第11章 体外试验与新生物技术在毒理学中的应用

第11章体外试验与新生物技术在毒理学中的应用第11章体外试验与新生物技术在毒理学中的应用第11章体外试验与新生物技术在毒理学中的应用V:1.0精细整理，仅供参考第11章体外试验与新生物技术在毒理学中的应用日期：20xx年X月第八章毒理学评价的分子生物学方法分子毒理学固然应主要着眼于生物大分子，但也应当看到这些大分子是存在于细胞膜上、细胞器内，乃至细胞间隙液中的。它们与细胞是不可分离的。因此，对亚细胞组分的研究也是毒理学分子生物学评价的重要组成部分。第一节亚细胞组分的制备现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体及线粒体。现就细胞膜、微粒体及线粒体的制备方法加以介绍。一、细胞膜的制备细胞膜指细胞外层质膜，厚度约6～10nm。它将细胞与外环境分隔，且参与细胞的生命活动，细胞内各种细胞器也是由质膜分隔，称为细胞器膜，两者统称为生物膜。它是常用的研究模型，用以从细胞和亚细胞水平研究外源化合物的中毒机制。1．肝细胞膜的制备其基本原理是：首先，将肝组织在含有钙离子的低渗碳酸氢钠缓冲液中温和匀浆，使细胞膜保持较大的膜片；其次，应用低速离心使细胞膜片与细胞核一起从匀浆中分离，再利用细胞膜与细胞核之间的密度差异，用密度梯度离心将细胞膜从低速离心获得的粗核部分中分离出来。2．红细胞膜的制备哺乳动物红细胞不含任何细胞器，故其红细胞膜是较纯净的细胞膜。(1)红细胞血影膜常用的制备方法是在低渗条件下，红细胞膨胀，由双面盘状变成近乎球形，随后细胞内容物因胞膜破裂而释放，20000g离心。洗涤去除血红蛋白，即获红细胞膜。此种膜最接近整体系统，仍保留着原有膜的生物化学和生物物理学等特性，毒理学试验常用简易模型研究外源化合物对细胞膜离子转运及相关酶类、膜脂流动性和细胞骨架结构等方面的影响，并探讨其可能的机制。但它不能控制细胞质内的环境，在应用上有一定的局限性。此外，低渗制备的红细胞膜虽然去除了细胞内质，但膜的封闭性差，有许多泄漏的空穴。(2)再封血影近年发现，在一定条件下，胀破了的红细胞可以重新封闭，对K’等离子不通透，给研究红细胞膜提供了另一模式。其制备的方法有：①向低渗胀破的红细胞加入浓盐溶液，成为等渗溶液，置于37℃②将低渗胀破的红细胞在0℃条件下，过Bio—gelA柱，柱上部的1／3pH为7．6，以利膜与血红蛋白分离，其下的2／3pH为6．0，有利于随后红细胞空泡的重新封闭，当膜从柱上流出后再用一定浓度的Kcl调节为等渗液，在37(3)封闭的红细胞膜囊泡有时为了深入研究，需要将膜的内、外层翻过来。红细胞溶血后，在不含一价离子的碱性低离子强度介质中，膜能自发地凹陷(无Mg“存在)或外凸(有Mg“存在)，形成小囊泡，通过实验可制备封闭的红胞膜囊泡。其特点是不受胞浆内容物的干扰，可采用匀浆，等密度梯度离心或屏障分离等技术制备胞浆面在外的翻转泡(其内、外层正好与血影膜相反)或胞浆面仍在内的正转泡(即与红细胞膜内外侧相同的囊泡)。3．脂质体的制备脂质体是双层脂质包围一些水溶液的小滴，呈球形。它是最常用的人工膜之一，是较为理想的生物膜模拟系统。大脂质体制备可将适量的磷脂溶于氯仿等有机溶剂，置于旋转蒸发仪上蒸发至干，使玻璃壁上附有一层极薄的磷脂膜，然后加水溶液，并振摇，即可形成多层大脂质体。用超声波法和微量注射法、去垢剂法可获得单层脂质体。4．突触体膜的制备制备突触体膜的基本原理是将脑组织在预冷的蔗糖溶液中进行匀浆，再利用脑突触体膜的蛋白质与脂的比例、电荷性质、颗粒大小、形状等不同于其他的细胞器膜进行蔗糖密度梯度离心，将其分离出来。二、微粒体的制备微粒体是内质网在细胞匀浆过程中形成的碎片，并非独立的细胞器。由于微粒体含有代谢外源化合物的混合功能氧化酶，在毒理学研究中有着重要地位，是较常见的试验模型。制备肝微粒体的方法有超速离心法、钙沉淀法、凝胶过滤法及等电点沉淀法。基本步骤为：将肝组织匀浆后，2500g离心；弃去沉淀(主要是细胞核及碎片)，取上清液9000g离心；弃去沉淀(主要是线粒体)，取上清液，100000g离心，得到的沉淀即为线粒体，上清液为胞浆。所得微粒体用缓冲液悬浮后，贮存在一20～一70℃除超速离心法制备微粒体外，用凝胶过滤、钙沉淀法和等电点沉淀法也可以制得微粒体。三、线粒体的制备1．肝脏线粒体的制备所有操作应在低温条件下进行。全部器械如匀浆器、烧杯、离心管等，以及缓冲液应放4℃冰箱内预冷。亚线粒体颗粒是指经特殊处理，除去线粒体外膜和基质部分后形成的小囊泡。它含有氧化磷酸化过程所有的酶类，是观察呼吸链氧化反应、ATP酶活性及其他一些特殊反应的模型。亚线粒体颗粒制备的原理是利用超声波作用，破坏线粒体外膜，再经超速离心获得仅有内膜的亚线粒体颗粒。在超声处理过程中应注意保持线粒体制备物温度，不要升高，维持在4℃第二节核酸的提取与制备核酸的提取是分子生物学中很重要的基本实验技术，也是其他分子生物学分析方法的前提条件。核酸样品的提取质量将直接关系到有关分析检测的成败。分离纯化核酸总的原则是应保证核酸一级结构的完整性及排除其他分子的污染。为了保证孩酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之内。核酸的一级结构还决定着其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。经纯化的核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度，此外还要排除其他核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然。为了保证分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中应注意：①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在DH4～10的条件下进行。③减少物理因素对核酸的降解。物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液震荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式的破裂以及DNA样品的反复冻贮。机械剪切作用的主要危害对象是对分子质量大的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。对分子质量小的环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些。高温，如长时间的煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中，常规操作温度为0～4℃，此温度环境可降低核④防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破环核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价离子Mg“，ca“的激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、吸易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害习素。总的来说，核酸提取的主要步骤就是破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。一、DNA的提取与制备从细胞中提取DNA要用尽可能温和的细胞破碎法，以免DNA被机械破碎。操作时还需要有EDTA的存在，以螯合镁离子，镁离子是DNA酶降解DNA所必需的。如果有细胞壁，要用酶进行消除，如用溶菌酶处理细菌，对于细胞膜要用去污剂溶解。对于不同来源的细胞、组织应使用不同的裂解液，如果必须使用物理破碎，一定要尽可能地轻缓。细胞破碎以及其后的操作都要在4cIC条件下进行，所用的玻璃器皿和溶液都要经过高压灭菌以破坏DNA酶。上述方法只适用于细胞总DNA的提取。不同来源的样品，处理时有不同的注意事项。对于新鲜动物组织脏器等提取材料，由于含有较丰富的DNA酶，应迅速冷冻保存备用，以减少DNA的降解；石蜡包埋组织块中DNA应先进行脱蜡处理；培养细胞裂解之前应用相应的缓冲液进行洗涤；质粒DNA提取之前先要经过细菌培养，获得对数生长后期的细胞后进行离心集菌收集，再通过碱性裂解法、去污剂法或煮沸法等进行提取，纯化过程也可使用酚／氯仿萃取法，对于小分子DNA(小于10kb)，可用涡旋混合器以保证溶液中有机相与水相混合均匀，当纯化DNA分子介于10～30kb时，应轻微振荡，避免DNA被机械剪切，小于30kh的DNA分子纯化时应更小心。二、RNA提取与制备RNA提取技术与上述DNA提取技术相似。由于RNA分子相对较短，不易被剪切力损伤，因此细胞破碎可以用较强有力的方法。RNA对RNA酶敏感，而RNA酶在自然界广泛存在，不仅各种细胞内都有RNA酶，操作者的手指上也有RNA酶，因此操作者必须带手套，并且提取液中要有较强的去污剂存在，以便快速灭活RNA酶。接下来的去蛋白操作须特别强有力，因为RNA常常和蛋白质紧密结合在一起。用DNA酶去除DNA，用乙醇沉淀RNA。RNA提取要用硫氰酸胍．它既是较强的RNA酶抑制剂，又是蛋白变性剂。制备RNA时所用物品应完全无RNA酶。第三节基因突变分析与PCR检测一、基因突变分析基因突变(genemutation)包括碱基置换、移码突变和片段突变(参见第五章第二节)。基因突变是分子水平的变化，在光学显微镜下无法看见，一般是以表型(如生长、生化、形态等)的改乏为基础进行检测的，也可通过DNA测序、DNA单链构象多态分析(sscP)、基因差异分析及基因芯片检测等分子生物学方法检测DNA序列的改变来确定。1．PCR—SSCP技术聚合酶链反应——单链构象多态性分析在能够检测单个碱基变化的技术中，单链构象多态性分析因其简单而有效已成为最常用的技术。(1)PCR—SSCP的基本原理PCR～SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳。此时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链的碱基顺序决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链，其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。靶DNA中如含单碱基置换或数个碱基插入、缺失等改变时因迁移率变化会出现泳动变位(mobilityshift)，从而可将发生突变的DNA与正常DNA区分开。经典的PCR—SSCP技术采用放射性同位素标记引物或核苷，再通过放射性自显影显示结果。但由于放射性同位素的污染及半衰期的问题，限制其推广应用。现已发展多种PCR—SSCP技术，各有其优势及适用领域。例如，使用荧光素代替核素进行标记，也可以在电泳后用银染(银染显示法也称冷sscp)。银染法利用对单链DNA亲和力较强的特点，大大提高了分辨率剂检测的敏感性，且技术操作简单、可重复性好，单链带型清晰，带与带之问易于识别，既避免了污染，又提高了灵敏性。此外，使用RNA分子来做SSCP会提高其灵敏度，尤其是对大于200．b．p的片段检测更显优势。RNA分子形成的构象稳定、种类多，对单碱基置换等改变敏感，RNA的sscP分析可检出多条单链带，提高基因变异检出率，是PCR—SSCP技术又一发展方向。（2）PCR—SSCP的优缺点PcR—sscP优点包括：技术原理明确，操作简单，不需特殊仪器，技术容易掌握；实验步骤少、速度快、周期短；检测灵敏度高，一般无假阳性结果；可运用于大样本筛查；可有效检测单碱基置换和多碱基插入、缺失等基因突变类型。但PCR—SSCP也存在一些不足之处：1）、该方法最突出的问题是不能检测出所有的突变，由各实验室报道的突变检出率从35％一99％不等，且分析片段太小，可能呈假阴性结果。由于随DNA片段大小的增加迁移率的改变明显减少，故该方法只适用于检测150～200bp的DNA片段。一般来说，小于200bp片段的检出率可达90％，而大至400bp的片段，其检出率只有70％80％，片段越小，检出率越高。2）、SSCP分析影响因素较多。凝胶浓度和交联度、电泳温度、凝胶中甘油的浓度、电泳缓冲液的离子强度等均可通过影响DNA单链构象从而影响DNA单链的电泳迁移率，一种PcR产物单链的良好的电泳条件需要反复试验摸索。3）、PCR-SSCP分析只能发现是否有突变或碱基序列组成方面的变化，并不能了解DNA序列变化的性质及位点。解决问题的方法是将已知有改变的样本的PCR产物进行DNA序列分析．即PCR、SSCP、DNA测序三种方法的联用(PCR—SSCP—DNA—Sequencing技术)。2．DNA测序基因突变检测的“金标准”是直接进行DNA测序，一些基因突变筛选方法得出的结论往往还需DNA测序来证实。经典的DNA测序就其原理来说主要分为化学降解法和Sanger双脱氧链终止法。在此基础上又发展了一些基于非放射物质标记和自动化测序的方法，近年来还发展了一些全新的DNA测序方法，如毛细管凝胶电泳法、阵列毛细管凝胶电泳法、超薄层凝胶板电泳法等以及不用电泳分离直接测序技术，如杂交法、质谱法、原子探针法、流动式单分子荧光检测法等。(1)化学降解法1977年．Ma。am和Gilb。rt报道了通过化学降解测定DNA序列的方法，即化学降解法(chem‘．。lcl。a。。gem。thod，也叫M．dxam—Gilbert法)。它的原理是用一些特殊的化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，分别作用于DNA序列中4种不同的碱基，使其在核苷酸序列中形成的糖苷键连接变弱，易从DNA链上脱落下来。丢失了碱基的核苷酸链再经适当处理，就可在缺失碱基处断裂。在进行这些反应时，将反应条件控制在每条DNA链断开一处，因此经过处理可产生一系列长短不等的DNA片段。根据所用的试剂不同，其末端分别为G，A，C，T，再对一系列这样的片段进行电泳及放射自显影，综合分析，就可测得DNA分子中的核苷酸排列顺序。(2)酶促双脱氧链终止法酶促双脱氧链终止法又叫Sanger法或链终止法(chainterminationmethod)。由于这种方法要求使用一种单链DNA模板和一种合适的DNA合成引物，因此有时也叫引物合成法或酶催引物合成法。其基本原理是利用了DNA聚合酶所具有的两种酶催反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA为模板，合成出准确的DNA互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2'3’一双脱氧核苷三磷酸作底物，使之参与到寡核苷酸链的3’一末端，从而终止DNA链的生长。在同一反应管中加入链终止剂2’，3’一双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)中的某一种，以及引物、模板、dNTPs。ddNTP能随机掺人合成的DNA链，一旦掺入，DNA合成即终止，于是各种不同大小的片段起始端相同，(3)自动化测序法Sanger双脱氧链终止法和Maxam—Gilbert化学修饰法在DNA测序原理上是公认的两大成就．但两者也都存在着一些共同的问题有待解决。例如，这两种方法都需要使用放射性核素作为标记物，尽管灵敏度很高，但存在辐射危害，而且放射性材料在保藏、处理和运输方面也是相当麻烦的。再如，这两种DNA序列分析法都存在着操作步骤繁琐、效率低、速度慢等缺点(特别是在结果的判断环节中)。自DNA序列分析技术问世不久，为适应大规模测序的需要，许多科学家开始致力于DNA分析自动化方面的研究。自动测序仪的原理沿用Sanger等建立的双脱氧链终止法．DNA聚合酶催化延伸反应产生的DNA片段仍需通过序列胶电泳分离，采用荧光标记取代放射性标记，通过激光激发荧光，并与电子计算机程序的自动化技术相结合，达到自动检测碱基的目的。而在荧光染料标记方式上，美国应用生物系统公司ABI公司(appliedbiosystem)的自动DNA序列测定仪采用4种荧光基团标记，而欧洲分子生物学实验室(EMBL)与瑞典Pharmacia—ILKB公司联手推出的全自动激光序列分析仪(A．L．F．，automatedlaserfluorescentsequencer)则采用了单种荧光素标记。使用DNA自动测序仪，熟练的操作者一天可以测1000个以上的碱基，而其他测序方法一般1人1年只能测50000个碱基。这种方法因采用电子计算机控制，自动化操作，大大缩短了测定时间，而且结果准确可靠，是目前最优越的测序方法。(4)DNA测序的新方法分子生物学技术的发展日新月异，除了上述DNA测序方法，近年来又发展了一些全新的DNA测序方法。①以凝胶电泳为基础的测序方法在传统聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上又发展了毛细管电泳激光荧光法、超薄层板电泳激光荧光法等技术。毛细管凝胶电泳比传统凝胶电泳分离速度提高了25倍，但1只毛细管只能分离1个样品，因此分析效率并未提高。阵列毛细管电泳新方法的出现提高了分析效率。1992年，美国科学家采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1．5h内可读出350bp，DNA序列分析效率可达到6000bp／h。1994年，日本科学家提出的另一种测序装置，20只毛细管并列电泳，采用激光荧光电荷耦合阵列检测器(ccD)检测，有较高的灵敏度。采用ccD检测器，100只毛细管阵列电泳装置，可同时检测100只毛细管的DNA分离样品。使用超薄层凝胶板电泳进行测序，凝胶板厚度仅为50～100斗m，配备流水冷却装置，场强提高到250V／cm，大幅度地提高了电泳速率。而一般的电泳胶厚度为200～400肛m，电场强度较低(75v／cm)，限制了测序的速度。在此基础上如采用激光荧光ccD检测器检测，则可比常规电泳测序速度提高9倍，达到8000bp／h以上。②不用电泳分离的测序新方法DNA测序方法研究的一个热点是不用电泳分离的技术。这一类尝试主要包括：⑧杂交法(sequencingbyhybridization，SBH)，这是有希望用于快速DNA测序分析的一种新技术。它应用一套已知序列的寡核苷酸探针，与待测DNA样品进行杂交，寻找靶DNA链上的互补序列，形成完全互补的双链，根据杂交情况排列出样品的序列信息。目前SBH技术用于同源序列的比较测定、点突变的检测已日趋成熟。SBH作为一种快速、自动化的测序方法，相信未来几年中会有迅速发展，在今后的大规模测序以及分子生物学和基因诊断中发挥重要的作用。⑥质谱法中发展较快的是基体协助激光解析离子化(MALDI)一时问飞行质谱法用来检测双脱氧循环产生的DNA片段的序列，相关的延迟离子抽提技术(delayedionexlraclion，DE—MALDI)，可提高MALDl分析精度，还有MALDI一’FOF’DNA测序方法。这一类技术提供了一种新的非凝胶碱基DNA测序方法，最终有可能比传统的方法学更加快速，并为将来的大规模质谱DNA测序提供了可能。⑥原子探针显微镜、扫描隧道显微镜(sTM)和原子力显微镜(AFM)新技术的发展，使快速、高分辨直接观测DNA分子构象成为可能。流动式单分子荧光检测法也在发展中。3．荧光原位杂交原位杂交(ISI{，insituhybr·idization)，是一种在保持组织、细胞或染色体原有形态结构的基础上，对其内部特殊核苷酸顺序进行检测及定位的分子生物学手段，可用于染色体畸变分析。其原理是将已标记或经特殊修饰的核酸探针与已固定的组织、细胞或染色体中的DNA、RNA杂交，继而通过分析标记探针在被检对象中的显示状况而达到对特殊目标顺序进行检测、定位的目的：用放射性同位素标记探针和放射自显影曾一度作为惟一、高度敏感的IsH手段。近年来，利用化学修饰合成核苷酸(如dig—uTP，duTP及ddUTF。等)，并将这些核苷酸掺入可与被检目标序列杂交的RNA、DNA或寡核苷酸片段中，杂交后通过荧光法、酶沉淀法或发色团检测来鉴定目标序列是否存在及其位置。荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FIsH)是目前最常用的ISH手段之一。(1)荧光原位杂交的原理和特点荧光原位杂交的基本原理为：只要两个核酸分子的碱基序列互补，就可在适宜条件下形成稳定的杂交分子。FISH就是利用这一原理将标记探针同组织、细胞核或染色体DNA进行杂交，在下改变其结构和分布格局的情况下进行细胞内DNA、RNA某特定序列的测定。FISI-I可用于染色体精细结构分析，非整倍体检测，中期、间期细胞染色体数目分析，微核来源鉴定及精子非整倍唪检测。荧光原位杂交技术具有操作及观察分析简便、立体分辨率高、信号明亮清晰以及安全风险性小等优点。此外，利用不同荧光物质所修饰的核苷酸标记不同探针，可在同一样品中同时识别和分析多个目标顺序。特别是20世纪90年代发展起来的多色FISH计术，在同一细胞核或中期染色体中显示出不同的颜色，从而可同时检测2种以上DNA的二维结构，制备出染色体的光谱核型，使全染色体的自动化分析得以实现，大大拓宽了F[SH的应用范围。而20世纪90年代出现的DNAfibre。一FISH，除显著提高了FISH的空间分辨率外，也使FlsH灵敏度进一步提高。(2)荧光原位杂交技术一般程序一般包括探针制备、组织或细胞的处理、杂交以及信号的显示与分析。其流程如下：DNA探针标记(利用化学修饰合成的核苷酸进行缺口平移、随机引物或PcR扩增标记) 已经固定的组织、细胞或染色体与探针的变性处理D37qC湿盒内杂交2～72h荧光显微镜下直接检测杂交信号(探针上的信号分子可被激发荧光)以荧光标记抗体与探针信号分子结合D荧光显微镜下观察杂交信号具体操作步骤包括：①制备和标记探针在遗传毒理学研究中一般用DNA探针。目前识别畸变的FIsH探针大致可分为染色体序列探针、由许多DNA大片段组成的全染色体探针和着丝点探针。现在主要通过质粒重组、PcR扩增和人工合成等3种途径制备探针。常用的探针信号标记方法有2种：①直接标记法。将荧光分子直接标记于探针DNA／RNA上，杂交后可直接在荧光显微镜下检测，这种方式快速简捷，背景干扰很少，但杂交信号较弱，且不能进一步放大，目前已较少采用；②间接标记法。采用一个中间分子标记探针，杂交后再用生物素或地高辛等荧光分子标记的中间分子的亲和物或抗体进行检测。②染色体原位杂交杂交前变性处理染色体标本，使染色体DNA变为部分单链，并去掉附着的RNA及蛋白质，变性处理生物素或地高辛修饰的探针。变性常用加热或碱变性，变性的温度和时间随探针和组织类型的不同而变化，目的是为了保存组织的完整性和最大的杂交效率。变性后的探针与变性后的染色体单链DNA在适合的温度、盐浓度等条件下复性杂交成双链。此后，经一系列洗涤，将标本中未结合的探针或非特异性杂交的探针全部洗净。③荧光检测清洗后的标本用荧光标记的试剂进行检测，对生物素标记的探针一般用荧光标记的卵白素检测，而其他中间分子，主要采用荧光标记的相应抗体来检测。常用的荧光标记分子有AMCA(蓝光)、异硫氰荧光素(绿光)、罗丹明(红光)、德州红(深红)等。④染色体显带通常在杂交后显带，如先进行常规显带，再进行FISH会明显降低杂交信号的检出率。常用的显带方法包括：Actinomycin／DAPI显示G带、经溴脲嘧啶处理后再由Hoechest显示R带。或采用Alu或Line重复序列与探针同时进行杂交，亦可得出显示G带或R带的效果。⑤荧光显微镜检测荧光染料受到特定波长的光波激发便会在其所排布的位置上发光。此时选择合适的滤色镜，可在同一分裂相上观察到不同颜色的标记物。荧光镜检时显微镜的质量及滤片的选择至关重要，特别是滤片系统，应严格按照相应荧光分子的荧光激发／发射光波长，选择最适的激发／阻挡滤片组合。摄影记录系统由于固态电荷耦联扫描装置及图像分析仪的应用，可以使背景着色很大程度地减低。应用激光共轭聚焦显微镜，可通过对染色片标本的不同平面进行断层扫描，并将得到的结果经计算机处理，获得高质量的图像结果。4．基因差异分析分子生物学的许多杂交、扩增技术都依赖于特定的探针或引物，才可检测到基因改变的情况。而某一基因的探针或引物的设计是在对该基因序列有一定了解的前提下进行的。对于未知序列的分析，此类方法往往无用武之地。各种化学毒物和环境危害因素引起的基因改变或新基因的出现大多是未知的。对于此类基因的分析更多应用的是差异分析技术。目前应用较多的是mRNA差异显示法以及新近发展的cDNA代表性差异分析法。(1)mRNA差异显示法IJiang和Pardee等于1992年最早报道了差别显示法(DDRT—PCR，mRNAdifferentialdis—play)。其一般原理是，对mRNA进行反转录合成cDNA，在此基础上对每一类cDNA的PCR选择性扩增产物进行凝胶电泳分析，寻找差异片段。该方法主要由以下三部分组成：①用3’②用3，锚定引物及若干数量一定长度的5’随机引物对逆转录后的cDNA进③用测序胶分离PCR扩增后的cDNA片段，得出的差异片段在相同条件下再进行PCR扩增、分离、纯化、克隆和测序，即可得到差异片段的序列。差别显示技术的不足之处主要是高频率的假阳性，有时甚至高达70％以上。为了消除假阳性，应严格设置对照。Sompayrac(1995)曾提出一些降低假阳性的策略。近几年来随着此项技术的应用日益广泛，其方法也在不断改进之中。(2)cDNA代表性差异分析法1994年Hubank等建立cDNA代表性差异分析(cDNA—RDA，cDNArepresentationaldiffer。。。。。．d。。lv。i。)。该技术的基本原理是将差减杂交与PCR有机结合，利用双链DNA为模板时可通过PCR呈指数扩增，而单链DNA为模板时呈线性扩增的原理，首先制备cDNA并用限制性内切酶消化成平均长度为256bp的cDNA片段，随后利用PCR技术使cDNA片段得以富集。接着连续进行3次差减杂交，最后再利用PCR技术富集特异表达基因。差减杂交法的工作过程是：从基因表达特异的组织中提取mRNA，反转录为cDNA，然后与基因无特异表达的组织中提取的mRNA过量杂交，在基因特异表达的组织与基因无特异表达的组织中均表达的基因产物形成了cDNA／mRNA双链杂交分子，而特异mRNA转录的cDNA仍保持单链状态，将这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。由于。DNA—RDA能发现与表型相关的基因异常，并能随基因表达的时效性不同而分离出表达差异的基因，从而对基因的结构和功能有更多的了解。与mRNA差异显示法相比，由于RDA进行了消减杂交，从而大大地减少了mRNA差异显示中易于出现的假阳件结果。同时，由于消减富集和PCR动力学富集的特点，可使mRNA差异显示法中难以显示的稀有mRNA的cDNA得以富集并予筛选和克隆。在毒理学领域，基因差异分析用于寻找外源化合物或环境诱导基因的研究才刚刚开始，但由于其在寻找未知新基因方面的独特优势，必将为分子毒理学的深入研究做出贡献。5．基因芯片检测基因芯片(genechip)，又称DNA芯片。基因芯片技术是新近出现的将计算机科学、核技术、物理学、数学等学科的多种理论和技术有机结合而发展起来的具有划时代意义的新的基因分析方法。它将成千上万个寡核苷酸固定在厘米大小的硅片上，将待测的材料用荧光素或核素标记，在基因芯片上与探针杂交，通过激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描获取杂交探针的荧光信号。其制作方法包括：原位合成法(insitusy。nthesis)、离片合成法(offchipsynthesis)及大规模的cDNA微排列。基因芯片的突出特点是可准确地确定突变位点及突变类型，尤其是可以同时检测成千上万个基因乃至整个基因组的所有突变。它将核酸样品制备、核酸扩增和定性定量检测等一系列繁复的过程连续化和微型化，使其高度集中在一块数英寸大的固相支持物上，可用于DNA测序、转录情况分析、基因诊断与基因药物分析设计、突变及多态性检测遗传作图等方面的研究。二、有害微生物的PCR检测PcR(I)olyITleIas~jchainreaction)即聚合酶链式反应，是20世纪80年代发展起来的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法，也称为无细胞克隆系统。它可以在试管中建立反应，数小时后能将极其微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，并且无须通过烦琐费时的基因克隆程序便可以获得足够数量的精确的DNA。随着人们对食品安全性要求的不断提高，PcR技术以其特异性强、灵敏度高和快速准确等优点在食品有害微生物检测领域得到广泛的应用。1．PCR的技术原理根据已知的待扩增DNA片段序列，人工合成与该DNA两条链末端互补的两段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增，这种方法也就是PcR技术。扩增过程中高温变性(denaturation)、低温退火(annealing)和适温延伸(extension)等3步反应作为一个周期，反复循环，从而达到迅速扩增特异性DNA的目的。高温变性是在体外将含有需扩增目的基因的模板双链DNA经高温处理，分解成单链模板；低温退火降低反应系统温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物与目的DNA互补结合，形成部分双链；适温延伸是将反应循环系统的温度调至适温，在TaqDNA聚合酶的作用下，有4种核苷酸存在时，引物链将沿着5’一3’方向延伸，形成与模板互补的新链，新链又可作为下一次反应的模板，如此周而复始使目的基因的数量呈几何级数扩增。在扩增初期，目的DNA分子呈几何级数2“(n为循环次数)增加，随着循环次数增加，模板DNA不断增加和酶分子的消耗，扩增效率下降，DNA分子呈线性(1+x)”增加(x为DNA分子实际增长率)，经过20～30次循环，单一拷贝的基因可扩增10‘～2×10PcR技术检测的主要步骤为：①运用化学手段对目标DNA提取；②设计并合成引物，引物设计与合成的好坏直接决定PcR扩增的成效，通常要求引物位于待分析基因组中的高度保守区域，长度为15～30个碱基为宜；③进行PCR扩增；④克隆并筛选鉴定PcR产物，将扩增产物进行电泳、染色，在紫外光照射下可见扩增特异区段的DNA带，根据该带的不同即可鉴定不同的DNA；⑤DNA序列分析，不同的对象如扩增DNA片断序列全知、半知或未知，其PcR参数、退火温度、时间、引物等都有较大的差别，将限制片长多态性(RELP，。restrictionfragment，lengthpoly-一morphysm)、序列测定(Sequenc~：)、反转录PcR(RT—PCR)等技术相结合，形成了众多的衍生技术，如巢式PCR(nestedPCR)、定量PCR(quantitatjveP(：R)、竞争PCR(competitiveP(：R)、单链构型多态性PcR(SS(：P—PcR)等。这些技术的产生将使PcR技术在食品中的应用潜力更加广泛。2．PCR在食品有害微生物检测方面的应用在食品有害微生物检测方面，PcR常用于鉴定某些人工培养困难、不能活体检查或分离困难且菌数较少的细菌疾病的检测。PcR用于DNA病毒的检测一般无需提取DNA，可直接取少量样品，煮沸变性后进行PcR测定。PcR用于RNA病毒的检测，必须提纯病毒RNA，在PcR扩增前需转录成cDNA，再加入与cDNA互补的另一引物，用PcR扩增出嵌合分子即逆转录PCR(RT—PCR)。传统方法检测食品中致病菌的步骤烦琐费时，需经富集培养、分离培养、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程，并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测。而应用PcR技术，只需数小时就可以电泳法检测出0．1mgDNA中仅含数个拷贝的模板序列。用PcR扩增细菌中保守的rDNA片段，还可对那些人工无法培养的微生物进行检测。用PcR检测食品中的致病菌，首先要富集细菌细胞，通常经离心沉淀、滤膜过滤等方法可从样品中获得细菌细胞，然后裂解细胞，使细胞中的DNA释放，纯化后经PCR扩增细胞靶DNA的特异性序列，最后用电泳法或特异性核酸探针检测扩增的DNA序列。对于食品体系的微生物检测，通常可采用预增菌培养程序，既增加了目标微生物的量，又去除了食品体系中存在的抑制因子，大大提高了检出率。．(1)检测单核细胞增生李斯特菌单核细胞增生李斯特菌是食品卫生中的重要病原菌，多通过食品经口感染，被列为20世纪90年代食品中的4大病原菌之一。有关单核细胞增生李斯特菌污染乳制品、肉、禽、蔬菜的研究国内外均有报道。该菌可诱发食物中毒，导致李斯特菌病，主要引起人类脑膜炎、菌血症等，发病率虽低，死亡率却高达30％～70％。在食品李氏杆菌的检测中，过去一直缺乏简单快速的分离鉴定技术，传统方法从食品中分离、鉴定该菌约需1～2周才能得出结果，免疫学方法和基因探针已用于该菌的快速检测，但前者可达到属水平的特异性，后者敏感性差。PcR技术的引入可使检测过程大为缩短。李氏溶血素0基因与内化素基因是单核细胞增生李斯特菌最主要的致病因子与侵袭因子，针对其毒力基因可设计特异性高的引物，快速扩增。有报道对食品中李氏杆菌的溶血0基因进行PcR扩增，结果可在12h内完成整个检测过程，对食品样品中李氏杆菌的检测限可达5～50个细菌。(2)检测金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌是各种类型感染和食物中毒的病原菌，能在食物内增殖并产生体外毒素——肠毒素、内毒素——中毒休克综合症毒素和脱皮毒素。目前金黄色葡萄球菌肠毒素D的鉴定主要依赖于免疫学技术，该技术需要细菌纯培养和制备肠毒素，实验周期长、步骤繁多，使其在食品卫生学鉴定时受到限制。近年来PCR技术的发展为食品病原微生物的鉴定提供了新的途径。(3)检测沙门菌沙门菌是一种人畜共患的传染性病原菌，近年来，对沙门菌快速诊断的方法已有了很大进展，如应用ELlsA法、EIA技术、间接血凝抑制试验、HRP—SPA染色法和PcR技术等。PCR技术由于具备高度特异、灵敏和快速的特点，已引起越来越广泛的重视。(4)柃测致病性大肠杆菌肠毒素大肠杆菌是弓I起婴幼儿和幼畜腹泻的主要病原菌之一。该菌可产生2种肠毒素：热敏性肠毒素和耐热性肠毒素，它们均能引起肠黏膜细胞水与电解质的代解紊乱并导致腹泻。肠毒素大肠杆菌引起的腹泻主要是食入了被该菌污染的食品所致。PCR技术为临床和实验室提供了一个更为快速灵敏的检测手段。(5)检测志贺氏菌该菌的致病性主要由其质粒决定，而传统方法的选择性富集培养易丢失质粒。PcR技术克服了这一缺。PCR扩增及凝胶电泳分析检测中心质粒DNA的分离，可在6～7h完成，而从抽样到最后出结果也不到1天时间。(6)检测肉毒梭状芽孢杆菌肉毒梭状芽孢杆菌产生的肉毒神经毒素，在天然物质中毒力最强。依据抗原性不同，肉毒毒素分为A，B，C，D，E，F和G7型，分别由A～G型肉毒梭菌(clostridiumb。tulinum)产生，其中A，B,E和F型能引起人类肉毒中毒，致死率很高。肉毒梭菌一直缺乏有效的快速检测方法，用常规方法从食物中分离鉴定出肉毒梭菌至少需要4d，不能达到快速监测食品的目的。经设计引物扩增持异片段，实现了对食品中肉毒梭菌的快速、敏感、特异性地检测。3．存在的问题及展望PCR技术虽为一种快速、特异、灵敏、简便、高效的检测新技术，但其在食品中致毒、致病性微生物检测的实际应用中也存在不少问题，必须认真分析各种具体情况，采取必要的措施，以提高反应的特异性和敏感性，避免假阳性或假阴性结果。(1)污染问题。PCR是一种极为灵敏的反应，一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果，所以在操作时必须加以注意。(2)假阳性问题。食品是复杂的反应基质，影响PCR反应的因素很多，如果不能有效排除各影响因素的干扰，很可能出现假阴性结果。此外，如果在PCR操作过程中各种实验条件控制不当，很容易导致产物突变，也会导致假阴性结果。对于这些问题必须有充分的考虑和排除措施。(3)引物设计及靶序列选择。引物的设计及靶序列的选择是决定PCR结果的关键因素，引物不同则扩增物不同，如果引物的设计不当，则直接影响对关键靶序列的选择，降低PCR检测的灵敏度和特异性，甚至完全失败。因而必须对扩增序列有充分的了解，并规范PCR实验室操作计术。(4)模板DNA的制备方法。肉类等食品增菌液中含有的油脂等杂质可抑制Taq酶活性，影响PCR反应的正常进行。如用煮沸裂解法直接制备DNA模板，油脂等杂质难以除去，会影响检测结果。因此，必须采用适当的模板DNA制备方法。有研究发现，采用快速裂解吸附法制备DNA模板，经过2次清洗步骤可有效去除杂质，反应干扰小，稳定性好，所获得的模板可保存较长时间。(5)灵敏度问题。食品的成分极为复杂，其中许多成分都对PCR反应产生干扰作用，从而降低PCR检测的灵敏性。为了提高检测的灵敏度，在PCR扩增前往往需要进行增菌培养。如果不进行增菌培养而直接对样品进行检测，其检出限可相差5个数量级。结合PCR技术与免疫磁性分离技术建立的MIPA方法，可不经增菌程序，提高可利用模板数量，去除食品成分干扰，达到较好的检测灵敏度。(6)检测效果。PCR方法只能检测微生物的存在与否，而不能检测微生物产生的毒素，因而PcR技术用于致毒性微生物污染的食品的安全性检测方面，尚存在两个问题。其一，致毒性微生物检测结果为阴性的食品并不能排除存在毒素的可能，因此检测结果为阴性的食品并不一定是食用安全的食品；其二，致毒性微生物检测结果为阳性的食品中不一定都含有微生物毒素。对前一种情况，PcR检测不具诊断价值，需用小鼠致死试验或免疫学方法检测毒素。对后一种情况，PcR检测具有参考价值，因为食品中存在引起食物中毒的潜在因素。这表明，对于致毒性微生物安全性的检测，不能仅以PcR的检测结果为依据，还需要结合对毒素物质的检测结果进行综合判断。尽管PcR技术在食品的微生物安全性检测方面还存在着一些问题，但相信随着研究的深入，这项技术必将得以完善，并迅速成为可以信赖的快速检测手段。三、转基因食品PCR检测自1983年世界上试验成功第一棵转基因植物以来，以转基因技术为核心的现代生物技术迅猛发展。近年来，利用重组DNA技术研究开发的转基因食品快速发展，有些商品已经被批准商业化，并且开始进入普通消费者的餐桌。尽管多数学者认为转基因食品是安全的，但在过敏性、毒性、致癌性、食品营养品质改变以及环境等方面，仍存在不少争议。目前，对转基因食品各国普遍的态度是：对相关食品必须给消费者真实而明确的信息，大多数国家要求对转基因食品进行标识。挪威是世界上第一个要求对转基因食品进行标识的国家，规定转基因成分的标识限量为2％，欧盟和日本分别为1％和5％。我国政府规定，凡是列入标识管理目录并用于销售的农业转基因生物，应当进行标识；未标识和不按规定标识的，不得进口和销售。因此必须对转基因食品进行有效的检测。从转基因技术建立之日起，转基因检测技术亦随之建立。目前主要有两类转基因检测方法：基于特异性DNA片段的PCR检测技术和基于特异性蛋白的EuSA(enzyme：一linkedimmunosor—bentassays)检测方法。两种方法的出发点不同，各有优缺点。ELIsA分析法检测的特异性蛋白主要是外源目的蛋白和一些报告基因所表达的蛋白，尤其适用于无需加工的原料性食品，但对于加工品则有局限性。因为重组基因产物会因加工(特别是高温)处理而失活、分解或消失而使检测的不确定性增加，假阴性率增高。PcR法检测特异性DNA片段包括外源启动子、终止子、报告基因和目的基因。PcR法也不完全适用，因为核酸也会被降解，但其灵敏度高、适用范围最广，目前仍是对转基因食品最常用的检测方法。转基因食品(GM0，geneticallymodif'iedorganism)的PcR检测分成三个层次：首先要求检测出是否含有转入的外源基因，判断是否为转基因产品，即定性检测。一旦确定为转基因产品后，需要进一步明确两个问题，首先要确定是哪种转基因产品，特别是要确认是否为已批准的转基因产品，即要进行转基因产品品系的检测鉴定；鉴定了转基因产品品系，并确认为已批难的转基因产品后，往往还要检测出其中转基因产品的含量，以明确是否达到需标识的含量(阈值)，即需要进行定量检测。目前，对转基因食品的检测主要有以下几种PcR方法。1．定性PCR技术由于定性PCR所需设备简单，试剂也相对便宜，因此