微生物-微生物与基因工程

九、微生物与工程（2）克隆及表达宿主的策2、

工程包括哪几个大的方向？4、工程菌种是怎样选取的？（选择略及理由）6、要对

微小的微生物动“手术”需要哪些特殊的工具？这些工具是人造的还是自然就有的？8、很多微生物都只有一个细胞，而动植物有数以亿计的细胞，并且细胞各有分工，因此微生物用一个细胞完成很多细胞的功能，在

表达过程中是否会出现

？2014年下半年微生物学授课安排：一、绪论（4）二、纯培养和显微技术（3）三、微生物类群与形态（10）四、微生物的营养（3）五、微生物的代谢（4）六、微生物的生长繁殖及其控制（4）七、

（4）八、微生物遗传（8）九、微生物与

工程（2）微生物的进化、系统发育与分类鉴定微生物的生态与免疫√工程（genetic

engineering）或重组DNA技术(binant

DNA

technology)对遗传信息的分子操作和施工：对分离到的或

的

经过改造，

载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量

产物，或者令生物

新的性状。（P264第一段）二十世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，推动了生物科学的迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。（参见P264）微生物在

工程的兴起和发展过程中起着不可替代的作用！（参见P267）“微生物与工程”第一节微生物与克隆载体第二节

工程的常用技术和方法第9章微生物与

工程克隆载体的特点与应用PCR技术的原理与方法其他需要自己看书掌握的内容见本思考的题目√（1）独立的子－能够进行独立自主的（5）载体DNA须易于分离和实验操作克隆载体的特点与应用克隆载体（cloning

vector）作为克隆载体的基本要求（P274第一段）：（参见p274）√（2）具有若干限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的√（3）具有可供选择的遗传标记－便于对阳性克隆的筛选和鉴定（4）具有一定的安全性－胞内不重组和转移；胞外不扩散质粒载体√λ噬菌体载体√质粒载体M13噬菌体载体噬菌粒载体真核细胞的克隆载体人工a）低分子量有利于DNA的分离和操作；特点：b）具有较高拷贝数；c）易于导入细胞；d）具有安全性；质粒载体克隆外源DN段的大小一般不超过15Kb（参见P274

~

275）参见p274

图10-6参见p274

图10-6EcoO

109

2674Sspl2501AatII

26,1"7

I

NdeI

1

3Nar.I

235Xmnl2294Scal2177pUC192686bpP1aco

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i

{

)396EcoRISac'IKpnISmalXmaIBamHIXbaIHineIIPstlSphIHindIII447Gsu11784Cfr10I1779

IPpa11766400

4204'40

460AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCA

TEcoRI

SacI

K

p

n

I B

a

m

H

IXbalSmaIXmalHincUAce

ISaflPstl

SphI

HindI111lacZ'一飞rlleMetThr(Met)◦J

All

treated

bacteria

are

spread

on

a

nutrientagar

plate

containing

ampicillin

and-galactosidase

substrate,

and

incubated8

White

colonies

that

appear

must

containforeign

DNA.

Blue

colonies

must

notcontain

foreign

DNAv/3-galactosidase

gene

(/acZ)cillin-(amp芍RestrictionSItePolylinkerForeign

ONARestrictionsites恁binantplasmidBacteriumF

ig

u

r

e

9

.

9

O

n

e

m

e

t

h

o

d

of

selectingbinant

bacteria.W

hy

are

some

c

olon

沁b

lu

e

andotherswhite?具有细菌启动子功能的嗜盐古菌DN段的克隆嗜盐古菌总DNA随机酶降解片段质粒载体(pKK232-8)筛选氯霉素抗性转化子穿梭载体（Shuttle

vector）起始区自我

能力pBE2：大肠杆菌－枯草胞杆菌穿梭载体将野生型λ噬菌体DNA进行改造后建成，主要是去掉噬菌体DNA上过多的常用限制酶的酶切位点，及对非必要

区域进行改造。（P275第2大段）特点：1）分子遗传学背景清楚；2）容量较大（能容纳大约23kb的外源DN

段）；3）

效率高。其

宿主细胞的效率几乎可达100％，

而质粒DNA的转化率却只有0.1％。4）具有更为狭窄的寄主范围，更加安全。（参见P275）粘性末端5'-

pGGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGA5'-

p(a)l环化作用COS多、．－－－....

/，Z＇，沁少开环结构(b)与溶原性相关的

可以被外源DNA取代而不影响λ噬菌体的、

和裂解宿主细胞的能力。型载体（insert

vector）取代型载体（replacement

vector）生重组噬菌体DNA也可不经过体外包装而直接通过转染（转化）方式进入宿主细胞；生

经过体外

操作和包装后形成重组噬菌体，可以通过正常的途径进入宿主细胞；质粒和噬菌体载体都可用于构建

文库；但后者更有优势：容纳的外源DN

段较大；以途径进入宿主细胞的效率比转化高；以探针杂交－技－术－对－重－组－噬有菌关体技进术行在筛第选10章介绍1．原理特点：在体外模拟细胞内进行的DNA过程（参见P270）PCR技术的原理与方法parenmolecule3

}HelicaseFree

3'-0Hgle-stranded

binding

proteinDNA

polymeraseFigure

6.17

Events

at

the

DNA

replic

at

i

o

n

f

ork.LaggingstrandSemiconservative『eplicationnewstranddaughter

moleculedaughter

moleculeThe

Nobel

Prize

in

Chemistry

1993"for

contributions

to

the

developments

of

methodswithin

DNA-based

chemistry""for

his

invention

of

the

polymerase

chain

reaction

(PCR)

method"Kary

B.

MullisLa

Jolla,

CA,

USAB:1944*One

Friday

night

I

was

driving,…….

My

girlfriend,Jennifer

Barnett,

was

asleep.I

was

thinking.

…….*However,

shocking

to

me,

not

one

of

my

friends

or

colleagues

would

get

excitedover

the

potential

for

such

a

process.*In

September

I

did

my experiment.

I

like

to

try

the

easiest

possibilities

.So

one

night

I

puthuman

DNAand

the

nerve

growth

factor

primers

in

alittlescrew-cap

tube

with

an

O-ring

and

a

purple

top.I

boiled

for

a

few

minutes,

cooled,added

about

10

units

of

DNA

polymerase,

closed

the

tube

and

left

it

at

37°.

Itwasexactly

midnight

on

the

ninth

of

September.*The successful

experiment

happened

on

December

16th.

I

remember

thedate.

It

was

the

birthday

of

Cynthia,

my

former

wife

from

Kansas

City,

who

hadencouraged

me

to

write

fiction

and

bore

us

two

fine

sons.

I

had

strayed

fromCynthia

eventually

tospend

two

tumultuous

years

with

Jennifer.Kary

B.

Mullis基本原理：模板

引物

DNA聚合酶4种dNTP（参见P270～271）1.2Single

strands1.1Eu

0

9

0

eouEq

Jos

qe

a>l-e

-e

a1.00.90.8Melting—Doublestrand6◦·2＿9TmII

I

I

I

l＼80

85

90

95

100ocHelicaseFree

3'-0H今Slow

coolingC

A

C

T

C

G

A

T＇，3

5LaggingstrandSingle-stranded

binding

proteinDNA

polymeraseDouble

stranreformedFigure

6.1vnt

a

t

t

h

DNA

re

p

l

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t

io

n o

r

k

.Heated