剂等b.对蛋白酶抵抗性增强，对变性剂（如尿素、有机溶剂、盐酸胍等）耐受性提高，保留较高酶活力；对酶抑制剂、对不同pH值的稳定性提高固定化酶的稳定性固定化后酶分子与载体固定化酶稳定性（热稳定性65酶工程酶和细胞的固定化课件66固定化酶的底物特异性固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有关。

作用于低分子量底物的酶，特异性无明显变化（如氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶等）。c.既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，特异性往往会发生变化。例：固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酶蛋白的降解活力仅为游离酶的3%左右原因：载体的空间位阻作用，大分子底物难于接近酶分子固定化酶的底物特异性固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小67固定化酶的最适温度与游离酶相比，固定化酶的最适温度一般变化不大，部分酶固定化后最适温度发生明显变化。例1：利用重氮化法制备固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，最适温度比游离酶高出5～10摄氏度。例2：色氨酸酶与载体共价结合之后，最适温度比游离酶高5～15摄氏度。固定化酶的最适温度与游离酶相比，固定化酶的最适温度一般变化68b.不同方法固定化同一种酶，最适温度可能不同。例：氨基酰化酶（游离酶最适60摄氏度）i用DEAE-葡聚糖凝胶为离子结合载体得到的固定化酶最适温度为72摄氏度；ii用DEAE-纤维素结合后，最适温度为67摄氏度；Iii用烷基化共价结合后，最适温度比游离酶有所下降。酶工程酶和细胞的固定化课件69固定化酶的最适pH值酶固定化后最适pH值一般会发生变化，主要取决于固定化酶所处的微环境的性质b.载体性质的影响带负电载体：最适pH带正电载体：最适pHc.产物性质的影响酸性产物：最适pH碱性产物：最适pH固定化酶的最适pH值酶固定化后最适pH值一般会发生变化704.4应用实例4.4应用实例71Examples：甜味剂工业-D-吡喃葡萄糖葡萄糖异构酶-D-呋喃果糖固定化葡萄糖异构酶：年产量12-20t（干重），半衰期80~150天，反应温度58~60℃固定化方法：细胞交联法（Novo公司）结晶与离子交换吸附法（Genencor公司）Examples：甜味剂工业-D-吡喃葡萄糖葡萄糖异构酶72固定化β-半乳糖苷酶：半衰期20个月，生产能力2000kg产物/kg催化剂乳糖β-半乳糖苷酶半乳糖固定化方法：基于Eupergit®载体使用固定化酶的公司：Corning，Valio，Suminoto，SnamProgetti葡萄糖+固定化β-半乳糖苷酶：乳糖β-半乳糖苷酶半乳糖固定化方法：73固定化-半乳糖苷酶：处理300t含1~5%棉子糖的糖蜜/d，1990棉子糖-半乳糖苷酶半乳糖固定化方法：酶与微生物Mortierellavinacea菌丝体交联使用固定化酶的公司：HokkaidoSugar蔗糖+固定化-半乳糖苷酶：棉子糖-半乳糖苷酶半乳糖固定化方法：74蔗糖蔗糖异构酶1-O--D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖异麦芽酮糖+明串珠菌二糖+固定化蔗糖异构酶：半衰期8000h以上，生产60000t异麦芽酮糖/a，1987固定化方法：海藻酸钠交联包埋法使用固定化酶的公司：SudzuckerAG，Cerestar，MitsuiSeitoCo.低聚糖蔗糖蔗糖异构酶1-O--D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖异麦75Examples：抗生素工业固定化酶1t氨气45t水10000m3约30℃二甲基氯硅烷300tN,N-二甲基苯胺800t五代氯磷酸600t氨气160t二氯甲烷4200m3n-丁醇4200m3-40℃青霉素G，1000t6-APA，500t固定化青霉素酰化酶水解青霉素6-APA:6-氨基青霉素烷酸Examples：抗生素工业固定化酶1t二甲基氯硅烷3076生产商AsahiChem.Ind.DSMRecordati酶来源巨型芽孢杆菌类产碱杆菌大肠杆菌固定化方法共价法，多孔聚丙烯腈共价法，凝胶载体共价法，Eupergit®载体固定化收率未知未知60-70%酶活力未知约200U/mL100-150U/mL,湿载体温度30-36℃未知37操作稳定性约1000h未知高达1000循环，＞60d青霉素G水解的反应条件生产商AsahiChem.Ind.DSMRecordati77Examples：氨基酸生产N-酰基-DL-氨基酸酰基转移酶L-氨基酸N-酰基-D-氨基酸+水+酰基转移酶通过吸附剂固定在离子交换树脂上Examples：氨基酸生产N-酰基-酰基转移酶L-氨基酸N78身体健康，学习进步！身体健康，酶工程酶和细胞的固定化酶工程酶和细胞的固定化80（优选）酶工程酶和细胞的固定化（优选）酶工程酶和细胞的固定化81果葡糖浆：葡萄糖异构酶/木糖异构酶异麦芽酮糖：蔗糖变位酶阿斯巴甜：嗜热菌蛋白酶果葡糖浆：葡萄糖异构酶/木糖异构酶异麦芽酮糖：蔗糖变位酶阿斯826-氨基青霉烷酸（6-APA）：青霉素酰化酶7-氨基头孢烷酸（7-ACA）：D-氨基酸氧化酶苯乙醇胺（又用作瘦肉精）：脂肪酶丙烯酰胺：腈水解酶氨基酸：氨基酰化酶/酰脲酶6-氨基青霉烷酸（6-APA）：7-氨基头孢烷酸（7-ACA83果葡糖浆葡萄糖异构酶青霉素酰化酶6-氨基青霉烷酸果葡糖浆葡萄糖异构酶青霉素酰化酶6-氨基青霉烷酸84Immobilization,

Why

？EnzymepropertiesImmobilizedEnzymeor

cell？CarrierpropertiesImmobilizedeffectImmobilizedMethods&ParametersGroup,charge&hydrophobicityImmobilization,Why？EnzymeImm85Contentsofchapter44.2固定化的载体和方法4.3固定化酶的性质GoGo4.1固定化的目的和定义Go4.4应用实例GoContentsofchapter44.2固定化的载864.1固定化的目的和定义4.1固定化的目的和定义87Why？成本高生产过程难以连续产物分离困难利用率低稳定性差反应过程难以控制游离酶/细胞:Why？成本高生产过程产物分离利用率低稳定性差反应过程难以控88Why？成本↓反复/连续生产过程产物分离容易利用率↑稳定性↑固定化酶/细胞:反应过程易控制Why？成本↓反复/连续产物分离利用率↑稳定性↑固定化酶/细89

固定化酶/细胞技术是指利用物理或化学特定的手段，将游离的酶或细胞定位，或限制于特定的空间区域，使其保持催化活性，并可反复使用的技术。定义固定化酶酶需要分离纯化；酶活力有损失；不适合多酶反应；催化效率高，节省空间固定化细胞无需酶的分离纯化酶活损失小，更稳定多酶体系，无需辅酶再生生产成本低定义固定化酶固定化细胞904.2固定化的载体和方法4.2固定化的载体和方法91Carriers化学性质要求亲水性/疏水性膨胀系数——低稳定性——高形态学性质要求粒径小，粒度分布窄内表面积——大孔径——足够大机械性质要求耐压性——高可压缩性——低弹性——足够其他要求来源——广泛成本——低食品级（用于食品工业）Carriers化学性质要求形态学性质要求机械性质要求其他要92载体孔径大于酶分子大小，以保证酶构象的自由变化，提高酶活，降低空间位阻。被吸附到空穴内壁的酶分子EupergitC孔径10-20nm酶活力较低依赖于孔径Eupergit250L孔径＞100nm酶活力高酶负载高载体孔径及分布载体孔径大于酶被吸附到空穴内壁的酶分子EupergitCE93扩散限制可以克服时，载体最小孔径是多少？rp＞20+de一般最小孔径2rp=40+2de酶直径de孔半径rp若酶分子直径5nm，最小载体孔径应为50nm扩散限制可以克服时，载体最小孔径是多少？rp＞20+de酶直94孔径、比表面积、酶负载量的关系该图中随孔径增大，酶所占据的内表面积越小，酶负载量越小。固定化酶的比活力起初随孔径增大而减小；载体孔径大于60nm时，酶活力增加，说明扩散限制越来越小。菊糖酶固定在可控孔的二氧化硅载体上孔径、比表面积、酶负载量的关系该图中随孔径增大，酶所占据的内95无机载体高压稳定性搅拌器中易受磨损vs多孔玻璃SiO2硅藻土SiO2斑脱土(膨润土)Al2Mg3Si4H2O121.5g青霉素酰化酶/1g斑脱土无机载体高压稳搅拌器中vs多孔玻璃硅藻土斑脱土(膨润土)196无机载体应用功能基团制造商多孔玻璃SiO2实验室-OHCorning(USA)Waters(USA)Schuller(D)多孔硅胶SiO2工业规模-OHGrace(USA)（商品名Deloxan®）Solvay(D)Degussa(D)明矾硅石-OH介孔分子筛MCM-41实验室无机载体应用功能基团制造商多孔玻璃SiO2实验室-OHCor97有机载体——天然高分子，如多糖类与蛋白质的相容性较好琼脂糖宽网状，亲水性，与酶作用弱，酶不易失活纤维素功能化：CM(羧甲基)-纤维素DEAE(二乙基氨基乙基)-纤维素工业：DEAE-纤维素用于葡萄糖异构酶固定化，1986葡聚糖机械稳定性低，来源受限水溶性，实验室实验室有机载体——天然高分子，如多糖类与蛋白质的琼脂糖纤维素功能化98有机载体——合成聚合物载体化学和机械稳定性高性能优良操作简单离子交换树脂聚甲基丙烯酸衍生物聚丙烯酸酯衍生物固定化脂肪酶催化非水系统反应有机载体——合成聚合物载体化学和机械性能优良离子交换树脂聚甲99新型载体磁性高分子微球高分子复配载体：两种及以上高分子体系，经氢键、疏水作用等次级键聚集，生物相容，传质性能好。海藻酸+聚丙烯，聚乙烯亚胺-卡拉胶，硅胶-海藻酸钙……聚合物纳米凝胶包埋辣根过氧化物酶，提高稳定性，保持酶在有机溶剂中的活力纳米载体介孔磁性载体固定化微生物用于污水处理，COD去除率可达82.7%新型载体磁性高分子微球高分子复配载体：海藻酸+聚丙烯，聚乙烯100微胶囊（半透膜）

凝胶

Methods包埋（可溶形式）

载体固定化交联

通过化学键与载体连接

吸附

离子键结合

配位结合

共价结合

微胶囊（半透膜）凝胶101(1)吸附法1916年Nellson&Griffin木炭固定蔗糖酶简易，可逆性载体重复使用避免化学修饰保持酶活(1)吸附法1916年Nellson&Griffin102酶吸附固定化的不同方法离子吸附生物特异性非特异性配位疏水作用酶吸附固定化的不同方法离子吸附生物特异性非特异性配位疏水作用103pH7.0~7.5氨基酰化酶酶液0.05mol/LNaOH，水洗涤DEAE-SephadexA251g/60mL酶液冷库搅拌吸附过夜吸去上清液4℃备用水，醋酸钠溶液洗涤固定化酶活力回收：50%~60%；600~800mol/(hg)湿固定化酶最早应用于工业化的固定化酶pH7.0~7.50.05mol/LNaOH，水洗涤1104(2)共价法A-活性氨基酸残基；B-载体上的官能团C-载体；D-间隔臂酶与载体连接牢固，稳定性高，但酶易失活(2)共价法A-活性氨基酸残基；B-载体上的官能团酶与载体105不同氨基酸残基的活性官能团载体的结合官能团酶的结合官能团天然高分子载体人工合成高聚物载体不同氨基酸残基的活性官能团载体的结合官能团酶的结合官能团天然106载体与酶的共价结合模式1重氮化2叠氮化3烷基化和芳基化4溴化氰5Schiff碱6Ugi反应7酰胺化8巯基-二硫键变换反应9Mercury-酶相互作用10氧化11肽键载体的结合官能团酶的结合官能团载体需事先活化载体与酶的共价结合模式1重氮化2叠氮化载体的结合107重氮化反应举例：含-NH2载体与异硫氰酸反应酶中游离氨基、组氨酸咪唑基、酪氨酸的酚基参与反应用于固定酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶重氮化反应举例：含-NH2载体与异硫氰酸反应酶中游离氨基、组108举例：含-COOH载体,如CMC酶中游离氨基参与反应与琥珀酰亚胺反应与氯化亚砜反应举例：含-COOH载体,如CMC酶中游离氨基与琥珀酰亚胺反109举例：含-COOH载体,如CMC与酶中游离氨基、巯基、羟基、酚羟基反应叠氮化反应酯化酰肼衍生物叠氮衍生物举例：含-COOH载体,如CMC与酶中游离氨基、巯基、羟基110举例：含-OH载体,如多糖与酶中游离氨基、羟基反应与溴化氰反应活泼的亚胺碳酸酯条件温和举例：含-OH载体,如多糖与酶中游离氨基、羟基反应与溴化氰111举例：含-OH载体,如多糖与酶中游离氨基、羟基、巯基反应与三氯均三嗪反应磺酰化反应环氧化反应，如Eupergit举例：含-OH载体,如多糖与酶中游离氨基、羟基、巯基反应与112举例：含硅无机载体方法一：载体表面包覆有机层（如琼脂糖、葡聚糖、白蛋白），或用表面聚合法“镀上”一层聚合物，再对包覆后的表面活化方法二：利用有机硅试剂直接活化硅羟基举例：含硅无机载体方法一：载体表面包覆有机层（如琼脂糖、葡聚113蒸馏水1mL,1mol/LHCl1mL，5%NaNO21mLABSE-交联琼脂3g冰水浴，15min，洗去NO2-4℃备用1mol/LNa2CO3调节pH7.0，冰水浴2hABSE-交联琼脂固定化碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶约300u，BSA20mg，NaCl，MgSO4，ZnSO4溶液重氮盐ABSE：对氨基苯磺酰乙基蒸馏水1mL,1mol/LHCl1mL，5%N114(3)包埋法不涉及化学修饰，条件温和，酶活力回收率高凝胶包埋法：酶分子包在高聚物格子中(3)包埋法不涉及化学修饰，条件凝胶包埋法：115i.天然凝胶包埋法海藻酸钠+细胞+酶CaCl2溶液其他天然凝胶：明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等i.天然凝胶包埋法海藻酸钠CaCl2溶液其他天然凝胶：116喷射切割器喷射切割器117注射方法得藻酸盐球珠喷射切割器得藻酸盐球珠注射方法得藻酸盐球珠喷射切割器得藻酸盐球珠118ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶的合成与酶的包埋——

网格型丙烯酰胺BISBIS：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶的合成与酶的包埋119美国Altus公司已上市10个产品，年利润百万美元。影响因素：交联剂、介质、温度，pH，离子强度，缓冲液种类，添加剂等酵母乳糖酶（100mg）溶于56mL磷酸缓冲液（pH7.Corning，Valio，Suminoto，SnamProgettiExamples：甜味剂工业酶分子包在高聚物格子中界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而形成的薄膜将酶包埋。异麦芽酮糖：蔗糖变位酶用于固定酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶n-丁醇4200m3D-间隔臂如：疏水的酰亚胺酯修饰酵母醇脱氢酶，可定量吸附在XAD-7多聚体小珠上。1.酶2.单体+交联剂3.起始剂4.搅拌分散1.酵母乳糖酶（100mg）溶于56mL磷酸缓冲液（pH7.3）2.丙烯酰胺单体15~30%BIS交联剂5%3.起始剂：0.6mLTEMED，200mg过硫酸铵缓冲液4.1mL失水山梨醇半油酸酯，400mL甲苯-氯仿固定化酶颗粒100~200μm珠状聚丙烯酰胺包埋β-半乳糖苷酶ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法氮气，4℃，30minBIS：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺；TEMED：四甲基乙二胺搅拌分散美国Altus公司已上市10个产品，年利润百万美元。1.酶1201.酶2.单体+交联剂3.起始剂1.1kg湿重E.coli悬浮于2L0.9%NaCl，8℃2.丙烯酰胺单体750g，BIS交联剂2.4L，8℃聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌（天冬氨酸酶）3.100mLβ-二甲基氨基丙腈，500mL，1%过硫酸钾（起始剂）20~25℃到30℃时冰水迅速冷却凝胶切成3~4mm3的立方体ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法15~20min1.酶1.1kg湿重E.2.丙烯酰胺单体750g，121来自小牛肠黏膜的纯碱性磷酸酶（ALP）被四甲氧基硅烷（TMOS）溶胶-凝胶固定化后活力回收30%，与溶液酶相比，稳定性提高。iii.溶胶-凝胶包埋法将无机硅源前驱体与酶混合，水解、缩合反应，得透明溶胶，经陈化、聚合形成多孔凝胶，即得固定化酶来自小牛肠黏膜的纯碱性磷酸酶（ALP）被四甲氧基iii.溶122B.微囊化：以物理方式将酶包封于半透膜内微囊内径几微米-几百微米，酶关在不同构型半透膜外壳内，小分子自由进出，避免酶失活。酶被胶囊膜限制在内部，底物或产物可以自由扩散。微胶囊材料：聚酰胺膜、火棉胶膜等B.微囊化：以物理方式将酶包封于半透膜内酶被胶囊膜限制在内123界面沉淀法制备微胶囊乳化油包水的微滴加入高聚物高聚物在油水界面上沉淀、析出，将酶包埋界面沉淀法制备微胶囊乳化油包水加入高聚物高聚物在油水界124微胶囊制备方法界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而形成的薄膜将酶包埋。界面聚合法：亲水性单体+疏水性单体在界面发生聚合将酶包埋。二级乳化法：酶先在聚合物相中分散乳化，再分散于水中形成次级乳化液，而后将聚合物溶液固化。脂质体包埋法：类似于“细胞质膜”式的结构。聚电解质络合法：如海藻酸钠与聚赖氨酸通过静电作用结合。微胶囊制备方法125(4)交联法利用双功能试剂进行酶之间的交联，使酶分子和双功能试剂间形成共价键，得到三维交联网架结构。常用的交联试剂戊二醛（glutaraldehyde）己二胺（hexamethylenediamine顺丁烯二酸酐（maleicanhydride）(4)交联法利用双功能试剂进行酶之间的交联，使酶分子和双功126A.酶分子之间的交联B.酶与水不溶性载体交联A.酶分子之间的交联B.酶与水不溶性载体交联127A.酶分子间的戊二醛交联：氨基的交联反应交联时的pH值一般与酶的等电点pI相同A.酶分子间的戊二醛交联：128交联酶晶体CLEC：将纯酶晶体进行交联，底物和产物扩散通过2-5nm微孔通道进行。高纯度、高活性、高生产效率如：核糖核酸酶A、枯草芽孢杆菌蛋白酶、羧肽酶B以及醇脱氢酶的交联酶晶体。美国Altus公司已上市10个产品，年利润百万美元。交联酶聚集体CLEA：通过合适的沉淀剂，如：硫酸铵、叔丁醇和PEG将酶沉淀，同时保留活性可达100%，然后用戊二醛交联。交联酶晶体CLEC：将纯酶晶体进行交联，底物交联酶聚集体CL1292.5%戊二醛溶液2mL胰凝乳蛋白酶500mg溶于5mL0.2mol/LpH6醋酸缓冲液搅拌1~3h凝胶在匀浆器内粉碎检测A280水洗去游离戊二醛和酶戊二醛交联胰凝乳蛋白酶戊二醛终浓度0.3~0.6%得最好的活力回收2.5%戊二醛溶液胰凝乳蛋白酶500mg溶于5mL0.2130B.酶与载体交联：采用交联剂将酶分子偶联到水不溶性载体上，形成水不溶性的固定化酶。B.酶与载体交联：131交联酶的特性：a.交联得到的固定化酶/固定化菌体结合牢固，酶很难脱落，可长期使用。b.交联反应条件剧烈，而且交联需酶分子中的多个基团同时参与，致使酶活力损失较大c.制成的固定化酶/菌体颗粒较小双重固定化法包埋+交联吸附+交联交联酶的特性：132传统固定化方法的比较特征载体结合法交联法包埋法离子吸附法物理吸附法共价结合法制备易易难中较难结合力中弱强强强酶活性高高中或低低高载体再生性较容易容易难不能再生不能再生底物专一性不变不变可变可变不变稳定性中低高高高固定化成本低低高中中或高抗微生物能力无无无可能较强传统固定化方法的比较特征载体结合法交联法包埋法离子吸附法物理133(5)非传统固定化方法修饰-吸附法如：单甲氧基PEG(1900)以NPCF（氯甲酸对硝基苯酯）活化，使玫瑰假丝酵母脂酶PEG化，增加酶活。To：酶难以吸附在载体，或吸附量低(5)非传统固定化方法修饰-吸附法如：单甲氧基PEG(19134吸附-包埋法如：两步法来自放线菌的青霉素V酰基转移酶固定：a.酶吸附于硅藻土，b.包埋于聚丙烯酰胺凝胶如：来自黑曲霉的葡糖淀粉酶固定化（可稳定21天）：a.吸附于糊化的玉米淀粉上，b.包埋于藻酸盐纤维中。To：酶容易从载体表面脱离吸附-包埋法如：两步法来自放线菌的青霉素V酰基转移酶固定：T135吸附-交联法如：青霉素G酰基转移酶吸附固定在壳聚糖、琼脂糖、苯氧乙酰纤维素、聚丙烯酰胺泡沫塑料、多孔玻璃等不同载体上，再用戊二醛交联。在60℃下稳定性比自由酶提高10倍以上。To：酶容易流失，稳定性差吸附-交联法如：青霉素G酰基转移酶吸附固定在壳聚糖、琼脂糖、1364mL碱性蛋白酶液离子交换树脂DowerMWA-11g,用多种缓冲液洗涤pH6.51%戊二醛溶液活力回收率27%过滤，磷酸钾缓冲液洗涤吸附交联法固定碱性蛋白酶0℃，1h4mL碱性蛋白酶液离子交换树脂DowerMWA-1pH137修饰-包埋法酶先共价结合明胶、水溶性右旋糖酐、淀粉等，所得共轭物再被包埋进凝胶基质中。如：天然牛血清胺氧化酶PEG化，再与水凝胶作用

To：包埋酶流失修饰-包埋法酶先共价结合明胶、水溶性右旋糖酐、淀粉等，所得共138修饰后固定化额外电荷的引入氨基酸残基的互换疏水性的改变不饱和键的引入提高有机溶剂中溶解度环节支持物表面的毒性如：疏水的酰亚胺酯修饰酵母醇脱氢酶，可定量吸附在XAD-7多聚体小珠上。修饰后固定化额外电荷的引入如：疏水的酰亚胺酯修饰酵母醇脱氢139固定化酶化学后处理如：固定在CNBr活化琼脂糖上的黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的热稳定性，在经该酶的糖链氨烷化后，借助戊二醛的交联，得到明显改进。固定化酶化学后处理如：固定在CNBr活化琼脂糖上的黑曲霉的β1404.3固定化酶的性质4.3固定化酶的性质141Properties固定化酶活力固定化酶稳定性固定化酶底物特异性最适温度最适pH值Properties固定化酶固定化酶固定化酶最适温度最适pH142固定化酶的活力固定化酶活力一般低于天然酶固定化载体与酶的相互作用引起酶活性中心或调解中心的构象发生了改变，甚至影响了活性中心的氨基酸，从而导致酶活力下降；固定化载体增加了酶分子的活性中心与反应底物之间的阻力（载体空隙太小或固定化方式与位置不当），使得底物无法和酶接触，影响对底物的定位作用，从而降低酶活力；固定化酶的活力固定化酶活力固定化载体与酶的相互作用引起酶活性143固定化酶的稳定性固定化后酶分子与载体多点连接，防止酶分子伸展变形；酶分子失去了

分子间相互作用的机会，

抑制了降解，提高了酶的稳定性，保存时间延长。固定化酶稳定性（热稳定性、储存稳定性、操作稳定性）一般高于天然酶c.影响因素：交联剂、介质、温度，pH，离子强度，缓冲液种类，添加剂等b.对蛋白酶抵抗性增强，对变性剂（如尿素、有机溶剂、盐酸胍等）耐受性提高，保留较高酶活力；对酶抑制剂、对不同pH值的稳定性提高固定化酶的稳