干细胞-PPT幻灯片

主要内容概述胚胎干细胞成体干细胞肿瘤干细胞一、干细胞概述1、干细胞与个体发育受精卵可以发育成为一个个体体细胞由受精卵分裂而来，却不能发育成为个体细胞的多态性实质上反映了细胞功能的多样性不同的细胞之间无法互换功能哺乳动物的胚胎发育在分裂至16个细胞后，细胞间的粘附突然变紧，形成内外两层。内层的细胞发育成内细胞团。这16个细胞的命运完全由随机事件决定，就是说任何一个细胞都有能力发育成内细胞团哺乳动物原肠胚——胚胎发育第二期神经胚——胚胎发育第三期神经嵴干细胞起源于神经管的背侧端广泛迁移到身体各个部位，并分化出多种类型的细胞：感觉神经元和神经胶质细胞肾上腺髓质细胞皮肤色素细胞舌骨等头部骨骼结缔组织肌肉组织间充质干细胞分化过程取决于迁移和定植的部位体节的形成、器官组织发生——发育的第四、五期三胚层建立后，经过一个器官系统发育的准备期，胚胎进入组织结构的形成和器官系统的发生阶段细胞普遍进入终末分化阶段2、干细胞的定义与分类传统的干细胞概念具有两个特性：自我更新与产生分化后代自我更新指干细胞进行均等分裂，产生两个遗传特性完全一样的干细胞。产生分化后代指干细胞可以进行不均等分裂，产生的两个子代细胞一个是干细胞，而另外一个是遗传特性有所不同的，要开始走上分化道路的定向祖细胞。按分化潜能分类，早期胚胎干细胞是全能的，它即能产生体细胞也能产生生殖细胞，而分化的后代细胞可从全能干细胞向多能干细胞和细胞谱系的各级祖细胞发展。全能干细胞：totipotent它具有形成完整个体的分化潜能。多能干细胞：pluripotent这种干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。单能（专能)干细胞multipotent这类干细胞只能向一种细胞类型或密切相关的两种细胞类型分化。按组织发生部位分类胚胎干细胞胚胎生殖细胞成体干细胞肿瘤干细胞胚胎干细胞embryonicstemcell存在于早期胚胎，具有多向分化潜力和无限增殖能力的细胞。胚胎生殖细胞（embryonicgermstemcell,EGcell）来自于早期胚胎生殖嵴原始生殖细胞的多能干细胞成体干细胞adultstemcell存在于不同组织中的未分化细胞,它保持有自我更新的能力和分化为该组织各种类型细胞的能力。肿瘤干细胞(tumorstemcell,TSC)肿瘤中一类与正常干细胞具有相似特征的细胞，但与正常干细胞相比，他们的增殖与分化出现异常。3、干细胞研究简史19世纪干细胞概念的提出20世纪60年代骨髓移植20世纪70年代小鼠胚胎干细胞的分离1981年小鼠胚胎干细胞建系1998-1999人胚胎干细胞系建系，Thomson，干细胞研究之父2006年

日本京都大学ShinyaYamanaka将小鼠成纤维细胞重新编程为诱导多能干细胞2012年诺贝尔生理学或医学奖揭晓，英国科学家约翰·戈登（JohnB.Gurdon）和日本科学家山中伸弥（Shinya

Yamanaka）获奖。。

二、胚胎干细胞1998年美国有两个小组分别培养出了人多能(pluripotent)干细胞：JamesA.Thomson在Wisconsin大学领导一个研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。他们使用的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取innercellmass细胞，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面marker和酶活性，证实它们就是胚胎干细胞。用这种方法，每个胚胎可取得15－20个细胞用于培养。JohnD.Gearhart在JohnsHopkins大学领导另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。他们的方法是：从受精后5－9周人工流产的胚胎中提取原始生殖细胞(primordialgermcell)。由此培养的细胞株，证实具有全能干细胞的特征。

1、胚胎干细胞的特征ESC的全能性细胞形态结构及核型细胞的高度分化潜能细胞具有种系传递能力，能够形成嵌合体动物碱性磷酸酶的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达ESC的全能性①形成畸胎瘤。将ESC注入同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞；②形成类胚体。培养ESC在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目，能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体，具有三个胚层组织；③直系分化。通过控制ESC生长环境，或遗传操纵特定基因表达，ESC可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ESC，可使之分化为神经细胞；④形成嵌合体。将ESC注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（chimera），ESC可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。

细胞形态结构及核型各种动物的ESC具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。ESC与卵圆柱期胚胎外胚层细胞和胎儿生殖嵴的原始生殖细胞类似，而与内细胞团细胞有差异。细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。正常ESC染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。

ESC在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，细胞界限不清晰，克隆周围有时可见单个ESC和分化的扁平状上皮细胞。ESC增殖迅速，每18～24h分裂增殖1次。此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。Aculturedishcontaininghundredsofcoloniesofmurineembryonicgermcells.Eachred-stainedspotrepresentsanindividualcolonycomprisedofhundredsorthousandsofstemcells.AphasecontrastimageofthepluripotentmurineembryonicgermcellPluripotentmurineembryonicgermcellsidentifiedbyredstainingESC的高度分化潜能ESC的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点。ESC在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。在单层培养时细胞自发分化成多种细胞悬浮培养中:“简单类胚体”

“囊状胚体”

细胞分化物。细胞具有种系传递能力，能够形成嵌合体动物嵌合体：是指由至少来源于两种不同受精卵的细胞组成的生物体个体。嵌合体小鼠的组织和器官有外源干细胞和囊胚两种细胞来源Duroc-Pietrain（杜洛克）猪特点：红色和黑色的点GermanLand-race德国长白猪特点：在头和腿均有白色碱性磷酸酶的表达许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的胚胎癌细胞（

EC细胞）和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（

Stagespecificembryonic，antigen，SSEA-1）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA－1的表达。小鼠SSEA-1的表达自8-细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。2、胚胎干细胞的分离培养ESCs的分离培养过程,通常是将桑椹胚细胞、囊胚内细胞团或胎儿原始生殖细胞接种到培养体系中进行抑制分化培养,类ESCs增殖形成岛状或巢状集落后,挑选典型集落用消化液消化离散细胞,接种到新的培养体系中,反复传代,获得纯度高、能稳定传代并维持未分化状态和全能性的ESCs胚胎干细胞的培养402.1胚胎干细胞的分离方法以早期胚胎为材料首先要获得内细胞团(innercellmass,ICM)。由囊胚分离培养ESCs时要分离ICM通常有两种方法：常规法：把获得的囊胚放于培养体系中培养,使其自然发育孵出并贴壁生长,形成清晰的细胞集落后将其挑选出来进行培养免疫手术法：去除透明带后,通过抗原抗体反应使滋养层细胞肿胀松散,然后吹打将其去除

将得到的ICM细胞培养在长有饲养层细胞的培养皿中。待其充分增殖后,挑取、消化离散并接种于新的饲养层上,经反复筛选后即可获得ESCs。2.2胚胎干细胞的培养方法饲养层细胞培养法无饲养层细胞培养法有饲养层细胞培养法采用有饲养层细胞培养法需要先准备饲养层细胞。目前使用的饲养层细胞主要有原代小鼠胚胎成纤维细胞(primarymouseembryofibroblast,PMEF)、3代~5代小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryofibroblast,MEF)以及已建系的SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系细胞（STO）。PMEF对ESCs的抑制分化和促生长作用优于STO,但其生命期有限,不能长期传代,而且随着传代次数的增多,其分泌各种因子的能力下降,甚至丧失;也不具有耐药性,不能用于转染外源基因的胚胎干细胞的筛选。目前已有转染新霉素抗性基因和白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)基因的STO细胞,既能保证足够量的LIF,又能用于转基因ESCs的筛选。STO细胞是已建成的细胞系,处理相对简单。无饲养层细胞培养法采用无饲养层细胞培养法要配制含有各种因子成分的培养基,能完全支持ESCs的生长和抑制分化。培养基分LIF辅助培养基和条件培养基。LIF辅助培养基利用LIF能抑制ESCs分化的原理,通过添加LIF和其他一些促生长细胞因子维持ESCs的生长和未分化状态条件培养基原理是利用活细胞分泌的因子促进ESCs生长和抑制其分化。2.3胚胎干细胞的传代接种后培养2d即能看见ESCs小集落的出现,3d~4d时逐渐增大,至6d~8d时即可进行传代培养。传代时挑选集落较大、形态典型、细胞分化较少的用玻璃针或毛细玻璃管分离下来,于消化液中消化,分散细胞团。第一次传代时不要消化至单细胞,以免传代后难以形成集落;以后的传代过程中可以消化成单细胞,以便于分离ESCs的克隆。一旦ESCs筛选成功尽量不要改变培养条件,否则很容易引起分化3、胚胎干细胞的鉴定形态学鉴定表面抗原检测碱性磷酸酶(AKP)活性的检测核型分析体外分化试验体内分化试验Oct-4活性检测嵌合试验3.1、形态学鉴定根据ESCs形态学特征进行鉴定。形态学检测是ESCs培养中最直观、最常用的鉴定标准,通过形态可以判断细胞的生长情况3.2、表面抗原检测ESCs及早期胚胎细胞表面有一些特定抗原,用相应抗体检测抗原的存在,从而鉴定是否ESCsESCs表达的早期胚胎阶段特异性抗原有:SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81

、ECMA-7等。ESCs还表达OCT4、Fgf4、H2az、Foxd3、Nanog和Sox2等与多能性有关的关键蛋白。3.3、碱性磷酸酶(AKP)活性的检测碱性磷酸酶在ESCs中含量较高,而在已分化的细胞中活性明显降低。用固蓝KR或固绿B盐、萘酚AS-TR染色未分化ESCs后呈深蓝紫色3.4、核型分析检测已建立的ESCs是否具有二倍体正常的核型。将ESCs用秋水仙素处理后胰蛋白酶消化成单细胞,再用低渗溶液处理,固定、染色,最后在油镜下观察3.5、体外分化试验体外分化试验将ESCs悬液培养形成囊状简单胚体或类胚体这类细胞多为自发分化,随培养条件和细胞密度而有所不同。常见多种类型的细胞混杂在一起3.6、体内分化试验是将ESCs悬液化注射给同种动物皮下。制作切片染色可观察到瘤块,类似畸胎瘤,除大量的干细胞巢和间质细胞外,还包括神经管、腺管、上皮组织、软骨和肌肉等多种类型的分化细胞。3.7、Oct－4活性检测Oct-4基因是小鼠胚胎发育早期、生殖细胞谱系以及体外培养的多能干细胞特异性表达的一种发育多能性的标志基因。通过鉴定Oct-4基因表达情况,来判断干细胞的多能性3.8、嵌合试验嵌合体的构建有3种方法,使用较多的是囊胚内注入法。将ESCs注入囊胚腔后培养恢复,然后移植到同期受体子宫内使胚胎继续发育,注入的ESCs参与胚胎发育过程,在新生个体的几乎所有组织(包括生殖系统)内都能检测到。通过嵌合可以证明ESCs具有全能发育的潜能4、影响胚胎干细胞分离培养的因素胚胎来源与质量培养方法培养基成分饲养层细胞血清质量及添加量4.1、胚胎来源与质量胚胎质量是影响ESCs分离培养的关键因素,只有生命力旺盛的健康胚胎细胞才可能在体外培养环境下生存。优秀胚胎形成的ICM呈团状,这种ICM细胞具有全能性,分离和克隆ESCs的成功率高良好的胚胎形成ICM呈条状或网状,部分细胞已具有分化的趋势,分离成功率不及团状ICM高劣等胚胎形成的ICM多呈分散状,其分离ESCs的成功率最低。4.2、培养方法目前，大多数研究认为饲养层细胞共培养效果优于无饲养层细胞培养法饲养层细胞的主要作用就是提供促进ESCs生长并抑制其分化的生长因子,培养效果较好,目前绝大多数ESCs的分离培养与建系都是采用这种方法。4.3、培养基成分培养基要有促进ESCs生长和抑制其分化的双重作用,目前在ESCs细胞的培养中多采用高糖DMEM加15%的FBS做基础培养基,另外添加一些细胞因子等微量成分4.4、饲养层细胞饲养层细胞的质量和来源影响ESCs的分离培养效果,现在使用最多的是PMEF和STO。4.5、血清质量及添加量由于血清直接取自动物,不同批次的血清会因个体差异而在成分上稍有不同;另外血清中蛋白、内毒素等一些不利于ESCs生长的成分含量也不一样。血清质量对ESCs分离培养效果影响很大,在一次ESCs培养中最好使用相同的血清。5、问题与挑战抑制分化的问题诱导分化的问题安全性问题5.1、抑制分化的问题抑制分化是ESCs分离培养中的关键性因素,也是决定ESCs质量和能否建系成功的重要因素。对细胞分化机制仍不完全清楚,抑制ESCs分化显得比较困难。现在研究者主要是通过直接添加细胞因子,或者采用共培养体系由共培养细胞分泌一些细胞因子,以抑制ESCs分化。这种抑制只是一定程度上的作用,培养物表面总有些细胞发生分化,培养环境的稍稍改变也会引起分化。虽然获得均一、未分化的ESCs在其研究和应用中非常重要,但是抑制ESCs分化也并非像关闭一个开关那样简单。5.2、诱导分化的问题诱导的关键是定向分化,获得专一类型的组织细胞。在临床治疗上通过干细胞移植来修复损伤组织是干细胞应用的一个重要途径,但从近年的研究来看直接移植ESCs是不可行的,很容易形成瘤性组织。经过诱导后使ESCs朝着目标组织发生分化,形成定向的组织或细胞才能用于移植,移植物要求纯度高,分化程度一致。现在已经获得人和小鼠的较稳定ESCs系,并成功诱导获得了一些组织细胞,如神经、心肌等,但并不能控制ESCs定向均一分化

。5.3、安全性问题移植后效果不稳定,治疗重复性差,目前的研究认为ESCs移植前的培养和处理对治疗效果有重要影响导入的外源基因和非人类基因会带来怎样的后果现在并不清楚。现在的研究中对ESCs的分化调控机制还不清楚,分化效率低,在分化控制上还有很多工作要做。三、成体干细胞成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。成体干细胞存在于机体的多种组织器官中。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。成体干细胞研究开始于造血干细胞1951年美国Lorenz等第一个报道骨髓细胞悬液输注受致死照射动物的实验结果,发现正常同种系动物供者的骨髓可以在严重破坏的受者骨髓中重新建立造血组织,并提出移植的科学假设,从此出现了骨髓移植(bonemarrowtransplantation,BMT)的术语。1961年加拿大Till和McCulloch第一次报道发现脾集落形成单位(colonyformingunit-spleen,CFU-S),作者和人们都朦胧地把CFU-S误当作小鼠造血干细胞存在的实验证据。1970年Stephenson首次发现红系晚期祖细胞集落CFU-E。1979年加拿大Fauser,Messner和美国Ogawa等又先后报道发现了小鼠和人类CFU-GEMM,他们当时都误认为这类含有多向髓系分化潜能的早期髓系祖细胞是多向分化潜能的造血干细胞,作者们都忽略了CFU-GEMM和CFU-S的集落中都不含淋巴系细胞集落的重要事实。更不知早期祖细胞也是多向性的。1994年美国Krause等首次报告,CD34是造干/祖细胞的表面标志。CD34是一种分化抗原,启动了造血干祖细胞的检测、富集的研究。此后，人们开始认始到具有兼向髓和淋巴两大系分化潜能的才是造血干细胞,而造血祖细胞已经失去髓/淋巴两系兼向分化的潜能。造血祖细胞只限于单独定向髓系或淋巴系分化。1.ASC研究与应用优势成体干细胞（ASC）的自体移植避免了免疫排斥；ASC在正常情况下处于静止状态，只有在病理情况下才显示出一定的自我更新潜能，导致细胞“永生化”

甚至癌变机率较小；ASC分化潜能比较局限，容易诱导向特定组织细胞分裂，也可直接用于体内组织原位修复；ASC向同种组织损伤部位迁移趋势明显，易用于干细胞替代治疗时的定位；分离和使用AS细胞不存在伦理等问题。2.局限或制约因素尚未在人体所有部位分离到ASC；遗传错误易出现在ASC中；ASC可能有基因突变等DNA异常；增殖能力不像ESC强。随着成体干细胞研究的深入，研究者观察到成体干细胞可以突破其“发育限制性”，跨系，甚至跨胚层分化为其他类型组织细胞。例如，骨髓来源的干细胞在特定环境中可向肝脏、胰腺、肌肉及神经细胞分化；肌肉、神经干细胞也可向造血细胞分化。人们称这种现象为“干细胞的可塑性”。3.ASC的“可塑性”及机制可塑性：ASC在特殊的外界条件诱导下，一种组织的ASC能超越该特定组织，分化成其他组织的功能性细胞，甚至具有跨越胚层分化为其他类型细胞的多潜能性。“可塑性”的机制：ASC本身就是多能干细胞，具备多向分化的潜能；成熟细胞的脱分化；与细胞融合有关；干细胞之间的转化。骨髓干细胞及其可塑性

骨髓和骨骼肌

造血干细胞

骨髓和肝脏

骨骼和心血管

间充质干细胞

骨髓和神经

骨髓和胃肠、肾脏、

皮肤和肺造血干细胞作为干细胞研究与应用的突破口造血细胞是细胞增殖分化的最佳模型。造血干／祖细胞及各系血细胞的表面标志较为清楚，细胞表型特征可进行定量分析，且可分选。造血干细胞增殖及向各系分化的重要诱导因子、受体、信号转导、微环境等因素较为清楚。造血细胞发挥功能可相对游离，不需“生物支架”、神经、血管、外科移植等复杂的“下游”工艺，因此便于直接应用于临床。造血干细胞谱系IsolationofPrimaryandImmortalizedCD34–HematopoieticandMesenchymalStemCellsfromVariousSourcesStemCells,Vol.18,No.1,1-9,January2000间充质干细胞是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中。骨髓间充质干细胞不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力，也可分化为各种神经细胞。脐带间充质干细胞来源广泛，易获得，表达多种胚胎干细胞的特有分子标志，并具有间充质细胞的所有特性。神经干细胞及其可塑性

神经干细胞

→

注入鸡胚或小鼠胚胎

→

产生嵌合体

→

有各胚层细胞，如肝、胃、心脏、肌肉、肾、脊索等；86胰腺干细胞和肝脏干细胞：

两者共同起源，可塑性关系密切；4、诱导多能性干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPS）2006年，日本京都大学的Yamanaka教授在《细胞》（Cell）上发表了具有里程碑意义的文章，详细介绍了其用四个因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc）将小鼠成纤维细胞逆转为类似多能干细胞的研究工作及结果，从此开创了iPS时代。

iPS的基础——细胞重编程成体细胞核的重编程：核移植后供体核停止本身的基因表达程序，恢复为胚胎发育所必需的胚胎化基因表达程序状态。此过程包括：染色体结构重建、DNA甲基化、组蛋白乙酰化、印记基因表达、端粒长度恢复、X染色体失活等。将成熟的体细胞与多潜能的细胞（ES细胞、胚胎癌细胞等）融合，或者用胚胎干细胞提取物来处理体细胞，可以在一定程度上使体细胞发生重编程。通过特定基因的表达将体细胞重编程。“基因重新编排技术”，借助“逆转录酶病毒”为载体,即向皮肤细胞中植入一组4个基因(Oct4,Sox2,c-myc和Klf4)，通过基因重新编排，使皮肤细胞具备胚胎干细胞的功能。这种被改造过的细胞称作“iPS细胞”InductionofPluripotentStemCellsfrom

mousefibroblats

bydefinedfactors

24factorstranscriptionfactors:Oct3/4、Sox2、Nanog......genesupgreatedintumors:Stat3、E-Ras、c-myc、Klf4、β-catenin..............ThefactorsareexpressedinEScells，roduceeachofthe24candidategenesintomouseembryonicfibroblasts(MEFs)fromFbx15βgeo/βgeoembryos(retroviraltransduction)(abgeocassette(afusionoftheb-galactosidaseandneomycinresistancegenes)intothemouseFbx15genebyhomologousrecombinationFbx15βgeo/βgeo

inactivated,noG418-resistantcoloniesStrategytotestcandidatefactorsSchematicdrawingrepresentingthestrategyforreprogrammingJamesThomson’sfactorsYamanaka’sfactorspSin-EF2-Oct4-PuromycinOct4pSin-EF2-Sox4-PuromycinSox2pSin-EF2-Nanog-PuromycinKlf4pSin-EF2-Lin28-Puromycinc-Myc-4day0day3day5dayRetrovirustransductionPlateonFeederESmedium+bFGFiPSgenerationSomaticcells5*104Day1:细胞准备Whenhumanadultfibroblast(HAF)cellshavereached80%confluence,aspiratemedium,washoncewithPBS,covercellswith0.05%trypsin,incubatefor5minat37°C.InactivatetrypsinwithHAFmedium,collectcellsina50-mlconicaltube.Centrifugethecellsat200gatroomtemperaturefor4minanddiscardthesupernatant.从体细胞到干细胞的重编程Day1:细胞准备Resuspendthecellsin1mlHAFmediumanddeterminecellnumberusinghemacytometer.DilutecellsuspensionwithHAFmediumto1104cellsml-1.Transfer1mlHAFsuspension(totally1104cells)perwellof12-wellplate(matrigelcoated).Incubateat37°C,5%CO2,for24h.Day2:病毒感染细胞Aspiratethemedium,replacewith1mlfreshHAFmedium,addpolybrene(final8ug/ml).AddOCT4,SOX2,Nanog,Lin28lentivirus100ul(oneT75flaskproducedvirushasbeenresuspendedin1mlmedium).Incubateat37°C,5%CO2,for24h.Day3:弃病毒Aspiratemedium,washcellsthreetimeswith3mlPBS,add1mliPSmedium.100×初始细胞形态/FibroblastDay4—day21:培养Changemediumeverydayforthreeweeks.Atthisstage,youcouldseedifferentcolonies,whichshowdifferentcellmorphologycomparedwithHAF.Day22:挑取ES样细胞克隆/传代MechanicalpickupsinglecloneandseedtothesinglewellswhichcontainingiMEFs.48hours,changemediumeverytwodays.Oneweekslater,theexactlyiPScolonieswillappear.livestainingbyTra1-60willbepositive.24factors22G418-resistantcolonieswhetherclonespossessedhaveEScell-likemorphologyandproliferationpropertiesdoublingtimeofiPSwasequivalenttothatofEScellsEScellmarkers(RT-PCR)RTminus:negativecontrol,addeverythingexceptreversetranscriptaseThepromotersofFbx15andNanog(Bisulfite

genomicsequencing)blackpointsindicatemethylatedCpGs;whitepointsindicateunmethylatedCpGdinucleotideswhichofthe24candidateswerecritical/important

method:theeffectofwithdrawal/deletionofindividualfactorsfrom24genesontheformationofG418-resistantcolonies.result:identified10factors(3,4,5,11,14,15,18,20,21,and22)Combinationofthese10genesaloneproducedmoreEScell-likecoloniesthantransductionofall24genesdid

Effectoftheremovalofindividualfactorsfromtheselected10factorsontheformationofG418-resistantcoloniesCombinationof4factorsidentify4factorsCombinationof3factorsCombinationof2factorsFourfactorsSomatic

cellsc-MycOct3/4Klf4Sox2InducedInducedPluripotentStemCells

whetherclonespossessedhaveEScell-likemorphologyandexpressESmarkergenes(RT-PCR)expressedthemajorityofmarkergenes,withtheexceptionofEcat1.Sox2wasonlyexpressediniPS-MEF10-6thepromotersofOct3/4andNanog(Chromatinimmunoprecipitationanalyses)thepromotersofOct3/4andNanogincreasedacetylationofhistoneH3anddecreaseddimethylationoflysine9ofhistoneH3CpGdinucleotidesinthese

promotersremainedpartially

methylatediniPScellsalkalinephosphataseandSSEA-1DNAMicroarraysRedindicatesincreasedexpressiongreenmeansdecreasedexpressiontheexpressionlevelofiPSissimilartoESGenesupregulatedinbothESandiPScells,GenesinEScells

areupregulatedmorePluripotencyofiPSCellsDerivedfromMEFsteratomaFormation

(invivo)differentiationintoneuralandmuscletissues(immunostaining)subcutaneousinjectionintonudemiceiPS-MEF10,iPS-MEF4,andiPS-MEF3cellsformedembryoidbodies(invitro)

☆embryoidbodiesfromiPS-MEF3cellsremainedundifferentiated☆pluripotencyofiPS-MEF10andiPS-MEF4andnullipotencyofiPS-MEF3invitroa-smoothmuscleactin(mesodermmarker),a-fetoprotein(endodermmarker),βIIItubulin(ectodermmarker)DifferentiationSoinducedpluripotentstemcellsfrommouseembryonicfibroblasts(MEFs)haveES-likemorphology，expressESmarkergenes

andownpluripotency

aswellasEScellsCanOct3/4,Sox2,c-Myc,andKlf4inducestemcellsfromhumansomaticcells?

2007年末，Thompson实验室和山中伸弥实验室几乎同时报道，利用iPS技术同样可以诱导人皮肤纤维母细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞。所不同的是日本实验室依然采用了用逆转录病毒引入Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf44种因子组合，而Thompson实验室则采用了以慢病毒载体引入OCT4、SOX2加NANOG和LIN28这种因子组合。2008年，哈佛大学GeorgeDaley实验室利用诱导细胞重新编程技术把采自10种不同遗传病患者病人的皮肤细胞转变为iPS，这些细胞将会在建立疾病模型、药物筛选等方面发挥重要作用。美国科学家还发现，iPS可在适当诱导条件下定向分化，如变成血细胞，再用于治疗疾病。哈佛大学另一家实验室则发现利用病毒将3种在细胞发育过程中起重要作用的转录因子引入小鼠胰腺外分泌细胞，可以直接使其转变成与干细胞极为相似的细胞，并且可以分泌胰岛素、有效降低血糖。这表明利用诱导重新编程技术可以直接获得某一特定组织细胞，而不必先经过诱导多能干细胞这一步。四、肿瘤干细胞肿瘤的细胞来源成熟分化的细胞去分化（de-differentiation）机体或组织内本已存在的干细胞在特定的分化水平停止分化或分化失常（dys-differentiation）Tannishtha,SeanJM,MichaelFC,etal.Nature,2001,414:105肿瘤是在具有无限增殖和自我更新潜能的很少一部分细胞的驱动下发生的，这一部分恶性转化的靶细胞即是肿瘤干细胞（cancerstemcell）。

系列稀释的小鼠白血病细胞移植到同品系的动物体内，移植细胞仅有1-4％能形成脾脏克隆。1958从小鼠腹水中分离骨髓瘤细胞,体外集落培养仅1/10000-1/1000癌细胞能形成集落,而且与在体内利用脾脏培养的克隆形成率一致。1971从白血病病人中分离出不同种类的白血病细胞，表面标记为CD34＋CD38-的细胞移植到NOD/SCID小鼠后能够形成克隆，而其他细胞都不具有肿瘤源性。1997正式提出CancerStemCell的概念2001从乳腺癌患者分离CD44＋CD22-/low的癌细胞200个，然后移植于小鼠身上形成乳腺癌；再从小鼠乳腺癌内分离癌细胞200个，又可形成肿瘤。2003肿瘤干细胞理论提出的意义为肿瘤的治疗和发病机制的研究提供了新的视野

正常干细胞和其它细胞突变后成为肿瘤干细胞-导致肿瘤的发生

根治肿瘤-即要靶向性清除肿瘤干细胞,又不影响正常干细胞的存活

干细胞修复组织和器官时警惕干细胞突变肿瘤干细胞的特点极强的自我复制更新能力，能够产生与上一代完全相同的子代细胞。

不断的分化能力，能够产生不同表型的肿瘤细胞，并在体内形成新的肿瘤。

具有与非致瘤细胞不同的表面标志。在肿瘤中的所占的比例较少。肿瘤干细胞分裂方式第一种是不对称分裂，即一个肿瘤干细胞分裂产生的两个子代细胞中，一个总是进一步分化成肿瘤细胞群，另一个总是肿瘤干细胞，以维持干细胞的数量不变

第二种是对称分裂

即一个肿瘤干细胞分裂成两个相同的子代细胞，然后随机决定其中一个仍为肿瘤干细胞，而另一个继续分化成为肿瘤细胞群。肿瘤发生的干细胞学说干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的原始细胞恶性肿瘤进行性生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似推测肿瘤是干细胞分化增殖失调而产生的异常组织肿瘤干细胞的定义是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体.它具有自我更新的能力.是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的源泉.干细胞存在的证据1967年-人白血病细胞-动物体内-1%-4%的细胞形成脾集落-白血病干细胞(Leukemiastemcell,LSC