生物化学 实验七 蛋白质含量的测定

实验七蛋白质含量的测定XiamenUniversity生物化学实验2016年03月31日厦门蛋白质概述定义蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I

等。蛋白质的含氮量比较恒定，平均为16%，因此可通过测定样品的含氮量进而推算蛋白质含量。蛋白质概述蛋白质是生物体最重要的生化物质之一。功能：

(1)催化：酶是蛋白质，决定了代谢的类型。

(2)激素：多肽激素，有调控作用

如胰岛素调节血糖浓度。

(3)载体：如血红蛋白，可运载O2和CO2；

无脊椎动物的血蓝蛋白功能一样；

在6000m高山上发现有蓝血人；

(4)运动：肌肉中的肌球肌动蛋白，伸缩功能。

(5)免疫：引起免疫的抗体是蛋白质，称免疫球蛋白。蛋白质概述

(6)光合作用：叶绿体蛋白。

(7)保护作用：毛发、肌腱、韧带、软骨等。

(8)凝血作用：凝血蛋白。(9)通透作用：生物膜，表皮内在蛋白。(10)毒素作用：肉毒毒素等。(11)遗传讯息调控：受体蛋白、视觉蛋白、味觉蛋白。(12)精神蛋白：预测(13)重要的能量来源关于氮-pro换算系数对于氮含量换算成pro含量的系数，历来采用6.25，这个数值是以pro平均含氮而导出的数值。一般手册上列出了一部分换算系数，用时可查，蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麦=5.83，玉米=6.25，小麦=5.83，麸皮=6.31，面粉=5.70，如果手册上查不到的样品则可用6.25，一般在写报告时要注明采用的换算系数以何物代替。一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。

蛋白质的测定方法分两大类：具体测定方法：凯氏定氮法:最常用的，国内外应用普遍。双缩脲反应染料结合反应酚试剂法国外：红外分析仪凯氏定氮常量法、半微量法和微量法微量凯氏定氮法被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。蛋白质含氮量通常在16%左右，将凯氏定氮法测得的含氮量乘上蛋白质换算系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。消化CO2+SO2+H2O+NH3

↑+浓H2SO4NNH3+H2SO4(NH4)2SO4蒸馏H2O+Na2SO4+NH3↑(NH4)2SO4+NaOH吸收NH3+H3BO3NH4HB4O7+H2O滴定NH4HB4O7+HCl+H2ONH4Cl+H3BO3消化炉蒸馏单元及电位滴定仪原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围为1-10mg双缩脲法540nmFolin-酚试剂法(Lowry法)Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸-磷钨酸试剂)，蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高(20-250g)、较紫外吸收法灵敏10-20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。紫外分光光度法由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。总蛋白定量分析－BCA(Bicinchoninicacid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉)准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20-2000g/mL；MicroBCA试剂测定范围是0.5-20g/mL快速：45min内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝

基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高10－100g(比Lowry法灵敏4倍)。

CoomassieDye-Based蛋白质定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+蛋白质含量的测定紫外吸收法双缩脲法Folin-酚法考马斯亮蓝法检测波长280nm540nm650nm595nm检测范围0.1-1.0mg1-10mg25-250µg10-100µg繁琐程度简便较简便较简便较简便应用纯度高样品快速但不十分精确受多种因素干扰干扰较少实验目的要求学习和掌握使用奈氏试剂来测定生物材料中蛋白质含量的原理和操作技术。基本原理

含氨有机物在适当催化剂作用下，与浓硫酸共热而被分离(消化)后，而含碳化物氧化成二氧化碳逸散，其中的氮全部以氨的形式游离出来与硫酸结合成不挥发的硫酸铵而存在于消化液中，硫酸铵与氨氧化钠作用，产生氢氧化铵和硫酸钠，在有氢氧化钠存在的情况下，氢氧化铵与奈氏试剂(Nesslersreagent，含HgI2和KI)作用产生碘化二汞铵溶液。含氮样品+H2SO4

(NH4)2SO4+CO2+SO2+H2O (1) (NH4)2SO4+2NaOH==Na2SO4+2NH4OH (2)

HgNH4OH+2(HgI2·2KI)+3NaOH O NH2I+4KI+3NaI+3H2O (3)Hg(中间化合物)

此中间化合物很不稳定，易分解成碘化二汞铵：

Hg ONH2I Hg2NI+H2OHg(中间化合物)因此可将反应式合并，写成：

NH4OH+2(HgI2·2KI)+3NaOH Hg2NI+4KI+3NaI+4H2O碘化二汞铵溶液呈黄色，可用752型分光光度计490nm波长测定。催化剂加热仪器及试剂仪器：

30ml微量凯式烧瓶6支；玻璃研钵1副；50ml量瓶1个；10ml离心管2支；10ml试管10支；电炉1台；吸管数支；移液管数支；752型分光光度计(公用)试剂：浓H2SO4(分析纯)、20%三氯醋酸、H2O2、2N氢氧化钠溶液、奈氏试剂、标准硫酸铵溶液实验步骤1)准确称取鱼肉3.0g，剪碎，至研钵中研磨成匀浆，用蒸馏水反复多次冲洗研钵，其液体注入50ml量瓶并稀释至刻度，为匀浆液。2)取1支10ml离心管，加1ml匀浆液和1ml20%三氯醋酸，搅拌，离心3min，上清液用作测定非蛋白质氮。3)取2支消化管，注明号码，按下表分别加入样品和试剂：项目号码样品(ml)H2SO4(ml)总蛋测定1匀浆液1ml1非蛋白氮测定2上清液与上清液等体积4)将消化管置于消化架上，使管颈与架成30°倾斜，在通风橱内进行消化，消化过程应常转动消化管，待白色烟雾消失后，加入2-3滴H2O2，消化至溶液透明(约2-3h)即可。

注意：加H2O2是必须停火，冷却，然后H2O2由管壁缓缓滴入瓶内以防烧瓶破裂。5)消化液分别倒入2支10ml有刻度离心管(或试管)中，用少量蒸馏水多次洗涤烧瓶，溶液分别倒回离心管(或试管)中，用少量蒸馏水多次洗涤烧瓶，溶液分别倒回离心管(或试管)中，并稀释至刻度，即得待测液。6)取8支10ml试管，表一进行操作表一

编号试剂(ml)样品测定标准曲线制作总蛋白(1)非蛋白(2)345678硫酸铵0000.51234消化液1.51.5000000奈氏试剂222222222NNaOH1.51.51.51.51.51.51.51.5H2O556.565.54.53.52.5OD注意事项开始加热消化时如果火力过猛，则会使样品焦化太快，而消化不完全，也可能因焦化太快，浓烟升腾而使氮化物逸失，一般消化温度低于400℃

。消化时可加入少量的硫酸钾，其能够提高硫酸的沸点(290℃)到400℃

，以促进有机含氮物分解完全。结果计算生物组织中的氮大部分以蛋白质形式存在，而且大多数蛋白质的含氮量相当接近，每