生化工程5-培养基课件

培养基成分氮源：构成菌体组分和含氮代谢物1）有机氮源：黄豆饼粉，玉米浆，花生饼粉，蛋白胨，酵母膏，鱼粉等。有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，有的还含有产物的前体，如缬氨酸可作为红霉素的前体。尿素也是常用的有机氮源，但成分单一，不具有其他有机氮源的特点。2）无机氮源：铵盐，硝酸盐和氨水等，微生物对无机氮源的利用非常快，所以也称为速效氮源，会导致分解代谢物阻遏。氨水是抗生素生产中常用的无机氮源，如合成1mol链霉素需要7mol的NH3，使用氨水要注意除菌。生理酸性物质和生理碱性物质硫酸铵：(NH4)2SO4

硝酸钠：NaNO3

可用于补充氮源并调节pH值。磷酸盐：磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。有利于糖代谢，可以促进菌体生长，但过量时会抑制产物合成。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。工业上常用K3PO4•3H2O、K3PO4和Na2HPO4•12H2O、NaH2PO4•2H2O等磷酸盐。镁：处于离子状态时，是许多重要的酶（己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂；影响基质的氧化，蛋白质的合成，能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌对自身产生的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、链霉素等。硫：对于蛋白质的活性和构成有重要作用。钠、钾、钙等与细胞渗透压和通透性有关，是许多酶的激活剂，促进糖代谢。铁：菌体有氧氧化的必须元素，铁制发酵罐可以提供。但青霉素产生菌对铁敏感，所以需对发酵罐预处理。

Zn、Co、Mn、Cu等元素大部分作为酶的辅基和激活剂；一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加。生长因子从广义来说，凡是微生物不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。其功能是构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。生长因子不是所有微生物都必需的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。有机氮源是生长因子的重要来源，如玉米浆中含有丰富的氨基酸，微量元素和生长素，是多数发酵产品的良好氮源前体

前体是指能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去的物质，其自身的结构并无太大变化，但产物的合成却能有较大提升，如玉米浆中的苯乙酸，能大幅提升青霉素G的产量，而加入苯氧乙酸作为前体则可以增加青霉素V的产量。很多前体对微生物的生长是有毒性的，所以添加的过程应少量多次添加。诱导剂，刺激剂，促进剂和抑制剂指一些并非菌体必须的，但能显著改变产物产量的物质，其机理是多种多样的表面活性剂——洗净剂（脂肪酰胺磺酸钠）、吐温80、植酸等二乙胺四乙酸大豆油抽提物黄血盐甲醇抗生素的抑制剂抗生素被抑制的产物抑制剂链霉素甘露糖链霉素甘露聚糖去甲基链霉素链霉素乙硫氨酸四环素金霉素溴化物、巯基苯并噻唑、硫脲嘧啶、硫脲去甲基金霉素金霉素磺胺化合物、乙硫氨酸头孢菌素C头孢菌素NL-蛋氨酸利福霉素B其他利福霉素巴比妥药物水水是培养基主要成分，也是生物体的主要成分，水是简单的，但也是十分重要的。培养基的配制原则根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，注意菌种的同化能力注意速效碳（氮）源和缓效碳（氮）源的配合使用，发挥各自的优势营养成分的恰当配比（C/N一般取100:0.2～2.0）4.渗透压，营养物质要有合适的浓度5.合适的pH值（注意生理酸性盐、生理碱性盐和缓冲剂的加入）6.考虑营养成分的加入顺序，避免生产沉淀7.原材料的来源，价格和稳定性等合适的碳氮比氮源过多，菌体繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，菌体繁殖量少，影响产量。碳源过多，容易形成较低的pH值；碳源不足，菌体衰老和自溶。C/N不当影响菌体按比例吸收营养物质，直接影响菌体生长和产物形成。培养基的优化理论转化率：加入的培养物质完全转化为产物时的转化率，事实上是做不到的.单因素实验双因素实验设计假设A因素有A1、A2两个条件，B因素有B1、B2两个条件。则全面衡量这2个因素的实验方案为：A1B1、A1B2、A2B1、A2B2

共需做4组实验3因素3水平的全面试验水平组合数为33=27，4因素3水平的全面试验水平组合数为34=81，5因素3水平的全面试验水平组合数为35=243，这在科学试验中是很难做到的。正交试验设计对于单因素或两因素试验，因其因素少，试验的设计、实施与分析都比较简单。但在实际工作中，常常需要同时考察3个或3个以上的试验因素，若进行全面试验，则试验的规模将很大，往往因试验条件的限制而难于实施。正交试验设计就是安排多因素试验、寻求最优水平组合的一种高效率试验设计方法。

正交试验设计的基本特点是：用部分试验来代替全面试验，通过对部分试验结果的分析，了解全面试验的情况。正因为正交试验是用部分试验来代替全面试验的，它不可能像全面试验那样对各因素效应、交互作用一一分析；当交互作用存在时，有可能出现交互作用的混杂。虽然正交试验设计有上述不足，但它能通过部分试验找到最优水平组合，因而很受实际工作者青睐。所谓均衡分散，是指用正交表挑选出来的各因素水平组合在全部水平组合中的分布是均匀的。

整齐可比是指每一个因素的各水平间具有可比性。因为正交表中每一因素的任一水平下都均衡地包含着另外因素的各个水平，当比较某因素不同水平时，其它因素的效应都彼此抵消。

在这9个水平组合中，A因素各水平下包括了B、C因素的3个水平，虽然搭配方式不同，但B、C皆处于同等地位，当比较A因素不同水平时，B因素不同水平的效应相互抵消，C因素不同水平的效应也相互抵消。所以A因素3个水平间具有综合可比性。同样，B、C因素3个水平间亦具有综合可比性。试验结果分析分清各因素及其交互作用的主次顺序，分清哪个是主要因素，哪个是次要因素；判断因素对试验指标影响的显著程度；找出试验因素的最优水平和试验范围内的最优组合，即试验因素各取什么水平时，试验指标最好；分析因素与试验指标之间的关系，即当因素变化时，试验指标是如何变化的。找出指标随因素变化的规律和趋势，为进一步试验指明方向；了解各因素之间的交互作用情况；试验号因素效率％ABCD1111102122217313332442123125223147623122873132183213189332142K141134689K287827146K361947254k113.74.315.329.7k229.027.323.715.3k320.331.324.018.0极差R15.327.08.714.3主次顺序B>A>D>C优水平A2B3C3D1优组合A2B3C3D1微生物培养基在不同阶段的作用根据实际试验生产的要求，培养基在不同的阶段有不同的侧重点。在菌体生长时期，要保证菌株能充分生长，而在产物合成阶段，培养基成分要宜于产物的形成，二者是有区别的。培养基的影响因素原材料的品质，来源和预处理培养基的设计与放大培养基的灭菌灭菌在工业微生物培养过程中，只允许生产菌存在和生长繁殖，不允许其它微生物共存，所有发酵过程，必须进行纯种培养。整个发酵过程必须牢固树立无菌观念，强调无菌操作。除了设备应严格按规定保证没有死角，没有构成染菌可能的因素外，必须对培养基和生产环境进行严格的灭菌和消毒，防止杂菌和噬菌体的污染灭菌与消毒灭菌：利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。消毒：用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽胞。消毒不一定能达到灭菌的要求，而灭菌则可达到消毒的目的。在发酵工业生产中，为了保证纯种培养，在生产菌种接种培养前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道等进行灭菌，还要对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。只有不受杂菌污染，发酵过程才能正常进行。灭菌的方法物理灭菌法化学灭菌法物理灭菌法高温灭菌致死温度：杀死微生物的最低温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间。一般无芽胞细菌，在60℃下经过10min即可全部杀死；芽胞细菌的芽胞在100℃下经过几分钟至数小时才能杀死；某些嗜热菌能在120℃下耐受20～30min。一般讲，灭菌的彻底与否以能否杀死芽胞细菌为标准。物理灭菌法干热灭菌法：微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用，氧化作用导致微生物死亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般160～170℃、1～1.5h。实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。湿热灭菌法（主要是高压蒸汽灭菌）：利用饱和蒸汽进行灭菌原理：借助蒸汽的高温和蒸汽释放的潜热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡从灭菌效果来看，由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热灭菌对耐热芽胞杆菌来说，温度升高10℃时，灭菌速度常数可增加8～10倍，对营养细胞更高。另外蒸汽冷凝为水时还要释放出潜热，因此温度可进一步提高蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠湿热灭菌法是目前最常用的灭菌方法，一般的湿热灭菌条件为121℃，30min在培养基灭菌的过程中，除微生物被杀死外，还伴随着营养成分的破坏，如糖液焦化变色、蛋白质变性、维生素失活、醛基和氨基反应、不饱和醛聚合、一些化合物发生水解等。因此，必须选择一个既能达到灭菌的目的，又能使培养基中营养成分破坏至最小的灭菌工艺条件。在热灭菌的过程中，同时发生微生物死亡和培养基成分破坏两个过程。温度能加速其过程进行的速度，当温度升高时，微生物死亡的速度更快，因此可以采用较高的温度，较短的灭菌时间，以减少培养基营养成分的破坏，这就是通常所说的“高温瞬时灭菌法”。灭菌温度较高而时间较短，要比温度较低时间较长效果好。对同样的培养基进行126～132℃、5～7min连续灭菌，其所得培养基质量要比采用120℃、30min的实罐灭菌好，可以得到较高的发酵水平；对某些培养基进行120℃、20min灭菌，所得培养基的发酵水平高于120℃、30min的对照，而同样达到灭菌的要求。不同灭菌条件下培养基营养成分破坏情况温度/℃灭菌时间/min营养成分破坏/%10040099.3110306711515501204271300.581400.0821500.01<1超高温瞬时杀菌的类型超高温瞬时杀菌可分为：1、间接式加热法2、直接混合式加热1、间接式加热法间接式加热法（板式、管式），是利用一定压力的水蒸气或热水作为加热介质，热量经过传热壁传递给物料2、直接混合式加热是指物料与高温高压蒸汽在一定的压力下混合，蒸汽遇冷，释放潜热将物料迅速加热至杀菌温度。可分为喷射式、混注式喷射式是将高压蒸汽直接喷入到物料中，蒸汽遇冷放热，将物料加热至所需要的温度；混注式是将物料喷入到充满蒸汽的加压容器中，加热至所需要的温度；喷射式和混注式直接加热系统直接混合加热的方式比间接式加热快的多，但同时会带来什么问题呢？如何解决呢？手提式实验室灭菌设备立式台式卧式影响加热灭菌的因素目标含菌量的影响pH值的影响：pH小于6时，氢离子易于进入胞内，所以pH越小，灭菌效果越好培养基形态的影响：固体培养基灭菌时间比液体要长。泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌十分不利。火焰灭菌法利用火焰直接杀死微生物，该方法简单彻底，但适用范围有限，多用于实验室小型金属器具。辐射灭菌利用电磁波、紫外线、X射线、γ射线或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌，以紫外线最常用。紫外线对芽胞和营养细胞都能起作用，但细菌芽胞和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养室等空间的灭菌，对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。250～270nm之间杀菌效率高，以波长在260nm左右灭菌效率最高。除紫外线外，X射线和γ射线也可进行灭菌。空气除菌好气性微生物的生长和合成代谢产物都需要消耗氧气。工业生产上均采用空气作为氧气来源。然而，空气中有各种各样的微生物，为保证纯种培养，必须将空气中的微生物除去或杀死。空气中的微生物空气中微生物的含量和种类随地区、高低、季节空气中尘埃多少和人们活动情况而异。一般寒冷的北方比暖和、潮湿的南方含菌量少；离地面愈高含菌量愈少；工业城市比农村含菌量多。空气中的微生物以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母、霉菌、放线菌和噬菌体。好气性发酵中需要大量无菌空气，但空气绝对无菌是很难做到的，也是不经济的，在发酵过程中不至于造成染菌而出现“倒罐”现象这就是通风发酵对无菌空气的要求。不同类型的发酵，由于菌种生长活力、繁殖速度、培养基成分和pH值及发酵产物等不同，对杂菌抑制的能力不同，因而对无菌空气的无菌程度要求也有所不同。在工程设计上，一般要求1000次使用周期中只允许有一个杂菌通过。.静电除菌法除尘效率一般在85~99%之间，它消耗能量小，每处理1000立方米的空气每小时只需电0.2~0.8kw。静电除尘是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除菌除尘的目的。悬浮于空气中的微生物、微生物孢子大多带有不同的电荷，但对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于气流对微粒的拖带力或微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被有效吸附而沉降，所以静电除菌对很小的微粒效率较低。空气热灭菌法它与培养基的加热灭菌相比，虽都是加热法把微生物杀死，但两者有区别的。空气在进入培养系统之前，一般均需用压缩机压缩，提高压力，所以，空气热灭菌时所需的温度，就不必用蒸汽或其他载热体加热，而可直接利用空气压缩时的温度升高来实现。空气经压缩后温度可升到200℃以上，保持一定时间后，便可实现干热杀菌。利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌的原理对制备大量无菌空气具有特别重要的意义。空气过滤除菌法①绝对过滤介质之间的孔隙小于被滤除的微生物，当空气流过介质层后，空气中的微生物被滤除。绝对过滤易于控制过滤后空气质量，操作简便。它采用很细小的纤维介质制成，介质空隙小于0.5um。②介质过滤介质过滤除菌是目前工业上用的较多的空气除菌方法，它是采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物，而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维等。化学灭菌某些化学药剂能与微生物发生反应而具有杀菌的作用。化学药剂适用于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等。化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。药剂杀菌原理使用浓度高锰酸钾使蛋白质、氨基酸氧化从而使微生物死亡。0.1～3％漂白粉次氯酸钠在水溶液中分解为新生态氧和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡。1～5%酒精溶液使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性。对营养细胞、病毒、霉菌孢子均有杀死作用。75％新洁而灭表面活性剂类洁净消毒剂，在水溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引起菌体外膜损伤和蛋白质变性。一般用于器具和生产环境的消毒，不能与合成洗涤剂合用。0.25％甲醛强还原剂，与氨基结合使蛋白质或酶变性。2份37％甲醛溶液＋1份KMnO4；37％甲醛溶液加热过氧乙酸强氧化剂，广谱、高效、速效，对营养细胞、细菌芽胞、真菌孢子和病毒都有杀灭作用。戊二酸在碱性条件下具有杀死芽胞的能力2％酚类如石炭酸（来苏尔）1～5％工业培养基及设备的灭菌方法分批灭菌：将培养基投入发酵罐中，经间接蒸汽预热之后，通入饱和高温蒸汽使设备和培养基一起灭菌。空罐灭菌连续灭菌：就是将培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。其温度一般以126～132℃为宜，总蒸汽压力要求达到4.4×104～4.9×104Pa以上。培养基采用连续灭菌时，需在培养基进入发酵罐前，直接用蒸汽进行空罐灭菌，用无菌空气保压，待灭菌培养基流入罐后，再开始冷却。冷杀菌技术冷杀菌包括超高压杀菌、辐射杀菌、高压脉冲电场杀菌、磁力杀菌、感应电子杀菌、超声波灭菌、脉冲强光杀菌等。杀菌过程中物料的温度并不升高或升高有限,既有利于保持功能成分的生理活性,又有利于保持产品的色、香、味及营养成分。冷杀菌技术可应用于酱菜、腐乳等非加热发酵食品的生产工艺中,也可以替代传统加热杀菌工艺,以改进传统生产中的灭菌操作工艺。高压杀菌技术

所谓高压杀菌是指在液体介质中，加100MPa～1

000MPa的压力作用一段时间后，如同加热一样，杀灭微生物的过程。超高压处理通常在室温或较低的温度下进行，在一定高压下蛋白质变性、淀粉糊化、酶失活，生命停止活动，细菌等微生物被杀死。高压杀菌对微生物的致死作用主要是通过破坏其细胞膜和细胞壁，使蛋白质凝固（蛋白质高级结构改变），抑制酶的活性和遗传物质的复制等实现的。高压的杀菌效果，一般而言，压力越高，效果越好。在相同压力下延长受压时间并不一定能提高灭菌效果。技术特点

:

1、不需加热

2、具有广谱杀菌作用

3、经处理后的食品,其风味和品质不受影响技术优势:

1、能在常温或较低温度下达到杀菌，灭酶的作用，减少了由于高热处理引起的营养成分损失或劣化

2、传压速度快，均匀，不存在压力梯度，不受样品的大小和形状的影响，使得超高压处理过程较为简单

3、耗能较少，处理过程中只需要在升压阶段以液压式高压泵加压。仅针对流体介质，对固体灭菌效果不佳高压脉冲电场杀菌技术HPEF(HighvoltagePulsedElectricFields)对微生物的致死作用是通过破坏细胞膜实现的。细胞膜是细胞与外界环境的天然屏障,并控制细胞的代谢功能。在外加电场作用下,细胞膜被破坏,胞内物质流失,进而导致细胞死亡。细胞膜电击穿图示安全无害传递均匀处理时间短能耗低影响因素场强的大小杀菌时间作用温度：在场强不变的情况下,温度上升,对象菌存活率下降介质的电导率，电阻和pH值灭菌的种类：相同HPEF条件下,杀菌致死率由高到低为酵母菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、霉菌生长周期：对数期微生物最敏感脉冲强光杀菌技术利用惰性气体灯发出波长由紫外光区至红外光区的光线照射物料,从而达到杀菌的目的。可将大多数微生物、滤过性病毒和孢子致死,是一种表面杀菌高新技术,可用作发酵原料表面灭菌操作工艺。脉冲强光杀菌技术是采用强烈白光闪照的方法进行灭菌，脉冲强光杀菌效果的主要影响因素：闪照次数菌液原始浓度输入电压微波杀菌技术微波是指频率从300MHz—300GMHz