大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化-实验报告

分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxxPAGEPAGE4大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化引言DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得[1]材料和方法实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation，才能将其导入感受态细胞（competentDNA的目的。进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calciumchloridDNA进入细菌细胞内。105-108μgDNA中成功DNA而这24°C105-107之间。转化（transformation）DNA域的基本实验技术。EcoliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受pMD18-T载体共保温，实现转化。pMD18-T载体是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体。这种载体是由pUC18pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和Sal点之间插入了EcoREcoR3'"T"而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3'添加一个"A"的特性，所以使用这两种制品可以大大提高PCR隆效率。β-半乳糖苷酶基因146MCSβ-半乳糖苷酶的氨基β-C端部分序列的宿主细基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带α-α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTGX-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免图1pMD18-TVector的克隆位点图α-37℃12-16hr1pMD18-T载体的克隆位点图图1pMD18-TVector的克隆位点图实验材料仪器所用仪器有超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、恒温水浴器、制冰机等。器皿所用器皿有移液枪10ul1000ul）、枪头盒（蓝、黄）、枪头（黄）1.5ml250ml锥形瓶、酒精灯、浮子等。试剂所用试剂有0.1mol/LCaCl2溶液，购买的感受态细胞，LB液体培养基，LB固体培养基，氨苄青霉素（Amp），X-gal，IPTG等。实验方法从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于50mlLB37℃振荡培养过夜（16小时）2.0ml100mlLB液体培养基锥形瓶中,37℃振荡培养2-3h。(此时,OD600<=0.5,细胞数务必<108/ml,1.5ml30min。在低温离心机中于4℃离心10min(4000rpm1min以便培养液流尽。用冰冷的0.1mol/LCaCl2700μl悬浮沉淀,立即放在冰上保温30min44000rpm10min，回收细胞。用冰冷的0.1mol/LCaCl2300μl悬（务必放冰上）200μl20μl已购买的感受DNA2μl（50ng）30min421-2min（90秒）2min800μlLB温摇床于37℃培养1h100ml60100l的IPTG200l的X-Gal100l的AmpIPTX-Ga、Amp平板培养基。将适当体积已转化的感受态细胞，涂在含有X-galIPTGLB3712-16h察并记录结果。结果X-galIPTGLB24h，长出6个白色菌落，无蓝色菌落生长；购买的感受态细胞与质粒结合后经培养24h81mm，呈白讨论对实验结果的分析及结论也可以进一步说明连接那一步做得很成功。的质粒偏少。两板平皿所得菌落分别是6、8，有些偏少，说明在转化的时候可能没有控制好条件致使有些质粒没有进入感受态细胞。两板平皿菌落分布均匀说明菌液涂布得很均匀。感受态细胞制备及转化中的影响因素细胞的生长状态和密度最好从-70℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞5×107OD600控制。DNA的质量和浓度DNADNA的浓度在一DNA5%，1ngDNA50ul低。此外，重组DNA10~100倍。试剂的质量化合物及无机离子的影响：所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于4℃。在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高。DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的制剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。大肠杆菌感受态细胞其他的制备方法其他方法还有以下几种：Glycerin-PEG（甘油-聚乙二醇法）常规氯化钙法制备的感受态细胞维持其感受态时间往往较短，而甘油-聚乙二醇法较常规氯化钙法为优，转化结果显示：在-30℃条件下其感受态维持时间180d以上。这可能与该细胞储存液中含有一定浓度的甘油和葡萄糖等保DNA粒转化。氯化铷法制备方法。一步制备法此种方法的特点是只加一种试剂即可，且不需要另加保护剂就可直接冻存，转化时不需要热激。但一步法对实验操作要求较高，如所用器具一定要清洁，OD600值不要高于0.6，制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作等。其转化效率相对较低，适用于对转化率要求不高的实验[3]。注意事项台中进行，以防污染。衡量受体菌生长情况的OD600值和细胞数之间的关系随菌株的不同而不同，因此，不同菌株的合适OD600值是不同的。悬浮菌体时不要剧烈推打