第八组-项目二-链霉素的生产课件

链霉素的生产方案的制备制作小组：第八组一、概述 链霉素（streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12。1943年美国S.A.瓦克斯曼从链霉菌中分离得到，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。从此，结核杆菌肆虐人类生命几千年的历史得以有了遏制的希望。（一）链霉素及其理化性质

链霉素是氨基糖苷类抗生素。链霉素分子由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L葡萄糖胺组成的三糖苷，在1，3-位置上带有2个胍基的l，3-去氧青蟹肌醇，去掉2个脒基后称为链霉胺。链霉糖是带有支链的5’-脱氧五碳糖，在第3碳上有一个醛基。N-甲基-L-葡萄糖胺是在第2碳上的-NH2被甲基化(-CH3NH)的L-葡萄糖胺。这三糖连接的糖苷键都是α型的糖苷键。结构式ieg实验仪器与材料培养基1.斜面高氏一号培养基可溶性淀粉2%氯化钠0.05%硝酸钾0.1%三水磷酸氢二钾0.05%七水硫酸镁0.05%七水硫酸亚铁0.001%琼脂1.5%-2.0%pH：7.4-7.62.种子培养基可溶性淀粉3%玉米蛋白粉0.5%碳酸钙2.0%玉米浆3.5%pH:7.0-7.53.发酵培养基葡萄糖4.0%玉米淀粉3.5%玉米浆2.0%玉米蛋白粉3.0%NH4Cl0.5%NaCl1.5%CaCO31.5%泡敌0.05%pH7.0-7.2（二）实验菌种：灰色链霉菌，微生物实验室保藏（三）仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1ml,2ml,10ml）、洗耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（250ml,500ml）、量筒（250ml,500ml,1000ml）、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲（针）、振荡培养箱、恒温箱、台秤等液氮保藏(-196℃)沙土管保藏(2-4℃)原斜面孢子中罐种子小罐种子摇瓶种子斜面孢子(代1)大罐发酵液提炼车间斜面培养恒温恒湿35-36℃，7天斜面培养恒温恒湿34-35℃，6天摇瓶培养33-34℃，39.5hr转速250rpm装量80ml/750ml接种量一块斜面/瓶50-64hr小罐种子培养36±0.5℃24-30h转速60-300rpm，搅拌功率5.5kw通气量2m3/min,罐压0.03Mpa中罐种子培养36±0.5℃，25hr转速60-240rpm接种量15%通气量1.5VVM罐压0.03Mpa搅拌功率22kw大罐发酵36±0.5℃，136hr转速60-130rpm接种量15%通气量0.75VVM罐压0.04Mpa搅拌功率115kw

工艺流程或一、生产菌种早期发现产链霉素的生产菌种是灰色链霉菌。后来又找到了产链霉素的其他类型链霉素族抗生素(如羟基链霉素或双氢链霉素)的菌种。如比基尼链霉菌、灰肉链霉菌等

。灰色链霉菌的孢子柄直而短，不呈螺旋形。孢子量很多，呈椭圆球形。气生菌丝和孢子都呈白色。单菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直径约为3～4mm。基内菌丝透明，在斜面背后产生淡棕色色素。链霉素产生菌诱变育种常用的诱变剂有：紫外线、7射线、氮芥、乙烯亚胺、亚硝酸和硫酸二乙酯等。一些化学诱变剂又经常和紫外线等进行复合处理。近年来采用亚硝基胍、快中子和激光等，诱变选育出营养缺陷型或再回复突变型高产菌株。杂交育种与诱变育种相结合的方法，对提高菌种的生产能力，收到了较好的效果。

(二)摇瓶种子培养 生产斜面的菌落接种到摇瓶培养基中，经过培养即得摇瓶种子。链霉素发酵经常使用：瓶种子来接种种子罐。种子质量以菌丝阶段、发酵单位、菌丝黏度或浓度、糖氮代谢、种子液色泽和无杂菌检查为指标。摇瓶种子(母瓶)可以直接接种子罐，也可以再扩大培养，用培养所得的子瓶接种。摇瓶种子检查合格后，贮存于冷藏库内备用，冷藏时间最多不超过7天。摇瓶培养基的成分为黄豆饼粉、葡萄糖、硫酸铵、碳酸钙等，其中黄豆饼粉的质量和葡萄糖的用量对种子质量都有影响。葡萄糖用量多少对菌种的氨氮代谢和菌丝黏度有影响。在配制摇瓶培养基时，应凋整好配比。(四)发酵培养（1）发酵培养基的配置

以发酵培养基配方为基础，按设定体积配置发酵培养基（先定容至15L），将除CaCO3和泡敌之外的物料加入罐中，加热至80-90糊化25min，降温至28用NaOH调节pH至7.0-7.2。在121灭菌，冷却后补入无菌水至20L左右。

(2)火焰保护接种在发酵罐接种口，将培养28小时-30小时的摇瓶种子一10%接种于发酵罐中。(3)培养将接种后的发酵罐于33恒温培养10天，转速为230转/分。(4)发酵样的测定全程需补入灭过菌的水来控体积。每天需取样测定pH、总糖、菌浓（湿重和干重）等指标，链霉素的分离提纯常用的提取方法活性炭吸附法溶剂溶媒萃取法复盐沉淀法离子树脂交换法链霉素的提取和精制发酵液粉针剂饱和树脂原液水针剂成品浓缩液精制液洗脱液过滤洗脱吸附脱色中和精制脱色浓缩无菌过滤无菌过滤干燥1．发酵液的过滤及预处理发酵终了时，所产生的链霉素，有一部分是与菌丝体相结合的。用酸、碱或盐作短时间处理以后，与菌丝体相结合的大部分链霉素就能释放出来。工业上，常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，以草酸效果较好，可用草酸将发酵液酸化至pH＝3左右，直接蒸汽加热(70－75℃)，维持2min(这样能使蛋白质凝固，提高过滤速度)，迅速冷却、过滤或离心分离。过滤后，所得酸性滤液也可进行碱性处理，进一步除去蛋白质，或者直接用NaOH凋pH值至6.7—7.2。原滤液的质量标准一般是：①外观澄明；②pH＝6.7—7.2；③温度在10℃以下；④高价离子含量很少；⑤链霉素浓度为5000U／ml左右。根据链霉素的稳定性、解离度和树脂的离解度，选择原滤液pH值为中性附近，即pH＝7左右，既可保证链霉素不受破坏，又能使链霉素和钠型羧基树脂全部解离，有利于离子交换。为防止链霉素破坏，温度应适当降低，维持在10℃左右 原液中高价离子(Ca2+，Mg2+)对离子交换吸附影响很大，因此必须在发酵液预处理时将这些离子除掉。草酸能将Ca2+去除掉。一些配合剂如三聚磷酸钠(Na5P3O10)，能和Mg2+形成络合物，减少树脂对Mg2+的吸附。三、精制(1)高交联度树脂精制高交联度的氢型磺酸树脂的结构紧密，金属小离子可以自由地扩散到孔隙度很小的树脂内部与阳离子交换，而有机大离子就难于扩散到树脂内部进行交换。

经过高交链度树脂交换后，交换液变酸，需经弱碱羟型树脂中和，就得精制液。其反应方程式如下。浓缩和活性炭脱色精制为了适应干燥的浓度要求，精制液尚需蒸发浓缩。在浓缩之前还要用活性炭处理，即将所得的精制液用硫酸或氢氧化钡调pH至4.3—5.0，并按精制液透光度的不同加人不同量的活性炭，进行常温脱色，得透光度在95％以上的滤液。由于链霉素是热敏感物质，受热易破坏，故宜于低温快速浓缩。控制在链霉素最稳定的pH4.0—4.5，进行真空薄膜蒸发浓缩，温度控制在35℃以下，浓缩液应达到350mg/mol左右。链霉素效价的测定效价测定的方法：（1）样品处理A．发酵液浸提处理：称取2g均匀后发酵液加丙酮浸提液9ml，超声40min，8000r/min离心5min，取上清备用。若效价较高，可用0.1mol/L，pH4.0的醋酸-醋酸钠缓