RNApull-down的秘传绝技一口气都告诉你

RNApull-down的秘传绝技，⼀⼝⽓都告诉你！最近⼏年的⾮编码RNA热潮虽然已经不再新颖，但相信依旧有许多⼩伙伴们深陷其中，⽽最普遍的ceRNA机制已经不再受⼤家欢迎，RBP机制逐渐成为选择的⽅向，RBP机制最重要的⼀点就是检测与⾮编码RNA结合的蛋⽩质。检测RNA与其结合蛋⽩的重要技术⽅式就是RNApull-down。这⾥就会有⼀个问题：RNApull-down和RIP有什么不同，如何进⾏选择？解决这个问题，⾸先我们需要介绍⼀下原理：RNApull-down技术是利⽤⽣物素标记的RNA和链霉亲和素标记的磁珠来⾼效富集及鉴定RNA结合蛋⽩。⽽RIP实验是运⽤针对⽬标蛋⽩的抗体把相应的RNA-蛋⽩复合物沉淀下来，经过分离纯化对RNA进⾏分析。两者均为检测RNA和蛋⽩的相互作⽤，只是检测的形式不同⽽已。（图⽚来源⽹络）⼀、如何进⾏该实验，如何选择试剂盒？万事开头难，相信很多⼩伙伴在刚开始进⾏实验的时候都咨询过⼀些试剂商，本⼈也询问过⼀些，有些试剂商直接建议全部外包实验，并包括后续的质谱检测。建议⼤家尽量不要选择这种⽅式，毕竟实验结果是真是假，不能得到很好保障，⾮常影响后续实验进展。（图⽚来源⽹络）⼆、RNApull-down操作需注意！1.实验前期准备1).⾸先是样本的收集和处理，如果样本是细胞，要考虑细胞中该RNA的表达量，如果RNA含量较低，那提取出来的RBP可想⽽知会⾮常少，建议⼤家提前准备较多的细胞。（本⼈的试剂盒要求的量是107个细胞，实验操作时使⽤了8个10cm⼤⽫。）也看到很多⼩伙伴说可以先进⾏过表达该RNA后再进⾏pull-down实验，⼤家可以尝试。2).由于该实验我们提取的⽬的蛋⽩和细胞中的RNA含量都较低，因此更需要注意的是：实验操作过程预防RNA和蛋⽩的降解！进⾏实验的前两天，⼀定要准备好实验需要的枪头，EP管等。均需⽆酶⽆菌！提前⾼压，做好准备，实验进⾏时，戴好⼿套和⼝罩！实验操作台提前使⽤DEPC⽔擦拭！剩余耗材准备：磁⼒架，碎冰，低温⾼速离⼼机，冰盒，漩涡振荡器。2.实验操作重点实验的操作，⼤家可以根据⾃⼰购买的试剂盒说明书严格进⾏。⼀般均包括以下⼏个关键步骤。1).探针的制备：这步强烈建议⼤家交给靠谱的公司进⾏构建，便宜好⽤易上⼿！2).探针-磁珠制备：按照说明书进⾏操作，没有任何问题。3).蛋⽩样本的提取，除核酸：即制备蛋⽩样本。如果设计的组较多，可以选择分别提取，每次提取的蛋⽩样本可短时间内，冻存于-80度冰箱低温保存。4).RNApull-down：同样是按照说明书进⾏。重点：到最后⼀步孵育洗脱后收集上清（即最终样本），⼤家可以根据⾃⼰的情况，加适当量buffer（减少量）！例如本⼈试剂盒上写60ul，但加上60ul后，蛋⽩浓度太低，以⾄于后续实验进⾏有些困难。（图⽚来⾃⽹络）三、后续实验安排有哪些？1.质谱实验收集的蛋⽩样本进⾏质谱检测是⼤多数⼩伙伴的选择。质谱检测⼀般需要试剂公司进⾏，这项服务国内有很多公司进⾏选择。需要⼤家提前联系好如何进⾏送样更⽅便检测。本⼈选择公司建议送胶条样本，需要⾃⼰进⾏蛋⽩电泳，⼩tip!：样本⼀定要全部上样。（本⼈即使制备⼤量细胞，后续buffer加⼊较少，但考马斯亮蓝染⾊后，条带也是⾮常浅，但只要能够看见条带，即可进⾏质谱检测！）2.蛋⽩检测（WB实验）WB蛋⽩检测即为常规检测。3.银染实验⼤多数⽂章中都有⾮常漂亮的银染图⽚，本⼈就是被此吸引，但操作过程中发现⾮常多的要点！1).⾸先，市⾯上有较多好⽤的银染试剂盒可供⼤家选择。⼩伙伴们可以直接购买，如果实验室试剂较全，也可⾃⼰制备。2).银染实验过程中使⽤的⽔，⾮常重要！！⼀定要选择去离⼦⽔或三蒸⽔（本⼈嫌⿇烦中间步骤使⽤过⾃来⽔，结果⾮常糟糕。）3).染胶的器材，⽫或托盘提前处理，洗⼲净后，使⽤超纯⽔冲洗。4).银染过程中，洗涤显⾊时，条带刚显现或背景开始变为淡黄⾊，即需要终⽌反应，否则背景会⾮常深。（图⽚来⾃⽹络）最后，好的实验数据需要每个实验⼈⾃⼰尽⼼去做，如果⼩伙伴们对RNApull-down实验抱有尝试的⼼态，那么细⼼查资料，准备实验都会有好的收获。RNApull-down并不困难，⼩伙伴们冲呀！（图⽚来⾃⽹络）注：此推⽂未经许可禁⽌转载！•【新⼿攻略】⾮编码RNA这么⽕，你⽂章的插图画好了吗？•【新⼿攻略】⼤⿏繁育⼀般常识及注意事项•【新⼿攻略】原代细胞分