乙肝表面抗原及乙肝两对半检测1课件

乙肝表面抗原及乙肝两对半检测主要内容检测方法及原理胶体金免疫层析法

酶免疫技术免疫定量分析法结果判断及临床意义注意事项检测的方法及原理检测方法及原理胶体金免疫层析法Part2酶免疫技术

以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原抗体的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。酶结合物既保留抗体（或抗原）的免疫学活性，又保留酶对底物的催化活性。特点：灵敏度高、特异性强、准确性好、试剂稳定、方法简便易行检测方法及原理Part2两对半ELISA检测原理

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。检测方法及原理Part2两对半ELISA检测原理

1

HBsAg：双抗体夹心法——正比

单克隆HBsAb－HBsAg－多克隆HBsAb－HRP

2

HBsAb：双抗原夹心法

——正比

HBsAg－HBsAb－HBsAg－HRP检测原理Part2两对半ELISA检测原理3HBeAg：双抗体夹心法

——正比

单克隆HBeAb－HBeAg－多克隆HBeAb－HRP4HBeAb：竞争抑制法

——反比

多克隆HBeAb－HBeAg－HBeAb－HRP/HBeAb（标本）5HBcAb：竞争抑制法

——反比

HBcAg－HBcAb－HRP/HBcAb（标本）检测方法及原理Part3免疫定量分析方法

要想完成HBsAg定量检测，必须满足以下条件：①采用自动分析系统，②有可溯源的标准品，③测定结果与标准品之间有线性关系。检测方法及原理Part3免疫定量分析方法

原理：化学发光免疫分析仪是通过检测患者血清从而对人体进行免疫分析的医学检验仪器。将定量的患者血清和辣根过氧化物（HRP）加入到固相包被有抗体的白色不透明微孔板中，血清中的待测分子与辣根过氧化物酶的结合物和固相载体上的抗体特异性结合。分离洗涤未反应的游离成分。然后，加入鲁米诺Luminol发光底液，利用化学反应释放的自由能激发中间体，从基态回到激发态，能量以光子的形式释放。此时，将微孔板置入分析仪内，通过仪器内部的三维传动系统，依次由光子计数器读出各孔的光子数。样品中的待测分子浓度根据标准品建立的数学模型进行定量分析。最后，打印数据报告，以辅助临床诊断。结果判断及临床意义一、结果判断结果判断Part1胶体金免疫层析法结果判断

以艾康生物检测试剂盒为例：阳性（+）：两条红色条带出现，一条位于测试区（T）内，另一条位于质控区（C）。阳性结果表明：标本中含有待测物质。阴性（-）：仅质控区（C）出现一条红色条带，在测试区（T）内无红色条带出现。阴性结果表明：标本中检测不出待测物质。无效：质控区（C）未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试纸条已变质损坏。在任何情况下，应重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。注意：测试区（T）内的红色条带可显现出颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，即使只有非常弱的色带也应判为阳性结果。结果判断Part1胶体金免疫层析法结果判断阳性（+）：仅质控区（C）出现一条红色条带，在测试区（T）内无红色条带出现。阳性结果表明：标本中含有待测抗体。弱阳性（+）：质控区（C）出现一条红色条带，在测试区（T）内有非常弱的红色条带出现。弱阳性结果表明：标本中含有少量待测抗体。阴性（-）：两条红色条带出现，一条位于测试区（T）内，另一条位于质控区（C）。阴性结果表明：标本中检测不出待测抗体。无效：质控区（C）未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试纸条已变质损坏。在任何情况下，应重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。结果判断Part2酶免疫技术

以上海科华试剂盒为例：1HBsAg：COV=阴性对照平均OD值+0.1样本OD值/COV值≥1.0为阳性样本OD值/COV值＜1.0为阴性2HBsAb、HBeAg：COV=阴性对照平均OD值×2.1（OD＜0.05按0.05计算）当样本OD值≥COV值为阳性当样本OD值＜COV值为阴性结果判断Part2酶免疫技术

3

HBeAb：COV＝（阴性对照平均OD值＋阳性对照平均OD值）×0.5

标本OD值≥COV为阴性，＜COV为阳性4HBcAb：原倍血清COV＝阴性对照平均OD值×0.31:30稀释血清COV＝阴性对照平均OD值×0.5

标本OD值≥COV为阴性，＜COV为阳性临床意义

临床意义

临床意义

聚乙二醇干扰素（PegIFN）α-2a治疗乙肝患者的研究结果显示，治疗12周时HBsAg定量<1500IU/ml的患者（约占治疗人群的32%），治疗结束停药1年时HBeAg血清转换率可高达51%（66/129例），治疗12周时HBsAg定量处于1500~20000IU/ml的患者（约占治疗人群的52%），停药1年时的HBeAg血清转换率也能达到32%（53/166例），与之相反，如果治疗12周后患者的HBsAg定量仍>20000IU/ml（约占治疗人群的16%）,则治疗结束停药1年时的HBeAg血清转换率仅为19%（8/43例）。

临床意义

此外，研究还发现，患者治疗后HBsAg下降速度和幅度还与其长期清除率有关。在治疗24周HBsAg<1500IU/ml且同时出现HBeAg血清转换的患者中，有20%可获得HBsAg清除。因此，HBsAg定量可以用于指导治疗。而且，治疗结束时HBsAg水平越低，停药后随访的HBsAg清除率越高。临床意义检测模式分析Part4检测结果模式分析HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAbPreS1AgPreS1Ab简要意义乙肝表面抗原乙肝表面抗体乙肝E抗原乙肝E抗体乙肝核心抗体乙肝前S1抗原乙肝前S1抗体HBsAg阳性提示乙肝携带；HBeAg、pre-S1Ag、阳性提示病毒复制,传染性强；HBsAb、HBeAb阳性提示机体具备免疫力，趋于恢复，pre-S1Ab阳性提示肝细胞有阻断乙肝病毒感染的功能。-------没有乙肝病毒感染，不具备免疫力。-+-----接种疫苗，乙肝恢复，具备免疫力。------+急性乙肝恢复或接种进口疫苗，具备免疫力。-+----+接种疫苗或少量乙肝病毒感染后恢复，免疫力强。+------表面抗原携带；急性乙肝病毒感染潜伏期后期。+-+--+-急性乙肝早期，病毒复制，有传染性。+-+-++-急慢性乙肝，病毒复制，有传染性（即大三阳）。+-+-+-+急慢性乙肝，恢复期或治疗有效，有传染性。+---+--急慢性乙肝，传染性弱或没有传染性。临床意义HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAbPreS1AgPreS1Ab简要意义乙肝表面抗原乙肝表面抗体乙肝E抗原乙肝E抗体乙肝核心抗体乙肝前S1抗原乙肝前S1抗体HBsAg阳性提示乙肝携带；HBeAg、pre-S1Ag、阳性提示病毒复制,传染性强；HBsAb、HBeAb阳性提示机体具备免疫力，趋于恢复，pre-S1Ab阳性提示肝细胞有阻断乙肝病毒感染的功能。+---++-急慢性乙肝，病毒复制有传染性，乙肝E抗原变异。+--++--急慢性乙肝，没有传染性或传染性弱（即小三阳）。+--++-+急慢性乙肝或乙肝治疗后恢复期，传染性弱。+--+++-急慢性乙肝，病毒复制有传染性，乙肝E抗原变异。----+--乙肝核心抗隐性携带，有乙肝既往有感染史。---++--急性乙肝恢复期或既往有感染史。-+-++-+乙肝恢复期或急性乙肝既往有轻度乙肝病毒感染史。+--+---慢乙肝病毒感染携带，传染性弱或没有传染性。+-++++-急性乙肝趋于恢复，乙肝携带，病毒复制有传染性。-----+-提示乙肝病毒早期感染，有传染性，建意检测HBV-DNA。临床意义

一、何谓PreS1Ag？

PreS1Ag是乙型肝炎病毒基因组前S1区编码的前蛋白，具有很强的免疫原性，是病毒表面抗原(HBsAg)的组成成分。它只存在于具有传染性的完整的乙肝病毒颗粒上，是黏附和侵袭人体肝细胞的主要因子。

临床意义

2.PreS1Ag检测能够加强HBV—DNA检测的作用

①因病毒基因变异的影响，个别病毒变异株感染的患者HBV—DNA检测为阴性，PreS1Ag的检测可以防止漏检，并提示可能存在病毒变异迹象。

②PreS1Ag是免疫测定技术，具有快速、直接、简便的特点。PreS1Ag的检测与HBV—DNA检测在乙肝的诊断方面相互补充和加强，就像HBV—DNA不能替代乙肝五项的检测一样，同样HBV—DNA不能替代PreS1Ag的检测。临床意义

三、何谓PreS1Ab？

是HBV的中和抗体，能阻止HBV侵入肝细胞，抗-PreS1Ab在急性期和恢复早期出现，预示病毒正在或已被清除，疾病预后良好。乙型肝炎病毒前S1抗体可作为急性乙型肝炎临床预后早期诊断的血清学指标。临床意义

四、PreS1Ab意义：

1．前S1抗体是急性HBV感染最早期出现的抗体比HBsAb和抗HBcIgM出现早，起到了临床预后早期诊断的作用。前S1抗体出现提示预后良好。前S1抗体参与病毒的清除，前S1抗原/抗体的反转预示疾病将进入恢复期，急性乙型肝炎患者前S1抗原阴转越早，前S1抗体阳转越早预后越好。

2．对慢性乙型肝炎患者长期动态、随访出现血清前S1抗体阳性者，HBVDNA阴转率显著增高或HBVDNA含量显著下降，预示疾病恢复良好。

3．乙型肝炎病毒前S1抗体可作为临床抗病毒疗效疾病预后的血清学指标。

4．总之，乙型肝炎患者前S1抗体出现与否，与病程的进展以及预后有较密切的关联。前S1抗体的检测对乙肝的诊断及治疗有较为重要的临床意义。三、注意事项注意事项

1标本采集与处理的影响标本收集后应尽快分离出血清或血浆以避免溶血。检测时应尽量使用新鲜的标本。标本若不能及时送检，可在2℃-8℃冷藏3天。长期保存需冷冻于-20℃，忌反复冻融。标本严重溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性。标本凝固不全，正常血液采集后1/2-2h开始凝固，18-24h血块完全收缩。在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。注意事项

2试剂影响因各厂家对检测标本要求、操作步骤不同，故认真阅读检测试剂说明书能避免不必要的实验误差（特别是胶体金免疫法）。不同厂家生产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%-99.3%、78-89%,存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异。注意事项

3干扰物质的影响大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性，采用56℃30分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体