凝胶分离法课件

凝胶过滤色层分离法一．目的要求：

学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。

凝胶过滤法分离蛋白质二．原理凝胶过滤即凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)，也称分子排阻层析(molecularexclusionchromatography)，分子筛层析(molecularsievechromatography)或凝胶渗透层析(gelpermeationchromatography)。当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。葡聚糖凝胶（Sephadex）是最常用的凝胶。交联葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。SephadexG-10，15，25，50，75，100，150，200数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。SephadexG-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。蠕动泵记录仪部分收集器梯度制造仪层析柱检测仪洗脱液洗脱时，大分子受阻小最先流出，小分子受阻大而最后流出，结果使大小不同的物质分离。用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。用于分离及测定样品分子量：标准分子量样品，logMW对洗脱体积作图三、器材与试剂1×20cm层析柱、葡聚糖凝胶Sephadex-50、蒸馏水、三角铁架、4mg/ml蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液。实验操作2、装柱取1×20cm层析柱一根，底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱下过滤层的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占层析柱内部总体积的1/3时，关闭下端出口。自顶部缓缓加入Sephadex-50悬液，待底部凝胶沉积1-2cm时，再打开出口，凝胶加至离层析柱顶部约3cm即可。用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积(不能让凝胶表面露出水面)。在装柱过程中，凝胶柱内若有气泡和分离断层现象时，可用玻棒搅动消除这些现象或重新装柱，装柱结束后其凝胶表面应平整实验操作3、加样：取4mg/ml蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混合，即为上柱样品。将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面(不要使平整的床表面搅动)。打开出口，让样品进入床内，直至样品全部进Sephadex凝胶柱，关紧出口。滴加蒸馏水使之成2cm水柱。实验操作4、洗脱和收集调节蠕动泵流速，使得进水速度0.3ml/min。打开出口，让柱内液体缓慢流出,流速0.3ml/min，(不能让凝胶表面露出水面)取小试管20支，每管收集1ml，观察两种颜色出现的管号。实验操作5、绘制洗脱曲线。五、注意事项接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。

实验原理

脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交联葡聚糖SenhadexG－150层析柱酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。称取2g大豆粉+丙酮6m(充分混匀),

丙酮2ml洗小三角烧瓶一次离心管离心（3000/分）10分钟沉淀(弃）上清液

(V1)+等体积的冷丙酮,离心（3000rpm,10’)上清液(弃）沉淀沉淀中的丙酮蒸发后,+2.5mlH2O

样品（脲酶粗提液）

1、样品的制备

实验操作①.检查是否通畅：向柱中先加入少量水，观察出口2、装柱③调节流速：调节凝胶床所能承受的最大水压，使出口流速7-8d/min。②灌入凝胶：将凝胶用玻璃棒搅匀自顶部缓慢加人柱内,使凝胶上升至顶端3cm左右为宜，观察凝胶与水分层,此间不能使胶面干掉。注：如床表面不平整，可在凝胶表面用玻璃棒轻轻搅动，再让凝胶自然沉降，使床面平整。上样稀释液:

脲酶粗提取液0.1ml+3.9ml蒸馏水为上样稀释液，然后取试管若干编号，按下表操作：(单位:ml)空白(0)酶液检测管123456789上样稀释液检测管(10)尿素磷酸缓冲液酶液无离子水0.51.0--0.5分别加0.5分别加1.0分别对应加0.5ml收集的各管酶液---0.51.00.5上样稀释液---37℃保温15分钟，保温结束，各管中立即加HCl0.5ml4、检测①脲酶活性的检测:取11支试管然后另取11支试管同上编号，按下表操作空白(0)酶液检测管（1-9管）上样稀释液检测管(10)从上面保温后的各管取出无离子水3%阿拉伯胶0.1ml2.9ml2滴0