重组dna技术0分子生物学名师优质课赛课一等奖市公开课获奖课件

重组DNA技术(DNA克隆或分子克隆)

DNARecombinationTechnique

(DNACloningorMolecularClone)

第二章第1页1944年O.T.Avery肺炎球菌转化试验:从S型细菌中分别抽提出DNA、蛋白质和荚膜物质，并把每一个成份同活R型细菌混合，悬浮在合成培养液中。结果发觉只有DNA组分能够把R型细菌转变成S型细菌第2页重组DNA技术发展史O.T.Avery（1944年）证实，遗传信息携带者是DNA；1953年,

Watson和Crick提出了DNA分子双螺旋结构模型1958年,Meselson和Stahl证实了DNA半保留复制同年，Crick提出遗传信息传递“中心法则”1961年，

F.Jacob和J.Monod提出了操纵子模型1966年，Nirenberg等人破译了氨基酸64个遗传密码1972年，P.Berg等率先完成DNA体外重组(诺贝尔化学奖)1973年，S.Cohen等深入实现了重组DNA转化1977年美国南旧金山建立世界上第一家遗传工程企业，专门应用重组DNA技术制造医学上主要药品。1980年，第一家应用重组DNA技术生产胰岛素工厂。1982年，美国FDA同意首例基因工程产品--人胰岛素1997年英国罗林研究所成功克隆了多莉。第3页人体生长激素释放激素(SS)抑制和调整各种激素作用从动物脑中提取:5mg---50万只羊脑基因工程9升大肠杆菌培养液第4页相关概念DNA克隆工具酶目标基因基因载体基本原理

重组DNA技术与医学关系主要内容：第5页第一节、重组DNA技术相关概念ConceptAssociatedtoRecombinantDNATechnology克隆(clone):是指从一个共同祖先无性繁殖下来一群遗传上同一DNA分子、细胞或个体所组成群体获取同一拷贝过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆第6页技术水平：分子克隆(molecularclone)（即DNA克隆）

细胞克隆个体克隆（动物或植物）

第7页是在体外将不一样起源特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或其它载体分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到适当受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），筛选出含有目标基因转化子细胞，再进行扩增、提取取得大量同一DNA分子(recombinantDNA,chimeraDNA），即DNA克隆，所以DNA重组技术又称为DNA克隆（DNAcloning）。DNA克隆第8页生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等

基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用方法及相关工作称基因工程，又称重组DNA工艺学或重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)，基因操作(genemanipulation)、遗传工程(genedcengineering)。第9页(二)目基因进行DNA重组目标主要有两方面：①分离取得某一感兴趣基因或DNA②取得感兴趣基因表示产物（蛋白质）这些使我们感兴趣基因或DNA序列就是目标基因(targetDNA)。目标基因有两种类型：cDNA(complementaryDNA):在体外经反转录合成．与mRNA互补DNA。基因组DNA(GenomicDNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息全部DNA序列。第10页(三)载体一.表示载体(expressionvector):为使插入外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计载体称为表示载体。二.克隆载体(Cloningvector):为使插入外源DNA序列被扩增而特意设计载体称为克隆载体。第11页第二节重组DNA技术操作基本过程基本原理目标基因获取DNA导入受体细胞外源基因与载体连接克隆载体选择和构建重组体筛选克隆基因表示

第12页重组DNA技术操作过程可形象归纳为：分分离目基因切限制酶切目基因与载体接拼接重组体

转转入受体细胞筛筛选重组体

第13页

目基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线第14页以质粒为载体

DNA克隆过程第15页第16页第三节主要工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，含有完整DNA聚合酶I53聚合、35外切活性，而无53外切活性。惯用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标识等反转录酶合成cDNA替换DNA聚合酶I进行填补，标识或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标识探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基第17页一.限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定义：第18页第一个字母取自产生该酶细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发觉先后次序。命名：Hin

dⅢ属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株第三种酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中惯用Ⅱ型）分类：第19页Ⅱ型限制性核酸内切酶作用特点——

回文结构(palindrome)

大部分Ⅱ型限制酶能够识别由4个～8个核苷酸组成特定序列。Ⅱ型酶识别含有回文结构核苷酸序列（图2-2）。“回文”意为顺读和倒读都一样词语切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第20页BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第21页起源不一样限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功异源酶：第22页有些限制性内切酶即使识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同粘性末端，称为同尾酶。这两个相同粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶第23页名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割点切割后产生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’MboⅠ

5’…▼GATC...3’NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后产生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后产生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’限制性内切核酸酶第24页二、DNA连接酶(基因工程“缝纫针”)：

1.T4噬菌体DNA连接酶：两个不一样片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6µmol/L)或平末端(Km=50µmol/L)。DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导2.大肠杆菌DNA连接酶:不能催化平末端DNA分子连接三、DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段):大肠杆菌DNA聚合酶I含有三种酶活性。Klenow片段含有二种酶活性（去除5’3’外切酶活性）。2.TaqDNA聚合酶:耐热（75-80℃），分子量65kD,也具5’3’外切酶活性。反转录酶(RDDP):多功效酶，无3’5’DNA外切酶活性，含有3’5’RNA外切酶活性。第25页工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，含有完整DNA聚合酶I53聚合、35外切活性，而无53外切活性。惯用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标识等反转录酶合成cDNA替换DNA聚合酶I进行填补，标识或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标识探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基第26页第四节惯用载体

定义载体是携带目标基因进入宿主细胞扩增和表示工具。具备条件:①含有自主复制能力②有多个单一限制性内切酶酶切位点（MCS）③含有选择性遗传标识④分子量小⑤拷贝数高（10个～200个/细胞）⑥含有较高遗传稳定性。惯用载体:质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA第27页EcoRⅠSacⅠKpnⅠSmaⅠBamHⅠXbaⅠSalⅠPstⅠSphⅠHindⅢpUC19(2686bp)AmprLacZ´

Oriori

pUC19质粒载体图第28页质粒

(plasmid):是细菌内携带染色体外小型双链环状DNA，能独立进行复制。特点:1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自主复制；有较高拷贝数。2.含有一个以上遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。3.含有多个限制性酶单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因插入。第29页惯用质粒载体（一）

pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA经过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：（1）含有复制起始点和复制调整信号；（2）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目标基因；（3）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因Amp+，便于重组体细胞筛选。第30页第31页1.抗药性标识选择第32页（二）

pUC系列载体:由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点：①含有更小分子量和更高拷贝数。②“蓝白斑”筛选:

pUC载体中LacZ´基因可编码β-半乳糖苷酶（β-Gal）N端α-肽链，该α-肽与宿主细胞(如E.coliJM109）中F´因子上LacZ´△M15基因（α-肽缺点型）产物互补，产生完整、有活性β-半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成蓝色菌落。当外源基因插入MCS后，LacZ´α-肽基因读码框被破坏，不能合成完整β-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。称为“蓝白斑”筛选。第33页EcoRⅠSacⅠKpnⅠSmaⅠBamHⅠXbaⅠSalⅠPstⅠSphⅠHindⅢpUC19(2686bp)AmprLacZ´

Oriori

pUC19质粒载体图第34页3．依据β-半乳糖苷酶显色反应筛选:标志补救lacZAmN2H片段COOH片段第35页X-galLacZ蓝色化合物X-gal第36页第五节目标基因获取和体外重组化学合成法：较短基因（60-80bp）基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)一.目标基因获取:第37页1.化学合成法获取目基因由已知氨基酸序列推测可能DNA序列。较短基因（60-80bp）用途：PCR引物,测序引物,定点突变,核酸杂交探针第38页组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带全部基因组DNA集合2.从基因组DNA文库获取目基因基因组DNA(genomicDNA):指代表一个细胞或生物体整套遗传信息全部DNA序列第39页构建基因组DNA文库基本过程

第40页mRNAcDNA

双链cDNA重组DNA分子cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制3.从cDNA文库获取目基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTTcDNA:指经反转录合成、与RNA(mRNA或病毒RNA)互补单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA第41页基因组文库和cDNA文库比较

第42页PCR技术基本过程模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循环仪94oC5’94℃55℃72℃4.PCR技术获取目基因:第43页二.外源基因与载体连接:体外重组DNA体外重组本质上是一个酶促反应过程，在DNA连接酶催化作用下，将外源DNA分子与载体DNA分子连接成一个重组分子过程。连接方式:（一）黏性末端连接（二）平末端连接（三）同聚物加尾连接（四）人工接头连接（五）T-A克隆第44页BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目基因自连同一限制酶切位点连接1.粘性末端连接第45页不一样限制酶切位点连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体第46页目基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目基因自连2.平端连接

第47页DNA连接酶同聚物尾巴同聚物加尾法连接重组DNA分子同聚物加尾连接:在末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。第48页利用人工合成接头连接重组DNA分子4.人工接头(linker)连接:由平端加上新酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接第49页5.T-A克隆T-A克隆策略是一个直接将PCR产物插入到载体中方法。第50页一、重组DNA分子导入选定受体细胞应具备条件：1.易于接纳重组DNA分子导入；2.对载体复制、扩增和表示无严格限制；3.不存在特异性降解外源DNA酶系统；不对外源DNA进行修饰；能表示重组体分子所提供某种表型特征。惯用导入方法:

（一）转化（transformation）（二）转染（transfection）（三）感染（infection）第六节重组DNA分子导入和筛选与判定第51页转化方法：1.氯化钙法：细菌处于低温、低渗CaCl2溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组DNA易进入2.电穿孔法：除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等参数。特殊处理受体细胞细胞膜特征改变（一）转化（transformation）第52页CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2

感受态细菌重组体转入细菌第53页（二）转染

——将表示载体导入真核细胞过程方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染

电穿孔:操作简单且转染效率高，几乎可转染任何细胞用于瞬时表示或稳定表示。不过它需要专门仪器，确定最正确试验条件。脂质体转染:脂质体（liposomes）是一个人造类脂膜.用脂质体包裹DNA，瞬时表示和稳定表示，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大，昂贵。

显微注射:转染效率高，但需要一定仪器和操作技巧。主要用于稳定表示第54页（三）感染（infection）感染是指以人工改造噬菌体或病毒为载体构建重组体DNA，经体外包装成含有感染性噬菌体颗粒和病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒外壳蛋白将重组DNA注入细菌或真核细胞。感染效率很高，但重组体DNA需经过较为复杂体外包装过程。第55页(一）依据重组载体遗传表型进行筛选1．依据载体抗药性标识筛选2．依据载体抗药性标识插入失活选择3．依据β-半乳糖苷酶显色反应筛选4．依据插入外源基因性状进行筛选(二）限制性核酸内切酶酶切判定（三）核酸分子杂交法（四）PCR法（五）免疫化学检测法（六）DNA序列检测：二.重组体筛选与判定第56页1.抗药性标识选择第57页AmprTetrBamHⅠ位点BamHⅠ酶切BamHⅠ酶切DNA连接酶目DNA重组质粒大肠杆菌含Amp平板含Amp平板含Tet平板

2.抗药性标识插入失活选择第58页3．依据β-半乳糖苷酶显色反应筛选:标志补救lacZAmN2H片段COOH片段第59页X-galLacZ蓝色化合物X-gal第60页4．依据插入外源基因性状进行筛选

如把酵母基因组DNA随机切割后插入到质粒载体中，然后将重组质粒转化到组氨酸缺点型大肠杆菌细胞中，并在无组氨酸培养基中培养。这么只有含酵母组氨酸基因并取得表示转化菌才能在无组氨酸培养基中生长。第61页（二）.限制性核酸内切酶酶切判定凝胶电泳检测加样孔DNAMarker空质粒重组质粒重组质粒酶切重组质粒PCR扩增片段第62页原位杂交（三）.核酸分子杂交法:菌落杂交筛选法第63页（四）.PCR法一些载体MCS两侧存在保守序列，如pGEM系列载体MCS两侧是T7及SP6开启子序列，可依据此序列设计引物，对提取重组质粒进行PCR扩增。假如已知目标基因全序列或其两端序列与全长，可设计合成一对引物，以转化菌质粒DNA为模板进行PCR扩增，若PCR产物与目标基因预期长度相一致，那么即可初步筛选出含重组体阳性菌落。第64页鸡β肌球蛋白克隆和检出（五）.免疫化学检测法第65页（六）.DNA序列检测ACTGAAGGCT第66页标准：选择标志，强开启子，翻译调控序列，多接头克隆位点外源基因在原核细胞中表示：1．融合型表示蛋白所谓融合型表示是指将外源目标基因与另一基因相拼接构建成融合基因进行表示。2．非融合型表示蛋白3．分泌型表示蛋白利用分泌型表示载体，需要在信号肽帮助下进行。4．包涵体

1.原核表示体系第七节克隆基因表示第67页E.coli表示体系不足：不宜表示真核基因组DNA；不能加工表示真核蛋白质；表示蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)；极难表示大量可溶性蛋白第68页优点：可表示克隆cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表示蛋白质表示产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济2.真核表示体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）第69页真核表示载体大多是穿梭载体,通常包含以下元件：1．开启子包含SV40、CMV、RSV及LTR等。2．增强子3．剪接信号4．终止信号和PolyA化信号5．遗传选择标识：胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等。第70页新霉素抗性选择系统

新霉素类似物G418（geneticin）对真核和原核细胞都有毒性。表示载体中携带neor基因编码磷酸转移酶能使G418失活，所以当真核细胞中导入了含neor基因载体后，转染细胞就能够在含有G418培养基中生长而得以筛选。该选择系统适合用于全部真核细胞。第71页重组DNA技术与医学关系非常亲密并前景远大DNARecombinationTechniqueisCloslyRelatedwithMedicineandhasaGoodPerspective第72页重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及一些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊疗试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱第73页重组DNA技术操作主要步骤载体质粒噬菌体病毒目基因（外源基因）基因组DNA

cDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体宿主筛选表型筛选酶切电泳判定菌落原位杂交第74页一、A型题：1．以质粒为载体，将外源基因导入受体菌过程称为：A．转化B．转染C．转导D．转位E．感染2．最惯用筛选转化细菌是否含有质粒方法是：A．营养互补筛选B．抗药性筛选C．免疫化学筛选D．原位杂交筛选E．Southern印迹筛选3.α互补筛选属于：A．抗药性标志筛选B．酶联免疫筛选C．标志补救筛选D．原位杂交筛选E．免疫化学筛选4.溶原菌是指：

A．整合了噬菌体基因组细菌B．整合了质粒基因组细菌

C．含有独立噬菌体基因组细菌

D．含有独立质粒基因组细菌